Abstract
Forbruket av matvarer som inneholder resveratrol produserer betydelige helsemessige fordeler. Resveratrol hemmer kreft ved å redusere celleproliferasjon og metastasering og ved å indusere apoptose. Disse handlingene kan forklares ved dets evne til å inhibere (ERK-1/2), Akt og undertrykke nivåene av østrogen og insulin vekstfaktor-1 (IGF-1) reseptoren. Hvordan disse prosessene er manifestert i antitumor handlingene til resveratrol er ikke klart. Ved hjelp av microarray studier, viser vi at resveratrol redusert uttrykk for ulike prostata-kreft forbundet microRNAs (Mirs) inkludert
MIR-21
i androgen-reseptor negative og svært aggressive menneskelige prostata kreft celler, PC-3M-MM2. Denne effekten av resveratrol var assosiert med redusert cellelevedyktighet, migrasjon og invasivitet. I tillegg resveratrol økt uttrykk av kreftdempere, PDCD4 og maspin, som er negativt regulert av
MIR-21
. Short inter (si) RNA mot PDCD4 dempes resveratrol effekt på prostatakreftceller, og lignende effekter ble observert etter over uttrykk for
MIR-21
med
pre-MIR-21
oligonukleotider. PC-3M-mm2 celler også utstilt høye nivåer av fosfor-Akt (Pakt), som ble redusert med både resveratrol og LY294002 (en PI3-kinase inhibitor).
MiR-21
ekspresjon i disse cellene så ut til å være avhengig av Akt, som LY294002 reduserte nivåer av
MIR-21
sammen med en samtidig økning i PDCD4 uttrykk. Disse
in vitro
funn ble ytterligere bekreftet i en alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus xenograft modell av prostatakreft. Oral administrasjon av resveratrol ikke bare hemmet tumorvekst, men også redusert forekomst og antall metastatiske lungelesjoner. Disse tumor- og metastatisk-undertrykkende effektene av resveratrol ble assosiert med redusert
MIR-21 Hotell og Pakt, og forhøyet PDCD4 nivåer. ble observert tilsvarende anti-tumor effekter av resveratrol i DU145 og LNCaP prostata kreft celler som ble forbundet med undertrykkelse av Akt og PDCD4, men uavhengig av
MIR-21
.Disse data tyder på at resveratrol anti-tumor handlinger i prostata kreft kan forklares delvis gjennom hemming av Akt /
MIR-21
signalveien
Citation. Sheth S, Jajoo S, Kaur T, Mukherjea D, Sheehan K, Rybak LP , et al. (2012) Resveratrol Reduserer prostatakreft vekst og metastase ved å hemme Akt /mikroRNA-21 Pathway. PLoS ONE 7 (12): e51655. doi: 10,1371 /journal.pone.0051655
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 8 mars 2012; Godkjent: 05.11.2012; Publisert: 13.12.2012
Copyright: © 2012 Sheth et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av NIH Grant (R15CA135494), SIU School of Medicine Cancer Center Grant og SIU School of Medicine Excellence in Academic Medicine Award til VR. SJ ble støttet av US Department of Defense Grant (PC100127). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Et utall naturlige produkter, slik som curcumin, isoflavon, resveratrol og epigallactocatechin-3-gallat (EGCG) viser effektivitet ved regulering av veksten og metastasering av forskjellige cancere [1]. Studier tyder på at inntak av noen av disse produktene kan hjelpe i forebygging kreft eller øke effekten av standard kjemoterapeutika. Resveratrol (trans-3, 4 «, 5-trihydroxystilbene) er en polyfenoliske antioksidant som finnes i peanøtter, druer og rødvin [2], [3], som besitter betydelig helsegevinst [4]. Denne forbindelsen har vist gunstige effekter i eksperimentelle kreftmodeller, hvor det undertrykker initiering, promotering og progresjon av svulster [5]. Nyere studier har implisert aktivering av apoptotiske reaksjonsvei som en mekanisme regnskap for anti-tumor fordelene ved resveratrol. For eksempel hemmer resveratrol celleproliferasjon og induserer apoptose av humane prostata-karsinom DU145-celler [6] og akutt lymfoblastisk leukemi-celler [7]. Resveratrol produserer også cellesyklus arrest av PC3 og DU145 androgen-insensitive celler [8]. I et Transgene Adenocarcinoma mus Prostata (TRAMP) musemodell, ble resveratrol vist å utøve sin anti-tumor virkning ved å øke ekspresjonen av østrogenreseptor-β og ved å redusere insulinvekstfaktor-1 (IGF-1) og ekstracellulære signal regulert kinase 1 /2 (ERK1 /2) fosforylering [9]. De sistnevnte handlinger resveratrol kan fremstilles ved sin evne til å tjene som en agonist /antagonist ved østrogenreseptorer på prostatakreftceller [10].
Prekliniske studier indikerer fordelaktige virkninger av resveratrol i forebygging og behandling av cancer, med noen tilhørende bivirkninger. En ti år epidemiologisk studie viste en større enn 50% reduksjon i risiko for brystkreft hos kvinner som inge resveratrol ved å forbruke druer, men ikke vin [11]. Flere fase I og fase II kliniske studier er for tiden i gang for resveratrol ved National Institute of Health (http: /clinicaltrials.gov). For eksempel er resveratrol for tiden under etterforskning i fase I-studier mot Wnt veien i tykktarmskreft. Resveratrol blir også brukt i fase II-forsøk i lymfompasienter [12].
Effekten av naturlige produkter, slik som resveratrol, kan bli forklart, i det minste delvis, gjennom regulering av microRNAs (miRNAs) [ ,,,0],1. 3]. Mirnas er små ikke-kodende RNA som regulerer koding RNA ved post-transcriptional nivå [14]. Flere nylige rapporter impliserer mirnas i vekst og metastasering av forskjellige cancere [15], [16]. Oppregulering av
speil
21 er blitt detektert i en rekke kreftformer [14], inkludert prostata kreft [17], [18], [19], som tyder på at dette miRNA kan tjene som en biomarkør for disse kreftformene. Flere studier har innblandet
MIR-21
i onkogenese. For eksempel
MIR-21
regulerer veksten av brystkreftceller (MCF7)
in vitro Hotell og i en xenograft mus modell [20]. Disse forskere viste at i ettertid
MIR-21
regulert brystkreft metastase ved å nedregulere tumorsuppressorgener slik som programmert celledød 4 (PDCD4) og maspin [21].
MiR-21
har også vært innblandet i spredning og metastasering av hepatocellulære kreftceller ved å redusere fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom 10 (PTEN) [22]. I tillegg
MIR-21
regulerer tykktarmskreft intravasation og metastasering av tykktarmskreft ved å målrette PDCD4 for nedregulering [23]. Nyere rapporter har også identifisert benmorfogenetisk protein reseptor II (BMPRII) [24] og Lucine rik gjenta (i FLII) samspill protein 1 (LRRFIP1) [25] som mål for
MIR-21
. Hemming av
MIR-21
økt apopotosis av menneskelige glioblastom celler [26], noe som tyder på en anti-apoptotiske rolle denne miRNA. Den anti-apoptotiske rolle
MIR-21
er også knyttet til induksjonen av antiapoptotic Bcl-2-protein [20], og eventuelt også til aktivering av nukleær faktor (NF) -κB [27].
i denne studien, viser vi at resveratrol reduserer levedyktigheten og invasivitet av PC-3M-mm2 celler i kultur og tumorvekst i xenograft mus modell ved å hemme
MIR-21
uttrykk. Denne handlingen er mediert ved hemming av Akt, en oppstrøms regulator av
MIR-21
genet.
MTS analysen ble utført på PC-3M-mm2 celler behandlet med kjøretøy eller ulike konsentrasjoner av resveratrol ( 5-100 uM) i 72 timer, som viser at resveratrol doseavhengig redusert cellelevedyktighet.
B, etter Nedgang i celle levedyktighet av resveratrol var tidsavhengig i resveratrol-behandlet grupper (25 og 50 mm) sammenlignet med kjøretøy.
C, etter Resveratrol (25 og 50 mm) økt apoptose av PC-3M-mm2 celler i en tidsavhengig måte, som bestemmes av Annexin V-FITC og PI farging.
D, etter Resveratrol (25 mm) økt apoptose av PC-3M-MM2 celler, som bestemmes av TUNEL analysen. Celler ble behandlet med resveratrol i 24 timer og anvendt for TUNEL analyser, som beskrevet i Metoder. DAPI farging ble anvendt for å identifisere cellekjerner. Representative bilder vises. Scale bar representerer 100 mikrometer.
E, etter Søylediagrammets indikere prosent av apoptotiske celler i nærvær av 25 mikrometer resveratrol vist i
D
. Dataene indikerer middelverdi ± SEM fra minst 3 uavhengige eksperimenter. Stjerne (*) viser statistisk signifikant forskjell (p 0,05). Fra kjøretøy-behandlede celler
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyrestudier ble gjennomført i samsvar med National Institutes of Health bruk dyr retningslinjer og en protokoll godkjent av Southern Illinois University School of Medicine Laboratory Animal Care og bruk komité.
sårtilheling analysene ble utført på celler behandlet med kjøretøy eller resveratrol (25 og 50 uM) i 24 timer. Resveratrol inhiberte signifikant migrering av celler inn i de utarmede områder, som antydet med dobbeltpilene
(A)
og i stolpediagram
(B)
.
C, D, etter Modifisert Boyden invasjon kammer analysen viste at resveratrol (25 og 50 mm) behandling for 24 timer betydelig hemmet PC-3M-MM2 celle invasjon som angitt med rød pil
(C)
. Representative bilder av invasive celler per behandlingsgruppe vises. Dataene som presenteres i søylediagram
(B, D)
er gjennomsnitt ± SEM av minst 3 uavhengige eksperimenter. Stjerne (*) viser statistisk signifikant forskjell (p 0,05). Fra kjøretøy-behandlede celler
mikroRNA genet rekke profil av gener reguleres av resveratrol. PC-3M-MM2 cellene behandlet med bærer eller resveratrol (25 uM) i 24 timer, hvoretter total-RNA ble isolert. Prøvene ble deretter utsatt for microarray analyse for påvisning av de
Mirs
som er kjent for å bli regulert i prostata kreft [19] med Affymetrix gen brikke (se Metoder). Paneler sammenligne
miRNA
profilen til kjøretøy og resveratrol-behandlet PC-3M-mm2 celler. Intensiteten av rød og grønn farge indikerer omfanget av opp- og nedregulering av
mirnas, etter henholdsvis. Tilsvarende undersøkelser ble utført på tre uavhengige prøver for hver behandlingsgruppe. Den høyeste endringen ble observert for
MIR-21
som angitt.
B, etter Resveratrol synker
MIR-21
nivåer i en doseavhengig måte. PC-3M-MM2 cellene behandlet med bærer eller resveratrol (5-100 uM) i 24 timer, hvoretter total-RNA ble isolert og
MIR-21
nivåer ble detektert ved kvantitativ RT-PCR ved bruk av TaqMan® miRNA analyse.
C, D, etter Resveratrol øker nivået av PDCD4 og maspin på en doseavhengig måte. PC-3M-MM2 cellene ble behandlet med enten bærer eller resveratrol (5-100 uM) i 24 timer, hvoretter hele cellelysater ble fremstilt for Western blotting for påvisning av PDCD4 og maspin, respektivt.
E, etter Resveratrol økt PDCD4 luciferase aktivitet. Plasmid inneholdende PDCD4 3 «UTR innsatt nedstrøms for luciferase-kodende sekvensen ble transfektert inn i PC-3M-mm2-celler i 48 timer. Cellene ble deretter behandlet med resveratrol (25 uM) i 24 timer, hvoretter cellelysatene ble fremstilt og utsatt for luciferase-assay. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra minst 3 uavhengige eksperimenter. Stjerne (*) viser statistisk signifikant forskjell (p 0,05). Fra kjøretøy-behandlede celler
Cell Culture
Meget invasive, androgen-uavhengig menneskelige prostata carcinom PC-3M-MM2 celler ble hentet fra Dr. Kounosuke Watabe (SIU School of Medicine, Springfield, IL). Denne cellelinje er avledet fra beinmetastatisk cellekulturer av intra-kardiale injeksjoner av PC-3M-MM1 celler i nakne mus [28]. PC-3M-MM1 celler i sin tur ble avledet fra PC-3M celler [28], som er en aggressiv variant av PC-3 celler [29]. Andre prostatakreft cellelinjer, DU145 og LNCaP, ble vennlig levert av Dr. Daotai Nie (SIU School of Medicine, Springfield, IL). Alle cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco, Grand Island, NY) supplert med 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 50 enheter /ml penicillin og 25 ug /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA. ). Celler ble dyrket ved 37 ° C i nærvær av 5% CO
2 og 95% luft fra omgivelsene. Alle forsøkene ble utført i fullstendig media ved hjelp av sammenflytende monolag, med mindre annet er nevnt.
A, etter Western blot av helcellelysater av PC-3M-mm2-celler transfektert med enten krafse eller PDCD4 siRNA (10 nM) i 48 timer viste nedregulering av PDCD4 nivå og redusert respons til resveratrol (25 uM). Celler ble utsatt for resveratrol i 24 t etter siRNA transfeksjon.
B, etter PDCD4 siRNA (10 nM) betydelig redusert evne resveratrol (25 mm) for å hindre PC-3M-MM2 celleviabilitet som bestemmes av MTS analysen. Etter 24 timer med siRNA transfeksjon ble cellene sådd ut i 96-brønners plate og utsatt for resveratrol i 72 timer.
C, etter PDCD4 siRNA delvis reverserer evne resveratrol å indusere apoptose i PC-3M-mm2 celler. Apoptose-analysen ble utført ved annexin V-FITC farging etter 48 timer med resveratrol (25 uM) behandling etter 24 timer av siRNA transfeksjon.
D, E, etter PDCD4 siRNA (10 nM) blokkert muligheten for resveratrol (25 mm) for å hemme migrering av PC-3M-mm2 celler i sårheling analysen som demonstrert av de doble pilene
(D )
. -Celler ble transfektert i 24 timer, hvoretter såret ble laget og bilder ble tatt ved tiden 0 timer. Cellene ble deretter behandlet med resveratrol i 24 timer og bilder ble tatt på nytt. Representative bilder vises. Dataene fra
(D)
er presentert i søylediagram i
(E)
.
F, etter PDCD4 siRNA (10 nM) reversert resveratrol-indusert hemming av PC-3M-MM2 celle invasjon i modifisert Boyden invasjon kammer analysen. Celler ble transfektert i kolber i 24 timer før såing dem i topprommet. Dataene indikerer middelverdi ± SEM fra minst 3 uavhengige eksperimenter. (*), (**) Og (***) indikerer statistisk signifikant forskjell (p 0,05) fra rykke siRNA, fra resveratrol + rykke siRNA og fra PDCD4 siRNA behandlingsgruppene, henholdsvis
. celler transfektert med
pre-MIR-21 plakater (30 nM) viste økte nivåer av
MIR-21
. Cellene ble transfektert med
pre-MIR-21
sekvens for 48 timer og ble deretter brukt for bestemmelse av
MIR-21
nivåer ved kvantitativ RT-PCR bruker TaqMan® miRNA analysen. Kontroll celler ble transfektert med egge
pre-MIR.
B, etter
Forhånds MIR-21 plakater (30 nM) transfeksjon redusert nivåene av PDCD4 og svekket respons av resveratrol (25 mikrometer i 24 timer), som bestemmes av Western blotting.
C, etter
Forhånds MIR-21 plakater (30 nM) reversert resveratrol-indusert hemming av PC-3M-MM2 celle invasjon i modifisert Boyden invasjon kammer analysen.
D, E, etter Sårtilheling analysen viser reversering av resveratrol-indusert hemming av PC-3M-MM2 celle migrasjon av
pre-MIR-21 plakater (30 nM). Representative bilder vises. Dataene i stolpediagrammer som er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra minst 3 uavhengige eksperimenter. Stjerne (*), (**) og (***) indikerer statistisk signifikant forskjell (p 0,05) fra scramble-behandlet kontroll, resveratrol + rykke
før MIR
og
pre-speil 21
transfektert PC-3M-mM2 celler, henholdsvis.
Reagenser
Resveratrol og LY294002 ble kjøpt fra Sigma Chemical, Co (St. Louis, MO).
Forhånds MIR-21
oligonukleotid,
pre-Mir
negativ kontroll, PDCD4 siRNA og negative kontroll siRNA ble kjøpt fra Ambion (Houston, Texas). Anti-PDCD4 antistoff var fra Epitomics, Inc (Burlingame, California), mens antistoffer mot fosfor-Akt ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Antistoffer mot maspin og Akt ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, California) og anti-β-actin antistoff ble kjøpt fra Sigma Chemical, Co. Alle reagenser og forsyninger var av høyeste tilgjengelige klasse og ble kjøpt fra vanlige kilder.
Resveratrol hemmer Akt fosforylering på en doseavhengig måte. PC-3M-MM2 celler ble utsatt for kjøretøy eller forskjellige doser av resveratrol (5-100 uM) i 24 timer og hele cellelysatene fremstilt fra disse celler ble anvendt for Western blotting.
B, etter Hemming av Akt fosforylering av LY294002. PC-3M-MM2 celler ble behandlet med LY294002 (10 pM), en PI3 kinase-inhibitor, i 24 timer og anvendt for Western blotting for å vurdere Akt aktivering.
C, etter Akt hemming redusert
Mir-21
nivåer som bestemmes av mikroRNA rekke analyse. PC-3M-MM2 cellene behandlet med bærer eller LY294002 (10 uM) i 24 timer, hvoretter total-RNA ble isolert. RNA-prøvene ble deretter underkastet analyse av microarray
Mirs
.
Mirs
som er kjent for å være regulert i prostata kreft [19] vises med Affymetrix genet chip. Paneler sammenligne
miRNA
profilen til kjøretøy og LY294002 behandlet PC-3M-mm2 celler. Intensiteten av rød og grønn farge indikerer omfanget av opp- og nedregulering av
mirnas
hhv. Tilsvarende undersøkelser ble utført på tre uavhengige prøver for hver av behandlingsgruppene.
D, etter LY294002 økt PDCD4 nivåer. PC-3M-MM2 celler ble utsatt for LY294002 (10 uM) i 24 timer og anvendt for Western blotting.
E, etter LY294002 økt PDCD4-luciferase aktivitet. Plasmid inneholdende PDCD4 3′-UTR nedstrøms for luciferase-genet kodende sekvens ble transfektert inn i PC-3M-mm2-celler i 48 timer. Cellene ble deretter behandlet med LY294002 (10 uM) i 24 timer, hvoretter cellelysatene ble fremstilt og utsatt for luciferase-assay. Dataene i søylediagram er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra minst 3 uavhengige eksperimenter. Stjerne (*) angir signifikant forskjell (p 0,05). Fra bæremiddelbehandlede celler
PC-3M-MM2 cellene behandlet med bærer eller LY294002 (10 uM) i 72 timer og cellelevedyktighet ble bestemt ved MTS-analyse.
B, etter LY294002 (10 mm) behandling for 48 timer indusert apoptose i PC-3M-mm2 celler som bestemmes av Annexin V-FITC og PI flekker som ble kvantifisert ved hjelp av flowcytometri.
C, etter LY294002 (10 mm) økt apoptose av PC-3M-MM2 celler, som bestemmes av TUNEL analysen. Celler ble behandlet med LY294002 i 24 timer og deretter anvendt for TUNEL assay, som beskrevet i Metoder. DAPI farging ble anvendt for å identifisere cellekjerner. Representative bilder vises. Scale bar er 100 mikrometer. Søylediagram
(D)
viser prosent av apoptotiske celler i nærvær av 10 uM LY294002.
E, F, etter LY294002 (10 mm) eksponering for 24 timer redusert migrasjon av PC-3M-MM2 celler, som bestemmes av sårheling analysen. Representative bilder vises.
G, etter LY294002 (10 mm) eksponering for 24 timer redusert invasivitet av PC-3M-MM2 celler, som bestemmes av modifisert Boyden kammeret analysen. Dataene i stolpediagrammer som er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra minst 3 uavhengige eksperimenter. Stjerne (*) viser statistisk signifikant forskjell (p 0,05). Fra kjøretøy-behandlede celler
Resveratrol undertrykte tumorvekst
in vivo
. Tolv SCID-mus ble delt likt i to grupper-behandling kjøretøy og resveratrol (20 mg /kg kroppsvekt). Legemidler ble administrert ved oral føring annen hver dag til slutten av studien. Luciferase-merket PC-3M-mm2-celler (1 x 10
6) ble injisert i flanken regionen av hver mus på dag 8 (pil) av resveratrol behandling og deretter overvåket for tumorvekst. Resveratrol behandlet mus viste undertrykte tumorvekst
(A)
, redusert luciferase signal
(B, C)
, og mindre svulster
(D)
. Representative Bildene vises i
(B) Hotell og
(D)
, mens histogrammer i
(C) Hotell og
(D)
representerer gjennomsnitt ± SEM av seks mus fra hver behandlingsgruppe.
E,
Svulster isolert fra resveratrol-behandlede mus viste reduserte nivåer av
MIR-21
som bestemmes av TaqMan® analysen.
F, etter Resveratrol regulerer uttrykket av Pakt og PDCD4 i svulstvev. Isolerte svulster fra kjøretøy- og resveratrol-behandlet mus ble seksjonert for immunhistokjemisk farging for Pakt og PDCD4. Scale bar er 50 mikrometer. Stjerne (*) angir signifikant forskjell (p 0,05). Fra vehikkelbehandlede mus
SCID-mus ble behandlet med enten bærer (n = 4) eller resveratrol (20 mg /kg kroppsvekt) (n = 6) ved oralt inntak, annenhver dag fram til slutten av studien, som starter en uke før injisering PC-3M-mm2 celler (1 x 10
6), iv via halevenen. Mus behandlet med resveratrol viste signifikant redusert antall metastatiske lesjoner (pil). Representative bilder av lungene fra en mus per behandlingsgruppe blir vist.
celleviabilitet analysen (MTS analysen)
In vitro
PC-3M-MM2 celleproliferasjon ble utført ved hjelp CellTiter 96® vandige løsning Cell Proliferation Assay Kit (Promega, Madison, WI), i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk, ble 2500 celler per brønn utsådd i en 96-brønns plate. Etter respektive behandlinger ble cellene tillatt å vokse i 72 timer. Etter 72 timer ble 20 ul CellTiter 96 Aqueous One Solution reagens tilsatt til hver brønn i 100 ul totalvolum av mediet. Celler ble inkubert i 3 til 4 timer, og absorbans ble registrert ved 490 nm ved anvendelse av en ELISA-plateleser. Absorbansen er direkte proporsjonal med antallet levende celler, og er uttrykt som en prosent i forhold til bærer-behandlede celler.
Apoptose Påvisning ved strømningscytometri
Celledød via apoptose ble bestemt ved hjelp av FITC -AnnexinV apoptose deteksjon kit (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) og kvantifisert ved flowcytometri som beskrevet tidligere [30]. I korthet, ved slutten av behandlingstiden ble PC-3M-MM2 cellene vasket en gang med fosfatbufret saltvann (PBS) og høstet i en 0,5% trypsin /EDTA-løsning ved 37 ° C, sentrifugert ved 220 x
g
i 5 min og deretter umiddelbart resuspendert i fysiologisk buffer (1X) i settet. -Celler (1 x 10
5 celler /500 ul) ble så holdt i mørke i 15 minutter ved romtemperatur med 5 ul av både propidiumjodid og FITC-konjugert annexin V, hvoretter prøvene ble analysert umiddelbart etter BD Biosciences
FACSCalibur
flowcytometer (San Jose, California). Resultatene ble kvantifisert ved hjelp av Cellquest programvare (BD Biosciences, San Jose, California).
Apoptose Påvisning av TUNEL analysen
Celledød via apoptose i PC-3M-mm2 celler ble oppdaget av TUNEL analysen bruker Fluorescein FragELTM DNA-fragmentering deteksjon kit (EMD Biosciences). I korthet ble monolag av PC-3M-MM2 celler ble dyrket på dekkglass. Ved slutten av behandlingen ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyde. Cellene ble deretter
permeabilized
bruker proteinase K (1:100 fortynning) (følger med i pakken) i 20 minutter ved romtemperatur. Ved slutten av inkubasjonen ble cellene skylt med 1X Tris-bufret saltvann (TBS). Hvoretter de ble inkubert med 1 x TdT ekvilibreringsbuffer i 10-30 min. Etter at inkubasjonen var over, ble 60 ul TdT merking reaksjonsblandingen applisert på hver dekkglass og ble plassert i et fuktet kammer og inkubert i 1-1,5 timer ved 37 ° C. Deretter ble cellene skylt to ganger med 1X TBS. Celler som inneholder dekkglass ble montert ved hjelp av fluorescens-FragELTM montering media. Overskudd av monterings media ble tørket av og kantene ble forseglet ved hjelp av neglelakk. Slides ble deretter avbildes med et Olympus konfokal mikroskop (Olympus America Inc., Melville, New York).
Modifisert sårhelende analysen
Like antall celler ble sådd ut i hver brønn i tolv-brønn kulturplater. Etter at cellene nådde 70% til 80% konfluens, ble en linje riper i midten av brønnen ved hjelp av en pipette for å skape et sår. Differential interferens kontrast (DIC) bilder av avdekt området på tre tilfeldige felt per brønn ble tatt til fange av en konfokalmikroskopi like etter denudasjon (tid, 0 h). Cellene ble deretter behandlet med forskjellige reagenser og inkubert i ytterligere 24 timer, og bilder ble igjen registrert. For kvantifisering, er området av lukke sår målt fra den utarmede område og normalisert til vehikkelbehandlede kontroller. For å studere effektene av PDCD4 siRNA og
pre-MIR-21
på sårhelende av PC-3M-MM2 celler, celler ble transfektert med PDCD4 siRNA,
pre-MIR-21
og deres respektive negative kontroller i 24 timer etter som såret ble opprettet, og bildene ble tatt på tidspunktet, 0 h.
Modifisert Boyden Invasion Chamber analysen
muligheten for prostata kreft celler til migrere gjennom Matrigel-belagte membraner ble målt ved hjelp av 24-brønns BD BioCoat Matrigel invasjonen kamre (BD Biosciences, San Jose, California). PC-3M-mm2-celler (5 x 10
4) ble suspendert i kulturmedium uten serum og ble sådd på toppen av kammeret invasjonen kammeret etterfulgt av respektive behandlinger. Komplett medium ble tilsatt til den nederste kammer. Ved slutten av 24 timer ble celleinnsatser fjernet, og cellene ble forsiktig tørkes fra den øvre overflate av membranen med en bomullspinne. De invasive Cellene fester seg til den nedre overflate av membranen ble farget med 100% metanol og 1% toluidin blått, respektivt. Bildene ble tatt under et lysmikroskop ved hjelp av et 20x objektiv. Totalt antall invaderte celler ble manuelt telles i fire tilfeldig utvalgte felt per behandling per innsats. For å studere effektene av PDCD4 siRNA og
pre-MIR-21
, PC-3M-mm2 celler ble transfektert med PDCD4 siRNA,
pre-MIR-21 Kjøpe og deres respektive negative kontroller for 24 timer før poding dem i topprommet.
Western blot analyse
Ved slutten av behandlingen, ble PC-3M-mm2 celler ble vasket med iskald 1 x PBS og homogenisert ved anvendelse av en sonikator i iskald lyserer buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2 og 1 mM EDTA, i nærvær av proteaseinhibitorer blanding (Sigma) og fosfatase-inhibitor 1 (1:100) (Sigma). De hel-celle-lysatene ble deretter anvendt for Western-blotting som beskrevet tidligere [31]. I korthet, ble proteinkonsentrasjonen bestemt ved Bradford-metoden og tilsvarende mengde av protein fra hver prøve ble blandet med oppløsning buffer (20% SDS, 1 M Tris, 20% glycerol og klype bromfenolblått) og oppvarmet på vannbad ved 95 ° C i fem min. Prøvene ble deretter løst ved hjelp av SDS polyakrylamid-gelelektroforese. Proteiner ble overført til nitrocellulosemembraner, blokkert i en oppløsning inneholdende 10X PBS, 10 mM EDTA, 20% TritonX-100 og 5% lav-fett skummet melk i 1 time, og deretter inkubert ved 4 ° C over natten sammen med det primære antistoff. Etter tre vaskinger i blokkeringsløsning (blotto), ble blottene inkubert med pepperrotperoksidase-merket artsspesifikke IgG sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur, vasket tre ganger med 1 x TBS inneholdende 1% Tween 20. Dette ble etterfulgt av tre vaskinger med TBS 1X, uten Tween 20 Blottet ble behandlet med ECL pluss reagens (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) og visualisert ved anvendelse ladet-brikken LAS 4000 (Fujifilm North America Corporation, Valhalla, NY). Densitometrisk analyse av båndene ble utført ved hjelp av MultiGauge versjon 2,0 software. Individuelle bånd ble normalisert til enten Total-Akt eller β-actin som forholdet av målproteinet. Dette var mer normalisert i% av kontroll ved å ta verdiene av kontroll som 100%.
oligonukleotid og short inter (si) RNA transfections
Syntetisk
pre-MIR-21
(30 ng) (ID # PM10206, Ambion, Austin, TX), PDCD4 siRNA (10 ng) (siRNA ID # s223740, ambion) og deres respektive negative kontroller ble levert inn i PC-3M-mm2 celler ved hjelp Lipofectamine ™ RNAiMAX ( livet Technologies Corp., Carlsbad, California) som per produsentens protokoll. Kort sagt ble PC-3M-MM2 cellene sådd i 6-brønns plater ved 30% konfluens. Neste dag, passende mengde av
pre-MIR-21
eller PDCD4 siRNA og deres negative kontroller ble fortynnet i 100 ul serumfritt medium og ble inkubert ved romtemperatur i 15 til 20 minutter med 5 mL av Lipofectamin RNAiMAX transfeksjon reagens for å tillate dannelsen av transfeksjons-komplekser, som ble tilsatt til cellekulturene ved forsiktig virvlende platene. Dyrkningsmediet ble erstattet med friskt medium etter 5-6 timer, og cellene ble inkubert i 48 timer. For alle andre etterfølgende eksperimenter, ble den samme protokollen følges med mindre annet er spesifisert.
RNA Isolation, Reverse Transcription og TaqMan Real-Time PCR
Isolering av total RNA fra PC-3M-mm2 celler og tumorvev ble utført ved hjelp QIAzol lysereagensen (Qiagen, Valencia, CA) som anvist av produsenten.
MiR-21
cDNA ble generert fra 200 ng av total RNA som var omvendt transkribert ved hjelp av
HSA-MIR-21
QRT-PCR-primer sett (Applied Biosystems, Foster City, CA) og TaqMan ® mikroRNA Reverse Transcription (RT) kit (Applied Biosystems). Hver RT reaksjon inneholdt 1X RT spesifikk primer, 1X RT reaksjon buffer, 0,15 mL av 100 mm dNTP, 50 U /mL MultiScribe RT enzym og 3,8 U /mL RNase inhibitor. Den 15 ul reaksjonsblanding ble deretter inkubert i 30 minutter ved 16 ° C, 30 min ved 42 ° C og 5 minutter ved 85 ° C og deretter holdt ved 4 ° C i en PCR-cycler. The real-time PCR ble utført på Applied Biosystems StepOnePlus ™ Real-Time PCR System ved hjelp av en standard TaqMan® PCR kit (Applied Biosystems) protokoll. Kort fortalt, etter RT trinnet, 2 mL av RT reaksjon ble kombinert med 1 mL av 20X TaqMan® mikroRNA-analysen (forover primer, revers primer og probe) og 17 mL av TaqMan® Universal PCR Master Mix i 20 mL endelig volum. Reaksjonene ble inkubert ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Eldre
MIR-21
uttrykk ble beregnet ved hjelp av to
-ddC
t metode i forhold til U6-snRNA og uttrykt som ganger endring. Alle TaqMan-PCR ble utført i tre paralleller.
microarray analyse
miRNA microarray profilering ble utført med Affymetrix Genechip miRNA v1 arrays (Santa Clara, CA) i henhold til produsentens anbefalte protokoll og ble gjennomført av CFG Microarray Kjerne Facility (Universitetet i Albany, Rensselaer, New York). I korte trekk ble 500 ng av det totale RNA ekstrahert fra cellene merket ved polyA-polymerase tilsetning hjelp av Genisphere FlashTag HSR kit (Genisphere, Hatfield, PA). RNA ble hybridisert til Affymetrix miRNA v1 matrise og skannet på en Genechip Scanner 30007G som anbefalt av leverandøren. Rådata ble sjekket for kvalitet ved hjelp av miRNA QC verktøy programvare (Affymetrix). Videre analyser ble gjort ved hjelp GeneSpring Gx v11.3. Som vist på fig.
