Abstract
For å studere de enkelte funksjonene hyaluronan samspill proteiner i prostatakreft (PCA ) motilitet gjennom bindevev, har vi utviklet en ny tre-dimensjonale (3D) hyaluronsyre (HA) hydrogel-analysen som gir en fleksibel, kvantifiserbar, og fysiologisk relevant alternativ til dagens metoder. Invasjonen i dette systemet gjenspeiler utbredelsen av HA i bindevev og dens rolle i markedsføringen av kreft cellemotilitet og vev invasjon, noe som gjør systemet ideelt for å studere invasjon gjennom benmarg eller andre HA rike bindevev. Den bio-kompatible kryssbinding prosessen brukte vi gir mulighet for direkte innkapsling av kreftceller i gelen der de vedta en distinkt, cluster-lignende morfologi. Metastatiske PCA cellene i disse hydrogeler utvikle finger strukturer, «invadopodia», i samsvar med sine invasive egenskaper. Antallet invadopodia, samt cluster størrelse, form og konvergens, kan gi en målbar grad av invasiv potensial. Blant kandidat hyaluronan samspill proteiner som kan være ansvarlig for oppførselen vi observerte, fant vi at kulturen i HA hydrogel utløser invasive PCA celler til forskjellig uttrykk og lokalisere reseptor for hyaluronan mediert motilitet (RHAMM) /CD168 som, i fravær av CD44, ser ut til å bidra til PCa motilitet og invasjon ved å samhandle med HA-hydrogel komponenter. PCa celle invasjon gjennom HA hydrogel også ble funnet å avhenge av aktiviteten av hyaluronidases. Studier vist her viser at mens hyaluronidase aktivitet er nødvendig for invadopodia og tilknytnings klynge formasjon, er ikke tilstrekkelig for kjøp av invasivitet å skje aktivitet alene. Vi foreslår derfor at utvikling av invasiv atferd i 3D HA-baserte systemer krever utvikling av flere cellulære funksjoner, for eksempel aktivering av motilitet forbundet veiene som regulerer dannelsen av invadopodia. Dermed rapporterer vi utviklingen av et 3D system mottagelig for disseksjon av biologiske prosesser knyttet til kreft cellemotilitet gjennom HA-rik bindevev
Citation. Gurski LA, Xu X, Labrada LN, Nguyen NT, Xiao L, van Golen KL, et al. (2012) hyaluronan (HA) samspill proteiner RHAMM og Hyaluronidase Impact Prostate Cancer Cell Behavior og Invadopodia Dannelse i 3D HA-baserte Hydrogeler. PLoS ONE 7 (11): e50075. doi: 10,1371 /journal.pone.0050075
Redaktør: Sharon Gerecht, Johns Hopkins University, USA
mottatt: 12. juni 2012; Godkjent: 15 oktober 2012; Publisert: 16.11.2012
Copyright: © 2012 Gurski et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health (www.nih.gov) P01CA098912 (MCFC) og P20RR016458, P20RR017716, R01DC008965 (XJ), National Science Foundation (www.nsf.gov) DMR 0.643.226 (XJ) og IGERT 0221651 (LG) og Delaware helsevitenskap Alliance (DHSA) (www.delawarehsa.org) (XJ), Department of Defense (www.defense.gov) PCRP W81XWH-05-1-0005 og W81XWH-08-1-0356 ( KLVG) og PCRP W81XWH-11-1-0564 (LG) og Senter for translasjonell kreftforskning (www.udel.edu/ctcr). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Et flertall av pasienter som dør av solide tumorer hvert år lider av benmetastaser [1]. De tre mest diagnostisert krefttyper, prostata, lunge og bryst, metastasere til ben. Benmetastase dramatisk reduserer livskvaliteten på grunn av smerte, brudd, og hypercalcemia [2]. I tillegg nærvær av benmetastaser senker overlevelse. For prostatakreft (PCA), fem års overlevelse for lokal sykdom er 100%, mens hastigheten synker til 30% for avansert sykdom med fjernmetastaser [1]. Foreløpig er det få effektive behandlinger for å behandle bein metastasering eller for å hindre spredning til bein eller andre nettsteder [2]. Det finnes et definert klinisk behov dermed å utvikle nye behandlingsformer for å behandle og forebygge beinmetastaser som involverer bevegelige, invasive kreftceller som kan lett kolonisere bindevev som benmarg.
Studiet av trasé som styrer kreftcelle invasjon eller migrasjon , og utvikling av nye medikamenter for å hindre at disse prosessene krever systemer som kan måle de invasive egenskaper av disse cellene [3], [4]. For tiden tilgjengelige invasjon og migrasjons analyser er mindre enn ideell i at de ofte: 1) er vanskelig å kvantifisere, 2) er vanskelige å tilpasse til de enkelte cancercelle atferd, eller 3) benytter matriser så som animalsk avledet Matrigel ™ som inneholder vekstfaktorer som komplisere eksperimentelle resultater [3], [5], [6].
benmarg matriks består av myk, gel-lignende bindevev rik på hyaluronsyre (HA) [7], [8]. HA er et stort, ikke-sulfatert glykosaminoglykan består av repeterende β-1,4-bundne D-glukuronsyre og ß-1,3-N-acetyl-D-glukosaminen disakkaridenheter [9]. HA finnes overalt i den ekstracellulære matriks (ECM) av alle celletyper, men er spesielt anriket på bindevev. Celler kan binde HA gjennom ulike reseptorer, inkludert klynge av differensiering 44 (CD44) eller reseptor for hyaluronan-mediert motilitet (RHAMM) [10]. I kreftceller har RHAMM blitt vist å binde CD44 på celleoverflaten, og HA binding til dette komplekset fremmer nedstrøms signalisering som resulterer i Rho GTPase-aktivering og øket cellevandring [11], [12]. Både RHAMM og CD44 uttrykk nivåer har vært knyttet til utviklingen av en rekke kreftformer, inkludert PCa [13], [14].
En annen måte som celler reagerer med HA er ved å nedbryte det, ved ekspresjon og sekresjon av hyaluronidases (HAases). Relevant for PCa invasjon er HAases, Hyal-1 og Hyal-2, hvis ekspresjon nivåer har vært implisert i PCa metastase [13], [15], [16]. Hyal-en er aktiv ved lave pH-verdier fra 3.5 til 3.8 og spalter enhver molekylvekt HA inn i tetramerer [17]. Hyal-2 viser optimal aktivitet ved pH 6,0-7,0 og spalter høymolekylært HA inn i mellomliggende, 20 størrelse fragmenter kDa [18]. En glykosylert, 57 kDa-formen av Hyal-1 kan bli utskilt av celler [19]. Haase sekresjon kan lette PCa metastase ved at kreftceller til å invadere HA rike bindevev matrix.
Viktigere HAases er druggable mål, noe som indikerer deres potensielle bruk som mål å bremse invasjon og muligens forhindre metastasering [20], [21]. En Haase inhibitor, dinatrium cromoglycate (DSC) [22], [23] er FDA godkjent for bruk for å lindre symptomer på allergi og astma, og viser lav toksisitet hos pasienter [24], [25]. Dens evne til å hemme PCa invasjon og metastasering er ikke undersøkt.
Vi har tidligere beskrevet utviklingen av en HA-baserte hydrogel for kultur av dårlig tilhenger beinmetastatiske PCA celler [26]. Hydrogelen består av to kjemisk modifisert HA komponenter, aldehyd-bære HA (HAALD) og adipinsyredihydrazid-avledet HA (HAADH). Disse komponentene tverrbinde via dannelsen av hydrazin-bindinger, og slipper vann som det eneste biprodukt [27]. PCA celler kan bli innkapslet i HA hydrogelen under tverrbindingsprosessen. Levedyktigheten for de innkapslede celler holder seg høy i minst en uke [26]. Fordi HA er av bakteriell opprinnelse, er det blottet for eukaryote vekstfaktorer som kan påvirke cellevekst, invasjon, og migrasjon.
For å studere utviklingen av invasive egenskapene til PCA celler i en innfødt bindevev matrix, vi brukte LNCaP serie av humane PCA-celleunderlinjer som ble utviklet for å etterligne fremgangs PCa benmetastase. Disse cellene blir regnet som en av de bedre PCA progresjon modeller tilgjengelig på grunn av deres evne til å danne klinisk relevante osteoblastiske lesjoner hos mus [28]. Individuelle underlinjer i LNCaP serien gjenspeiler trinnene i sykdomsprogresjon med LNCaP celler som representerer en tidlig prostata svulst som har nådd en nærliggende lymfeknute, C4 celler som representerer aggressive, lokalt invasive kreftceller som overlever etter kastrering, c4-2 celler som representerer aggressive, metastatisk sykdom, og C4-2B celler som representerer PCa kastrering resistente benmetastaser [29]. Ved hjelp av disse cellene og den nye 3D-HA-gel invasjon system utviklet vi undersøkte vi rollen til HA-reseptorer og HAases i PCa invasjon og migrasjon gjennom en HA rikt bindevev som matrise. Ved anvendelsen av dette arbeid som beskriver bevegelsen av PCA-celler i 3D-hydrogeler, som skiller seg fra migrasjon over plastoverflater, beskriver vi migrasjon som den tilsynelatende bevegelse av cellene gjennom porøse hydrogeler dokumentert ved forlengelse av cellulære prosesser som vi kaller «invadopodia» og av sammenslåing av tidligere atskilte klynger i hydrogeler.
Materialer og metoder
Material
Elektroforese, cellekultur, og transfeksjon reagenser og forbruksmateriell ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California) . TCM ™ definert serum erstatning ble kjøpt fra MP Biomedicals (Solon, OH). Hyaluronsyre (natriumsalt, 500 kd og 1,3 MDA) ble generøst gitt av Genzyme Corporation (Cambridge, MA). RHAMM (HMMR) og CD44 antistoffer ble kjøpt fra Novus Biologicals (Littleton, CO). Hyal2 og β-aktin-antistoff ble innkjøpt fra Abcam (Cambridge, MA). Equine-α-mus-HRP sekundært antistoff ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Hyal1 antistoff, bovin hyaluronidase testiklene (BTH), β-merkaptoetanol (βME), glycin, Tween®20, bovint serumalbumin (BSA), natriumformiat, Coomassie brilliant blue, dinatrium-kromoglykat (DSC), og deoksykolsyre ble innkjøpt fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Geit-α-kanin HRP-sekundært antistoff, proteaseinhibitorer (PI), 5X prøvebuffer, sulfo-NHS-SS-biotin og avidin-agarose ble anskaffet fra Thermo Scientific (Rockford, IL). Laemmli-prøvebuffer og Alcian blått ble anskaffet fra Biorad (Richmond, CA). Tris-buffer, iseddik, metanol, med lavt smeltepunkt (LMP) agar, dimetylsulfoksyd (DMSO), natriumdodecylsulfat (SDS), Triton X-100, og natriumklorid (NaCl) ble kjøpt fra Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ). Nonidet P-40 ble kjøpt fra Roche (Indianapolis, IL) og etanol ble kjøpt fra DECON Labs, Inc (King of Prussia, PA). Alle forbindelser som ble anvendt var av reagensrenhet eller bedre.
Cell Culture
Brønn passasje tall PCA-celler ble holdt i Corning (Lowell, Massachusetts) vevskultur 75 mm kolber ved 37 ° C i 5,0% ( v /v) CO
2 i T-medium supplert med 5% (v /v) føtalt bovint serum (FBS) og 100 U /ml penicillin G-natrium og 100 ug /ml streptomycin sulfat på 0,085% (w /v ) saltvann (PS). Medium ble endret etter 2-3 dager. Celler ble passert ved tilnærmet 80% konfluens, bedømt ved øyet ved bruk av 0,25% (vekt /volum) trypsin med etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) 4 • Na. LNCaP underlinjer [30] ble sjenerøst gitt av Dr. Leland Chung og PC3 cellene ble kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia).
Utarbeidelse av HAALD og HAADH
For å syntetisere HA aldehyd (HAALD ), oksidasjonsreaksjon av HA (1,3 MDA) ble utført i nærvær av natrium-perjodat under vandige betingelser. Adipindihydrazid (ADH) -modifisert HA (HAADH) ble syntetisert ved hjelp av karbodiimid-mediert kobling av ADH med karboksylgruppene HA (500 kd) i vandige betingelser. Detaljerte prosedyrer for syntese og karakterisering av begge disse HA derivater ble rapportert i vår tidligere studie [26].
Cell Culture i 2D og 3D betingelser
HAALD og HAADH ble oppløst separat i Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS) til en konsentrasjon på 10 mg /ml over natten ved 37 ° C. 2% (w /v) agar LMP i DPBS ble fremstilt, og ble smeltet i en 70 ° C heatblock (Labnet International, Woodbridge, NJ) i minst 1 time før bruk. Oppløste HA derivater ble sterilisert ved UV-bestråling ved 254 nm i 15 minutter før bruk.
PCA-celler ble frigjort fra sin kolbe ved bruk av 0,25% (w /v) Trypsin EDTA 4NA og det totale antallet celler ble tellet ved hjelp av en hemocytometer (Hausser Scientific, Horsham, PA). 100000 (for 24-brønns plate), eller 600000 (for 6-brønners plate) celler ble pelletert for hver kultur. Celledyrkningsinnsatser (Millipore, Billerica, MA, porestørrelse: 0,4 mm, diameter 12 mm for 24-brønns plate, 30 mm for 6-brønners plate) ble pre-våt i T-medium så plassert i brønnene til en 24-brønners eller 6-brønn kultur plate (Beckton-Dickenson laboratorium, Franklin Lakes, NJ). For 2D kulturer, ble Cellepelleten blandet med T-medium (1 ml i 24-brønns plate, 4 mL av 6-brønn plate) og belagt.
For 3D HA hydrogel kultur, Cellepelleten ble blandet med 100 ul (for 24-brønns plate) eller 300 ul (for 6-brønners plate) av HAALD. Et like stort volum av HAADH ble tilsatt, og kulturen ble blandet godt for å jevnt dispergere cellene. Hydrogelen løsning ble deretter pipettert inn i pre-våt celledyrkningsinnsatser og tillatt å størkne i omtrent 10 minutter ved 37 ° C. T-medium (1 ml i 24-brønns plate, 4 ml for 6-brønners plate) supplert med 1% (v /v) PS og enten 5% (v /v) FBS og 2% (v /v) TCM ™ ble lagt rundt innsatsen, og kulturen ble inkubert ved 37 ° C, 5% (v /v) CO
2. Denne konsentrasjonen av TCM ™ er i overensstemmelse med tidligere studier som supplerer c4-2 kultur [31], [32].
For 3D-agar kultur, ble Cellepelleten blandet med 85 ul (for 24-brønns plate) eller 510 ul (for 6-brønners plate) DPBS oppvarmet til 37 ° C. Pre-smeltet 2% (w /v) LMP agar ble tilsatt til DPBS /celle blandingen til en sluttkonsentrasjon på 0,3% (w /v) agar LMP. Agar-kultur ble inkubert ved romtemperatur i omtrent 5 minutter før pipetteres inn i cellekultur innsatsen for å forhindre agar gel fra å lekke gjennom membranporene. Når belagt i innsatsen, ble agargel lov til å størkne i omtrent 10 minutter ved romtemperatur. Størkningen ble utført ved romtemperatur for å påskynde gelering av bløt agar. T-medium (1 ml i 24-brønns plate, 4 ml for 6-brønners plate) ble deretter tilsatt rundt innsatsen, og kulturen ble inkubert ved 37 ° C, 5% (v /v) CO
2. For alle kulturer ble halv mellom endringer utføres annenhver dag.
metabolsk aktivitet og celletall ble utført for celletyper og kultur forholdene beskrevet. For å måle metabolsk aktivitet av celler, vannløselig tetrazoliumsalt-1 (WST-1, Roche) reagens ble anvendt som beskrevet [33] med de følgende modifikasjoner: assayet ble utført i en 24-brønners plate med celler dyrket i enten tre eller seks dager. WST-1-reagens (100 ul) ble påført på 1 ml kulturmedium og platen ble inkubert ved 37 ° C i 1 time. Etter inkubering ble 100 ul av kulturmediet fjernet og plassert i en 96-brønners plate. Absorbans ble målt ved 450 nm i et DTX880 multimode-detektor (Beckman Coulter, Brea, CA). Å telle celle tall innenfor HA hydrogel, ble fase kontrast utnyttet. Innenfor disse bildene, ble en gjennomsnittlig størrelse celleklase med klare cellegrensene valgt og antall celler i klyngen ble tellet. Dette tallet ble multiplisert med det totale antall klynger i bildet, noe som gir en tilnærmet total celletall per fotografert feltet.
Invasion analysekvantifisering Metoder
For alle invasjon analyser, fase kontrast bildene ble tatt av hver cellekultur ved hjelp av et Nikon Eclipse TE2000-U (Tokyo, Japan) mikroskop og en 10X objektiv. Det gjennomsnittlige antall invadopodia ble bestemt ved å telle det totale antall invadopodia pr fotografert felt for tre biologiske replikater. En «invadopodium» ble definert som en tynn celle prosess som strekker seg utover fra en celle klynge, og klar nok til å bli lett identifiseres ved øyet. Prosentandelen av fusjoner klyngene ble beregnet ved å telle både antall klynger i fysisk kontakt med en annen klynge og antallet frie klynger i tre biologiske replikater. Fra disse verdiene, ble andelen av sammenslåing klynger beregnet og regnes som en indeks av migrasjon i 3D hydrogeler. I prøver hvor nettverk av cellegruppene ble observert, ble en enkelt celle klynge definert som en tydelig, avrundet for mobilnettet noen ganger viser seg å inneholde en høyere celletetthet. For begge typer kvantifisering, ble omtanke for å sikre konsistens når tellinger ble utført.
Reologi
Reologi karakterisering av hydrogel prøver ble utført på en stress-styrt reometer (AR-G2, TA instrumenter, New Castle, DE) med en 20 mm diameter standard stål parallell-plate geometri og på en 100 mikrometer gap. Dynamiske oscillerende tids sveip ble utført ved 25 ° C eller 37 ° C i agar og HA geler henholdsvis, og lagring (G «) og tap (G «) moduli ble registrert. 30 pl agar-oppløsning (0,3% w /v) eller HAADH /HAALD-blanding (1% w /v) ble lastet inn i geometri som deretter ble dekket med mineralolje ved kanten for å hindre at vann fordamper. Disse blandingene ble tillatt å størkne
in situ
som målingene ble tatt. Dynamiske oscillerende tidssveipene ble oppsamlet ved vinkelmessige frekvenser på 6 rad /s og 1% belastning er valgt fra den lineære viskoelastiske regimet [34]. Disse forsøk ble gjentatt på i det minste tre prøver og gjennomsnitt av data er presentert.
Protein Extraction
Cellene kombin fra to brønner i en 6-brønns plate kultur ble brukt for proteinutvinnings eksperimenter. BTH (180 ul ved 10 mg /ml) ble påført, og kulturene ble inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Kulturene ble overført til sentrifugerør og cellene ble pelletert ved sentrifugering i 1 minutt ved 3000 rpm. Cellene ble vasket en gang med DPBS. Radioimmunopresipitasjon (RIPA) buffer (50 mM Tris-buffer pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% (w /v) deoksykolsyre, 1% (v /v) Nonidet P-40, 0,1% (w /v) SDS, DDH
2O, 200 ul) inneholdende PI ble påført på cellepelletene. Lysater ble inkubert på is i 45 minutter med leilighetsvis risting. Lysater ble fjernet ved sentrifugering ved 13.000 omdreininger pr minutt (rpm) i 10 minutter. Den totale proteinkonsentrasjon fra lysatene ble bestemt ved anvendelse av en bicinchoninic syre (BCA) proteinanalyse (Thermo Scientific) etter en standard protokoll. Lysatene ble lagret ved -20 ° C.
Western blotting
Protein (50 ug) ble blandet med RIPA-buffer og 5X Lane markør prøvebuffer og βME (3% (v /v) slutt ) til et totalt volum på 25 pl. Prøvene ble kokt i 5 minutter og deretter avkjølt raskt og spinnes. Prøver og et protein stige ble elektroforese på en NUPAGE 4-12% Bis-Tris gel ved hjelp av en X-Cell Surelock ™ elektroforese celle og mopper kjører buffer. Prøvene ble overført til en nitrocellulosemembran ved hjelp av en X-Cell ™ II overføringsapparat og en overføringsbuffer bestående av 1,5125 mg /ml tris, 7,2 mg /ml glycin og 0,01% (w /v) SDS ved en innstilling på 21 V til 1,5 timene.
membranen ble blokkert i 3% (w /v) BSA i DPBS inneholdende 0,1% Tween 20 (PBST) i 1 time ved romtemperatur med forsiktig risting. Primære antistoffer (1:10,000 for RHAMM, 1:5000 for CD44 og β-aktin, 1:500 for Hyal1 og Hyal2) i 3% (w /v) BSA i PBST ble inkubert med membranen i 2,5 timer ved romtemperatur med rister. Membranen ble vasket 3 ganger, 10 minutter hver gang, med PBST. Sekundære antistoffer (1:5000 geite-α-kanin HRP eller 1:10,000 equine-α-mus HRP) i 3% (vekt /volum) BSA (for Hyal1, Hyal2, og β-aktin blots) eller 3% (w /v) ikke-fettholdig tørrmelk (for RHAMM og CD44 blots) ble inkubert med membranen i 1 time ved romtemperatur med risting. Membranen ble vasket 3 ganger, 10 minutter hver gang, med PBST. Supersignal® West Dura lengre varighet Substrat (Thermo Scientific) ble fremstilt som anvist og påført på membranen i 5 minutter ved romtemperatur med risting. Blottet ble avslørt ved hjelp Biomaks Lys Film (Kodak, Rochester, NY) og utviklet i en SRX-101A utvikler (Konica Minolta Medical Grafisk Inc, Tokyo, Japan). PC-3 cellelysat (50 mikrogram) ble brukt som en positiv kontroll for CD44 western.
Farging Protocol
Celler dyrket på 2D ble dyrket i en åtte godt Lab-Tek II Chambered dekkglass ( Nalge Nunc, Naperville, IL). Mediet ble fjernet, og kamrene ble vasket 2 ganger med DPBS. Celler ble løst i 10 minutter i 4% (v /v) Paraformaldehyde (PFA) (elektronmikroskopi Sciences, Hatfield, PA) i ddH2O. Overskudd av PFA ble fjernet, og kamrene ble vasket to ganger med DPBS. Triton X-100 i DPBS (0,2% (v /v)) ble fremstilt og påført på kamrene i 10 minutter. Overskudd av Triton X-100 oppløsning ble fjernet, og kamrene ble vasket to ganger med DPBS. Kulturer ble blokkert i 3% (w /v) BSA i DPBS ved 4 ° C over natten. Celler ble inkubert med 1:1000 (v /v) løsning av RHAMM eller CD44 primære antistoffer i 3% BSA ved 4 ° C over natten. En 1:1000 (v /v) løsning av Draq5 (Biostatus Limited, Leicestershire, UK) i DPBS ble påført i 10 minutter ved romtemperatur. Chambers igjen ble vasket med DPBS og Gel /Mount ™ (Biomeda, Foster City, CA) ble satt til kamre for å hindre fotobleking. Celler ble visualisert ved hjelp av konfokal mikroskopi på et Zeiss LSM 510 VIS (Carl Zeiss, Maple Grove, MN, USA).
celler i 3D, ble dyrket i 24-brønners plater som beskrevet ovenfor. Cellegrupper ble forsiktig fjernet fra hydrogelen ved hjelp av en mikropipette. Klaser ble vasket forsiktig med 1 ml DPBS 2 ganger, hurtig sentrifugering for å samle cellegrupper hver gang. Klaser ble forsiktig resuspendert i 4% (v /v) PFA og overført til en 8 vel kamret dekkglass. Kulturer ble inkubert ved romtemperatur i 10 minutter. Når overført til kamret dekkglass ble de samme fargingsprosedyrer anvendt som anvendes for 2D kultur. Ekstrem omsorg ble tatt for å beholde så mange celleklynger som mulig i løpet av hver væske fjerningstrinn.
Cell Surface Biotinylation analysen
c4-2 celler ble dyrket i en T-75 kolbe til ca 90% konfluens. Celler ble frigjort fra kolben, ble suspendert i t-medium og tellet. Celler ble vasket tre ganger i iskald PBS (pH 8,0, 5 ml). Celler ble resuspendert i iskald PBS (pH 8,0) til en sluttkonsentrasjon på 20 x 10
6 celler /ml. Nyfremstilt, ble 10 mM sulfo-NHS-SS-biotin (80 mL) tilsatt til celleblandingen, og blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter med risting. 50 mM Tris (pH 8,0, 2 ml) ble tilsatt for å deaktivere biotinylering reaksjon, og cellepelleten ble deretter vasket to ganger med PBS (pH 8,0, 2 ml). Den endelige PBS vaskevæske ble fjernet fullstendig fra cellepelleten, og RIPA-buffer inneholdende PI (500 ul) ble tilført til cellepelleten. Lyseringsreaksjonsblandingen ble inkubert på is i en time. Lysatet ble fjernet ved sentrifugering ved 12.000 RPM i 10 minutter, hvoretter supernatanten ble fjernet og lagret ved -20 ° C
A BCA-analyse ble utført på den biotinylerte lysatet som beskrevet tidligere.; omtrent 1,5 mg protein ble oppnådd. Avidin-agarose (1 ml) ble påført på et mikrosentrifugerør og harpiksen ble avgjort ved sentrifugering i 1 minutt ved 2000 opm. Harpiksen ble vasket tre ganger med RIPA-buffer (500 pl). Lysatet ble påført til harpiksen, og blandingen ble inkubert på en rotator rør ved 4 ° C over natten. Harpiksen ble avgjort ved sentrifugering 1 minutt ved 2000 RPM og ubundet lysat ble fjernet. Ubundet lysat (10 ul) ble blandet med Laemmli-prøvebuffer inneholdende 5% (v /v) βME (10 ul). Harpiksen ble vasket tre ganger med RIPA inneholdende PI (500 ul). Laemmli-prøvebuffer inneholdende 5% βME (50 ul) ble påført på perlene. Laemmli-holdige blandinger ble kokt i 5 minutter, og deretter sentrifugert ned ved 13000 RPM. Den biotinylerte nedtrekk og ubundet fraksjon ble underkastet elektroforese og overført til nitrocellulose som beskrevet tidligere. Beinmetastatisk PCa celle (PC3) lysat (10 ul) blandes med Laemmli-prøvebuffer inneholdende βME (10 ul) ble inkludert som en positiv kontroll for CD44 ekspresjon. Western blotting for CD44, RHAMM, og GAPDH ble utført som beskrevet under «Western blotting» -delen.
RHAMM Knockdown
c4-2 celler ble opprettholdt i antibiotika-free medium for tre dager før transfeksjon. Blandet 6 pmol /cm
2 Stealth RNAi ™ siRHAMM duplex (GGCGUCUCCUCUAUGAAGAACUAUA og UAUAGUUCUUCAUAGAGGAGACGCC) og 0,5 mL /cm
2 Lipofectamine ™ RNAiMAX i Optimem® jeg for RHAMM knockdown eller 6 pmol /cm
2 lav GC Stealth RNAi ™ negativ kontroll duplex og 0,5 mL /cm
2 Lipofectamine i OptiMem for transfeksjon kontroll. Transfeksjon Blandingene ble inkubert i 15 minutter ved romtemperatur før påføring på celler. Transfeksjon reaksjonene ble inkubert i seks timer ved 37 ° C, og platene ble hvirvlet forsiktig hver time for å blande reagensene transfeksjon.
transfeksjon Blandingen ble aspirert fra cellene, og cellene ble vasket med DPBS. Antibiotikum fritt medium ble applisert på cellene og transfekterte celler ble inkubert ved 37 ° C over natten før bruk for eksperimenter. Effekten av RHAMM knockdown ble vurdert gjennom Western blotting for RHAMM som beskrevet under «Western blotting» -delen.
Hyaluronidase aktivitetsanalyse
Haase aktivitet ble undersøkt via underlaget gelelektroforese [35], [36 ]. Lav molekylvekt HA ble løst opp over natten ved 37 ° C i destillert vann (0,17 mg /ml). Denne HA-løsning ble anvendt i stedet for vann ved fremstillingen av en 12% (w /v) ProtoGel® akrylamid gel (National Diagnostics, Cherry Hill, NJ). LNCaP, C4, c4-2 og C4-2B lysater eller 50 ug BTH ble blandet med like volumer av Lamelli prøvebuffer (5% (v /v)) og lastet på HA-inneholdende gel. Gelen ble underkastet elektroforese ved anvendelse av en X-Cell Surelock ™ elektroforese celle og MOPS rennende buffer. Gelen ble så fjernet fra kassetten og vasket i en time ved romtemperatur i 3% (v /v) Triton X-100 i PBS. Gelen ble deretter inkubert i et formiat-NaCl-buffer (0,1 M natriumformat og 0,15 M natriumklorid ble oppløst i destillert vann, pH 4,6) i 16-20 timer ved 37 ° C. Gelen ble vasket to ganger med destillert vann og deretter inkubert med en 0,5% (w /v) Alcian blå i 3% (v /v) iseddik løsning i en time for å påvise nærvær av HA. Gelen ble vasket tre ganger, i én time hver med en 7% (v /v) eddiksyre-løsning for avfarging og fiksering. Gelen ble deretter vasket to ganger med destillert vann, og to ganger med en 50% (v /v) methanol, 10% (v /v) iseddik løsning. For å detektere tilstedeværelsen av protein i gelen, ble det deretter inkubert med en 0,25% (w /v) Coomassie brilliant blue i 9% (v /v) etanol, 45,5% (v /v) iseddik i en time. Dette ble etterfulgt av tre vaskinger med en time metanol /eddiksyrevaskeløsningen.
Behandling av kulturer med Haase Inhibitor
En oppløsning av 125 mM DSC ble fremstilt i 40% (v /v) DMSO og filtrert i en Steriflip filter (Millipore) for å sterilisere. DSC (3,33 eller 10 ul av 125 mM) ble tilsatt til 800 pl eller 2,4 ml t-medium i løpet av 24 eller 6 brønners plater, henholdsvis til en sluttkonsentrasjon på 500 uM DSC, IC-50-verdien av denne inhibitor [37] . En lik mengde 40% (v /v) DMSO ble anvendt som en bærerkontroll. Medium ble endret hver tredje dag og frisk DSC eller DMSO ble påført som beskrevet.
trypanblått Utelukkelse
Giftigheten av DSC på PCA-celler ble bestemt ved hjelp av en trypanblått eksklusjon analysen. 600.000 celler ble sådd ut i 6 brønners plater med T medium, 5% (v /v) FBS, 1% (v /v) PS (4 ml). Etter 24 timers dyrkning ble kulturene behandlet med DSC eller bærerkontroll som beskrevet tidligere. På tre og seks dagers tidspunkter, medium ble aspirert og cellene ble utgitt med trypsin (250 pl). Celler ble pelletert, deretter resuspendert i 500 ul T medium. 50 pl av en 0,4% (vekt /volum) oppløsning av trypanblått i bufret isotonisk saltløsning ble tilsatt til hver prøve. Det totale antall hvite (live) og blå (døde) celler ble bestemt ved å telle på en hemocytometer. Prosentandelen av levende celler ble bestemt ut fra disse dataene.
Statistical Analysis
Feilfelt på alle tall viser standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Betydning ble bestemt ved hjelp av Student to utvalg to-tailed t-test med p. 0,05 ansett som signifikant
Resultater
Invadopodia og Cluster formasjonen i 3D HA Hydrogeler
Invadopodia og cluster formasjon som reaksjon på motogenic faktorer.
i innledende forsøk, evaluert vi c4-2 cellemorfologi i HA hydrogelen cellekultursystem for å fastslå om forskjeller kunne sees i respons til FBS anvendt som en motogenic faktor for å stimulere motiliteten. Kontrollkulturer ble behandlet med TCM ™, et plantebasert serum erstatning for å opprettholde cellevekst og levedyktighet, uten evne til å fremme invasjon og migrasjon. Mens TCM ™ behandlede c4-2-celler viste en lavere metabolsk effekt sammenlignet med FBS, vurderes av WST-analyse, var det ingen signifikant forskjell i estimerte celler for celler som vokser i enten tilstand ved enten tre eller seks dagers tidspunkter (se tabell S1). Vi har observert og kvantifisert morfologi forskjeller i cellene i disse geler som et mål på celle invasjon potensial og migrering evne.
Som vist i figur 1A, ved både tre og seks dagers tidspunkter, TCM ™ behandlede kulturer c4-2 viste mindre, veldefinerte cellegruppene stort sett blottet for invasive cellulære prosesser (invadopodia). I kontrast til FBS-behandlede kulturer viste større cellegrupper som dukket opp mer ujevn i form. Bemerkelsesverdig, FBS behandlede klynger ble regelmessig sett å bli sammenslåing sammen og vist et betydelig antall tydelig invadopodia ved hver endepunktet. Det innfelte av Figur 1A viser et forstørret bilde av disse invadopodia strukturer. Cellen klynger dukket større etter seks dager enn etter tre dager for hver behandling, men antall invadopodia var relativt konstant mellom de to tidspunktene.
Bilder av c4-2 celler dyrket i tre eller seks dager med enten 2 % TCM ™ (kontroll) eller 5% FBS (motogenic faktor) i HA hydrogelen invasjon assay. Pil og innfelt et forstørret bilde av bildet for å bedre skjerm invadopodia. Svart skala barer representerer 200 mikrometer, hvit skala bar på innfelt representerer 50 mikrometer (A). Kvantifisering for gjennomsnittlig antall invadopodia (B) eller prosent sammenslåing klynger (C) i hvert avbildes felt. Feilfelt = SEM, n = 3, *** p. 0,001
Kvantifisering av antall invadopodia viste at antallet av disse strukturene var signifikant høyere (p 0,0001) for FBS behandling enn for TCM ™ behandling på både tre og seks dagers tidspunkter (Figur 1b). Antallet invadopodia ikke øke for noen av behandlings mellom de to tidspunkter.
