Abstract
Tissue hemmer av metalloproteinase-4 (TIMP-4) er medlem av ekstracellulære matrix (ECM) metalloproteinaser hemmere som har pleiotrope funksjoner. Imidlertid er TIMP-4 roller i karsinogenese ikke godt forstått. Celleviabilitet og strømningscytometer analyser ble anvendt for å vurdere celledøds forskjeller mellom H-vektor og H-TIMP-4-cellelinjer. Immunobloting og semikvantitativ RT-PCR ble benyttet for å vurdere ekspresjonen av apoptose-regulatorer. Vi viste at TIMP-4 har apoptose-sensibiliserende effekter mot flere døds stimuli. I samsvar med disse funnene, ble regulatorer av apoptose fra hemmere av apoptose Proteins (IAP), FLICE-lignende inhibitor proteiner (FLIP) og BCL-2 familiemedlemmer modulert av TIMP-4. I tillegg TIMP-4 knockdown resulterte i celleoverlevelse økning etter serum savn, som vurdert av klonogene celleanalyser. Denne rapporten viser at TIMP-4 regulerer kreftutvikling gjennom apoptose aktivering i livmorhalskreftceller. Forstå TIMP-4 virkninger i tumorigenesis kan gi ledetråder til fremtidige behandlinger
Citation. Lizarraga F, Ceballos-Cancino G, Espinosa M, Vazquez-Santillan K, Maldonado V, Melendez-Zajgla J (2015) Tissue Inhibitor av Metalloproteinase-4 utløser apoptose i livmorhalskreft celler. PLoS ONE 10 (8): e0135929. doi: 10,1371 /journal.pone.0135929
Redaktør: Qing-Xiang Amy Sang, Florida State University, USA
mottatt: 05.02.2015; Godkjent: 28 juli 2015; Publisert: 20 august 2015
Copyright: © 2015 Lizarraga et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Grants 1616519, 87855, conacyt.mx. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
apoptose representerer en konservert type celledød som er deregulert i kreft. To hovedsignalveier utløse apoptose i pattedyrceller [1]. Den ytre vei forbinder de ytre døds stimuli inn i intracellulær apoptotiske maskineriet. Stimuleringen av celledød reseptorer ved døds ligander utløser dannelsen av dødsinduserende aliserte kompleks (DISC) [2]. Først, ved den cytoplasmatiske side av TNFR1, dannelse av et proteinkompleks bestående av Tradd, TRAF2, CIAP-1 og RIP-kinase finner sted, kalt kompleks I. Dette komplekset deretter rekrutterer og aktiverer IKK kinaser som i sin tur fosforylerer IkB-inhibitorer og tillate NFkB-indusert celle overlevelse. Deretter kan Tradd dissosierer fra TNFR1, noe som fører til dannelsen av komplekset II gjennom binding av FADD og caspase-8 endelig utløser celledød. I denne modellen Complex I eller Complex II aktivisering avhenger FLIP (FLICE lignende hemmer proteiner) [3]. På den annen side, det er den intrinsiske vei, hvor apoptotiske stimuli utløse frigjøring av mitokondrielle intermembranrommet proteiner (som cytokrom c) inn i cytosol. Cytokrom c fremmer aktivering av kaspaser ved dannelse av et proteinkompleks bestående av cytokrom c, Apaf-1, og caspase-9, som fører til aktivering av en caspase kaskade. Apoptose er strengt kontrollert av et antall av modulatorer på ulike nivåer. Blant de viktigste regulatorer er død reseptor pathway inhibitor cFLIP (mobil FLIP), det hemmer apoptose Protein (IAP) familie, og BCL-2 familiemedlemmer [4].
TIMP familien består av fire pleiotropisk proteiner som modulerer aktivitet av matriks-metalloproteinaser (MMP) [5]. Som sådan har TIMPs vært assosiert med kreftutvikling; Men disse proteinene viser forskjellige og noen ganger motstridende roller i cellulære prosesser som MMP-aktivering, apoptose, celleproliferasjon og invasjon [6]. TIMP-4 øket ekspresjon er assosiert med human mammary carcinoma [7], endometrialt karsinom [8], og magekreft [9], mens dens ekspresjon er redusert i humane gliomer [10] og i Wilms» tumorer [11]. Vår tidligere arbeid viste at TIMP-4 er uttrykt
de novo
i livmorhalskreft med økte nivåer i mer avanserte stadier [12]. Disse data antyder en kompleks deltakelse av TIMP-4 i kreftutvikling.
Celledød motstand oppstår som følge av ubalanse mellom pro- og anti-apoptotiske faktorer som til slutt svare til akkumulering av DNA-mutasjoner og bestemme responsen av tumorceller til terapi [13]. TIMPs er kjente regulatorer av apoptose i kreftceller [6]. TIMP-3 virker som en potent induser av celledød i kreftcellene, hovedsakelig ved å fremme stabiliseringen av død-reseptorer [14]. I motsetning til dette, TIMP-1 og TIMP-2 har en beskyttende effekt mot apoptose indusert ved forskjellige stimuli [15]. Videre kan TIMP-4 induserer apoptose i vaskulære glattceller [16] og transformerte hjertearytmier fibroblaster [17], men paradoksalt nok denne faktoren har også vist seg å beskytte brystcancer-celler fra apoptose [7], noe som tyder på en vev-spesifikk virkning . Imidlertid har ingen mekanisme for virkningen av TIMP-4 på celledøds blitt beskrevet.
I den foreliggende rapport, observerte vi at TIMP-4 oppregulering sensitizes cervikale kreftcellene til apoptose via modulering av apoptotiske proteiner fra IAP, FLIP og BCL-2 familier. Disse funnene viser nye terapeutiske mål i livmorhalskreft som tar hensyn til de multifunksjonelle egenskaper TIMPs.
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
hrTIMP-4 (nr 974 -tsf) og TNF-α (210-TA) var fra R forstand: 5 «GCGGAAGCTTCCCAGCATGCCTGGGAGCCCTCGGCCC 3» og antisense: 5 «CTCCCGAATTCGGCTGAACGATGTCAACAAACTCTTTCC 3». Dette fragment ble klonet inn i pLXSN vektor (CLONTECH, Mountain View, CA, USA). Den nye vektor ble betegnet pLXSN-TIMP-4.
livmorhalskreft HeLa-cellelinjen ble transfektert med pLXSN og pLXSN-TIMP-4 og valgt med 800 ug /ml G418 i 4 uker for å skape stabile cellelinjer. Cellelinjene blir heretter kalt H-Vector (pLXSN) og H-TIMP-4 (pLXSN-TIMP-4) og ble dyrket i DMEM. Livmorhalskreft cellelinje CasKi ble dyrket i DMEM.
Drug følsomhet
2×10
4 H-Vector og H-TIMP-4 celler ble sådd i 24-brønns kammer retter. Etter 24 timer ble cellene vasket med medium uten FBS (føtalt bovint serum) og inkubert med TNF-α (10 ng /ml, Sigma-Aldrich, nr T6674) eller TRAIL (20 ng /ml, R 0,05.
Resultater
TIMP-4 sensitizes livmorhalskreftceller til apoptotisk celledød
Tidligere arbeid har vist at TIMP-4 regulerer negativt veksten av ulike kreftceller [11 , 16, 17]. For å analysere om TIMP-4 regulerer også celledød i livmorhalskreftceller, vi generert et HeLa cellelinje som stabilt overuttrykker TIMP-4 (Fig 1A, heretter kalt H-TIMP-4) og kontroll cellelinje (heretter kalt H-Vector) . Vi har studert effekten av serum sult på H-vektor og H-TIMP-4-cellelinjer. Selv om ingen forskjeller ble observert i antallet celler som dyrkes i 8% serum-supplert medium, ble færre H-TIMP-4-celler observert når serum var fraværende fra mediet (figur 1B). Neste, for å teste om disse effektene ble begrenset til vekstfaktor sult, vi evaluert celledød faktorer fra TNF-familien også. Ved eksponering til døden ligander TNF-α og TRAIL, var det færre levedyktige H-TIMP-4-celler enn H-Vector celler (figur 1C). For ytterligere å bekrefte disse resultatene, ble villtype HeLa-celler behandlet med hrTIMP-4 i nærvær eller fravær av TNF-α og TRAIL. Vi har funnet at eksponering for hrTIMP-4 alene redusert HeLa cellelevedyktigheten og forsterkes effekten av TRAIL og TNF-α (figur 1D og 1E, henholdsvis).
A, TIMP-4-ekspresjon analyse ved hjelp av RT-PCR i H-vektor og H-TIMP-4-celler. B viser Grafen til H-Vector og H-TIMP-4 Celleviabilitet prosenter følgende vekst med FBS (8%) eller uten FBS (0%) i 5 dager. C, viser Grafen til H-Vector og H-TIMP-4 Celleviabilitet prosenter etter TNF-α (20 ng /ml, 48 h) og TRAIL (20 ng /ml, 7 h) behandling. D, Den grafen viser HeLa celle levedyktighet analysert etter hrTIMP-4 (10 nM, 48 h) og TRAIL (20 ng /ml, 7 h) eksponering. E, viser Grafen i HeLa-celler levedyktighet etter en 48 timers preinkubasjon periode med hrTIMP-4 (10 nM), etterfulgt av TNF-α (20 ng /ml, 48 timer) stimulering. Stjernene viser betydelige forskjeller med verdier av p = 0,03 i A, p = 0,006 i C og p = 0,003 i D og E.
H-TIMP-fire cellelinje presenterte også et større antall apoptotiske legemer (fig 2A). For å utforske denne type celledød i detalj, analyserte vi den translokasjon av fosfatidylserin fra den indre til den ytre side av plasmamembranen (tidlig apoptose markør) ved flow-cytometri etter serum sult og TNF-α behandling. Vi har oppdaget at en større andel av H-TIMP-4-celler som var positive for ytre plasmamembran fosfatidylserin sammenlignet med H-vektor-celler (tabell 1).
A, H-vektor og H-TIMP-4-cellelinjer ble inkubert med eller uten TRAIL (20 ng /ml, 7 timer). Cellene ble observert ved lysfelt-mikroskopi. B, caspase-9 aktivering og PARP cleavage fragmenter ble undersøkt av vestlige blotter av H-Vector og H-TIMP-4 celle proteinekstrakter ved FBS sult. P-Actin immunoblotting ble brukt som lasting kontroll. C, Caspase-8 og caspase-3-spalting ble analysert ved hjelp av western blot i H-vektor og H-TIMP-4-celler ved TNF-α behandling. Coomassie gel farging ble ansatt som lasting kontroll. D viser Grafen levedyktighet prosenter av CasKi celler dyrket med FBS 3% for 6 dager sammen med eller uten hrTIMP-4 (10 nM) (Stjernene viser betydelige forskjeller med verdier av p = 0,0114, un-paret t-test med Welch korreksjon ).
TIMP-fire knockdown øker overlevelsen av HeLa celler
for å validere våre tidligere data, ble to TIMP-4-spesifikke shRNAs ansatt for å hemme uttrykket i HeLa celler. Den beste TIMP-4 knockdown i HeLa-celler ble oppnådd ved en pool av de to TIMP-4-spesifikk shRNAs (42% inhibering sammenlignet med kontroll H-Luc-celler, som bestemt ved qPCR). Bemerkelsesverdig, ble celleoverlevelse øket i H-PS-TIMP-4-celler sammenlignet med H-Luc kontrollceller etter 7 dager med FBS sult (S1 Fig).
TIMP-4 modulerer caspaseaktivering
Fordi en kaskade av caspases er ansvarlig for gjennomføring av apoptotisk celledød, evaluert vi caspaseaktivering av western blotting. Som vist i figur 2B, har vi funnet at serum sult indusert spaltning av caspase-9 i H-kontroll og H-TIMP-4-celler. I tillegg observerte vi spalting av PARP, er en vanlig brukt caspaseaktivering markør. Høyere mengder av spaltede kaspase-3 og kaspase-8, som er ansvarlig for transduksjon veien etter bindingen av død reseptoren, ble funnet i H-TIMP-4-celler behandlet med TNF-α (figur 2C). I tillegg er effekten av TIMP-4 ble ikke begrenset til HeLa cellelinjen, siden eksponering av celler til CaSKi hrTIMP-4 også forsterket den cytotoksiske aktivitet av serum sult (figur 2D). Disse resultatene støtter forestillingen om at TIMP-4 har apoptose-sensibiliserende effekter i livmorhalskreftceller.
TIMP-4 regulerer apoptose hemmere fra IAP, cFLIP og BCL-2 familier
Mange signaltransduksjon trasé er nødvendig for apoptose celledød. På nivået av celledød reseptorer, FLIP proteiner regulere apoptose. Interessant, ekspresjon av mRNA for FLIP isoform S var lavere i HeLa-celler etter hrTIMP-4-behandling. I samsvar med dette funnet, TIMP-4 overekspresjon hemmet isoform FLIP
S protein uttrykk til ikke målbare nivåer (fig 3A). I motsetning til dette, H-TIMP-4-celler viste høyere CIAP-1 og CIAP-2-mRNA-nivåer, mens Survivin ekspresjon ikke ble modifisert (figur 3B).
A, Akkumulering av FLIP isoformer «mRNA ble analysert ved RT -PCR i HeLa celler behandlet med hrTIMP-4 (10 nM, øvre paneler) i løpet av den angitte tiden. FLIP-proteinekspresjon ble bestemt ved immunoblotting i H-vektor og H-TIMP-4-cellelinjer (nedre paneler). B, CIAP-1, CIAP-2, og Survivin mRNA nærvær ble undersøkt ved semi-kvantitativ RT-PCR i H-vektor og H-TIMP-4-cellelinjer.
Etter aktiveringen av oppstrøms initiatorsystemer kaspaser, mitokondrier frigi flere apoptotiske faktorer i en prosess som styres av Bcl-2-protein familien [23]. Som vist i figur 4A, H-TIMP-4-celler viste lavere nivåer av BCL-2 og Mcl-1, som begge er antiapoptotic medlemmer av Bcl-2-familien. I tillegg ble høyere uttrykk av proapoptotiske proteiner Bud og Bax også observert i H-TIMP-4 celler. Disse forskjeller ble reflektert i isolerte mitokondrier, hvor en reduksjon i Bcl-2-ekspresjon i celler som overuttrykker TIMP-4 ble observert, så vel som en økning i mitokondrie-assosiert Bak (figur 4B).
Bcl-2-familien medlemmer ble evaluert ved immunoblotting i cytosol (A) og mitokondrielle (B) H-vektor og H-TIMP-4 cellelysater. Aktin og anti-Mit antistoffer ble ansatt som henholdsvis lastkontroller.
Nylig har det blitt vist at TIMP-3, en potent induktor av apoptose, fremmer død i melanom celler gjennom stabilisering av dødsreseptorer og påfølgende aktivering av deres apoptotisk-signalkaskade gjennom caspase-8 [14]. Fordi vi observerte caspase-8 spaltningsprodukter i H-TIMP-4-celler ved TNF-α stimulering (Fig 2C), vi vurdert proteinnivåer TNFRI, RII, og platekomponenter TRAF2 og Tradd. Som vist i figur 5A, vi har observert en reduksjon i TNFRI, Tradd, og TRAF2 proteinnivåer i H-TIMP-4-celler, mens TNFRII nivåene var uforandret. Til sammen viser disse resultater viste at TIMP-4 sensitizes HeLa-celler i apoptose
in vitro
ved å endre balansen av nøkkel apoptotiske aktører i støtte av celledød.
A, TIMP-4 modulerer TNFRI, TNFRII og DISC komponenter TRAF2 og Tradd. Proteiner ble oppdaget av immunoblot i H-Vector og H-TIMP-4-celler proteinekstrakter.
Diskusjoner
TIMPs er pleiotrope proteiner som modulerer celleproliferasjon, apoptose, MMP aktivitet, celle invasjon og angiogenese i løpet av tumorutvikling [6]. Imidlertid har deltakelse av TIMP-4 i kreftutvikling er undersøkt bare i noen få typer vev.
Komp dette scenariet, demonstrerer TIMP-4 også apoptose regulerende aktiviteter som er celletype-spesifikke. Mens TIMP-4 hemmer spontan apoptose [7], forsterker det også apoptose i hjerte fibroblaster og vaskulære glatte muskelceller [16, 17]. I likhet med tidligere resultater, i den nåværende forskning viste vi at TIMP-4 sensitizes livmorhalskreftceller i hjel
in vitro
.
Vi har observert påfallende evne TIMP-4 for å forbedre apoptose i livmorhalsen kreft cellelinjer etter døden ligand (TNF-α og TRAIL) behandling og serum sult. I samsvar viste vi at TIMP-fire knockdown forbedrer HeLa celler overlevelse etter serum deprivasjon. Tummalapalli
et al
., Rapporterte at TIMP-4 indusert apoptose i transformhjerte fibroblaster [17], noe som indikerer en mulig beskyttende rolle mot kreftutvikling i organer som uttrykker dette molekylet. Fordi TIMP-4 paradoksalt beskytter andre celletyper fra apoptose [7, 24] (tabell 2), kan en vev-spesifikk og en subpopulasjon effekt utledes, noe som kan være forårsaket av det komplekse forholdet av denne inhibitor med andre proteiner, slik som vist i
in vitro
studier [25].
Vår forrige rapport viste at i livmorhalskreftpasienter, TIMP-4 uttrykk økninger i mer avanserte kliniske stadier [12]. Fordi TIMP-4 kan påvirke følsomheten av kreftceller til kjemoterapi, som foreslått av vårt nåværende arbeid, vil det være attraktivt å utføre flere undersøkelser for å undersøke om pasienter som uttrykker høyere nivåer av denne inhibitor har en bedre eller dårligere prognose.
for å få mer innsikt i hvordan TIMP-4 utøver celledød kick, undersøkte vi om TIMP-4 modulert uttrykk for flere apoptose modulatorer. Faktisk, observerte vi at TIMP-4 redusert nivåene av FLIP
S, CIAP-en, CIAP-2, Bcl-2, Mcl-en, Bud, og Bak. Endringer i cIAPs ekspresjonen kan være en konsekvens av økningen i TNF-α og NFKB aktivering, som vi har funnet at TIMP-4 øker de oppløselige nivåene av denne død-reseptor-ligand (Lizarraga
et al
.,
upublisert data
).
Etter avtale med våre resultater, har tidligere arbeid vist at TIMP-4 regulerer de uttrykk for BCL-2 proteiner i en brystkreft musemodell [7]. Interessant, fant vi også at TIMP-4-overekspresjon celler aktivert caspase-8 på TNF-α behandling. Dette kunne ha vært forårsaket av merket nedregulering av FLIP
S, en isoform av FLIP familien. FLIP
S, en antiapoptotic protein med en lignende struktur caspase-8, mangler katalytisk aktivitet og således har evnen til å blokkere signaltransduksjon fra flere døds-reseptorer [26]. I tilfellet av TNF-α, bestemmer forholdet mellom FLIP og caspase-8 ved DISC cellen skjebne [3]. I denne forbindelse, observerte vi at H-TIMP-4-celler uttrykte lavere nivåer av TRAF2 og Tradd proteiner. Helt våre data tyder på at TIMP-4 modulerer DISC proteiner og FLIP ekspresjon, noe som kan resultere i økt caspase-8-aktivering og celledød [27].
Som konklusjon, viser den nåværende arbeid som TIMP-4 utviser en anti-tumorigent apoptose-sensibiliserende rolle i livmorhalskreftceller. Videre studier er nødvendig for å bestemme den faktor (er) som bestemmer balansen mellom TIMP-4 pleiotrope aktiviteter. Imidlertid kan våre funn påvirke utformingen av fremtidige terapeutiske tilnærminger som tar hensyn til de mange rollene TIMPs i kreft.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. TIMP-4-hemming øker celleoverlevelse
Grafen viser H-Luc og H-PS-TIMP-fire celle suvival prosenter etter vekst uten FBS i 7 dager i tre uavhengige eksperimenter
doi:.. 10,1371 /journal. pone.0135929.s001 product: (TIF)
takk
Vi takker Dr. Julio Pérez-Carreón (INMEGEN) for hans hjelp i bildeopptak og molekylærbiolog Paulina Sanchez for velvillig å revidere manuskript. Dette arbeidet ble støttet av tilskuddet 161619 fra CONACyT til JM-Z.
