Abstract
Bakgrunn
Signal Svinger og Activator av transkripsjon 3 (STAT3) er en onkogen, som fremmer celleoverlevelse, spredning, bevegelighet og progresjon i kreftceller. Målretting STAT3 signalering kan føre til utvikling av nye terapeutiske tilnærminger for kreft hos mennesker. Her undersøkte vi effekten av epigallocathechin gallate (EGCG) på STAT3 signalering i kreft i bukspyttkjertelen celler, og vurdert det terapeutiske potensialet av EGCG med gemcitabin eller JAK3 inhibitor CP690550 (Tasocitinib) for behandling og /eller forebygging av kreft i bukspyttkjertelen.
metodikk /hovedfunnene
Celleviabilitet og apoptose ble målt ved XTT analysen og TUNEL flekker, henholdsvis. Gene og protein uttrykk ble målt ved QRT-PCR og Western blot-analyse, respektivt. Resultatene viste at EGCG hemmet ekspresjon av fosfo og total JAK3 og STAT3, STAT3 transkripsjon og aktivering, og ekspresjon av STAT3-regulerte gener, noe som resulterer i inhibisjon av celle motilitet, migrering og invasjon, og induksjon av caspase-3 og PARP cleavage. Inhiberingen av STAT3 forbedret de inhiberende virkninger av EGCG på celle motilitet og levedyktighet. I tillegg gemcitabin og CP690550 alene hemmet Stat3 målgener og synergized med EGCG å hemme cellenes levedyktighet og indusere apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Konklusjon /Betydning
Samlet er disse resultatene tyder på at EGCG undertrykker vekst, invasjon og migrering av kreft i bukspyttkjertelen celler, og induserer apoptose ved å forstyrre den STAT3 signalveien. Videre EGCG ytterligere forbedret terapeutiske potensialet av gemcitabin og CP690550 mot bukspyttkjertelkreft
Citation. Tang SN, Fu J, Shankar S, Srivastava RK (2012) EGCG øker den terapeutiske potensialet i gemcitabin og CP690550 ved å hemme STAT3 signalveien i human kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 7 (2): e31067. doi: 10,1371 /journal.pone.0031067
Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: May 11, 2011; Godkjent: 01.01.2012; Publisert: 13. februar 2012 |
Copyright: © 2012 Tang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd fra National Institutes of Health (R01CA125262, RO1CA114469 og RO1CA125262-02S1) og Kansas Biovitenskap Tilsynet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Signaltransduksjon og aktivatorer av transkripsjon (STAT) proteiner er en familie av cytoplasmiske transkripsjonsfaktorer som innledningsvis er til stede i inaktive former [1], [2]. De blir stimulert ved binding av signaliserings peptider, slik som cytokiner, vekstfaktorer og hormoner, noe som resulterer i dimerisering av deres beslektede reseptorer og aktivering av tyrosin-kinaser så som Janus kinase (JAK). De aktiverte tyrosin kinaser kan deretter fosforylere de cytoplasmatiske domener av reseptorer for å gi anerkjennelse nettsteder for ikke-fosforylerte statistikk monomerer. Når stats fosforyleres ved hjelp av aktiverte tyrosinkinaser etter binding, danner de homo eller hetero-dimerer via deres Src-homologi 2 (SH2) domene og raskt migrere inn i kjernen, hvor dimerer bindes til DNA-sekvensene til aktiv spesifikk gentranskripsjon [1] [2].
mange forsøk har vist at normale fysiske funksjoner av statistikk er avgjørende i å regulere mange aspekter av cellulær proliferasjon, differensiering, migrering og overlevelse. Blant alle de STAT familiemedlemmer, er STAT3 mest nært knyttet til celle overlevelse og spredning og tumorigenesis [3], [4]. Det er allment uttrykkes i de fleste vev, og er ansett som en potensiell onkogen. STAT3 er ofte konstitutivt aktiv i mange humane kreftceller, inkludert multippel myelom, glioblastom, leukemi, lymfom, bryst kreft, prostatakreft, lungekreft, og halskreft [5], [6], [7]. STAT3 kan aktiveres av flere cytokiner, inkludert IL-6, IL-11, ciliær neurotrofisk faktor, og leukemi-inhiberende faktor, som alle benytter gp130-type reseptorer. Interessant, kan STAT3 bidra til enten apoptose eller overlevelse i forskjellige organer og celletyper. Det kan fremme proliferasjon i hepatocytter [8], nerveceller [9], og T-celler [10], men er uunnværlig for apoptose i melke [11] og myeloide celler [12].
STAT3 er en latent transkripsjonsfaktor som ligger i cytoplasma. Ved aktivering av tyrosin fosforylering, Stat3 dimerizes, translocates til kjernen og binder seg til kjernefysiske DNA å modulere transkripsjon av målgener. STAT3 fosforylering er hovedsakelig mediert gjennom aktivering av ikke-reseptor-protein-tyrosin-kinase-familien av Jaks, som inkluderer mange medlemmer JAK1, JAK2, JAK3 og tyrosinkinase-2 [13], [14]. I tillegg kan den STAT3 fosforyleringen også være mediert av krysstale med c-Src-kinase [13], [14], [15]. De store fosforyleringsseter i STAT3 inkluderer tyrosin og serinresidua i posisjonene Tyr
705 og Ser
727, henholdsvis, som ligger i den trans domene. Aktiveringen av STAT3 resulterer i ekspresjon av mange målgener som kreves for tumorcelleoverlevelse (f.eks Bcl-X
L, Mcl-1 og Survivin), spredning (for eksempel cyklin D1 og c-myc) og angiogenese [f.eks vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF)], så vel som metastase [16]. Dermed har STAT3-signalveien vært en favoritt terapeutisk mål for legemiddelutvikling [17], [18].
gemcitabin (en nukleosid analog) viste mer klinisk nytte på kreft i bukspyttkjertelen pasienter sammenlignet med konvensjonelle medisiner [19 ]. Noen potente og selektive inhibitorer JAK3, f.eks CP690550, viste signifikant klinisk aktivitet i cancer [20], [21]. CP690550 representerer bare et utgangspunkt i jakten på en tryggere lite molekyl immunsuppressiv, og at en isozymselektrive JAK3 hemmer identifisert av rasjonell drug design kan være betydelig tryggere. I de senere år har mange ny innsikt blitt oppnådd i undersøkelsen på en rekke rensede forbindelser fra naturprodukter. For eksempel er EGCG den store catechin fra grønn te og har blitt anerkjent som en viktig chemopreventive agent og som modulatorer av svulst celle respons på kjemoterapi [22], [23], [24]. Det har blitt vist å inhibere celleproliferering [25], indusere apoptose [26] i tumorceller, forhindre angiogenese [27], modulere invasjon og migrasjon av kreft, og interferere med flere signalveier, inklusive nukleær faktor-kB signalveien [28], epidermal vekstfaktor-mediert reaksjonsvei [29], insulinlignende vekstfaktor-I signalveien [30], mitogen-aktivert protein kinase-avhengige reaksjonsveien [31], og proteasom-reaksjonsveien degradering [32].
i denne artikkelen, undersøkte vi effekten av EGCG på STAT3 signale i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler, og også vurdert den interaktive effekten av EGCG med gemcitabin eller JAK3 inhibitor CP690550 på deres terapeutiske potensial. Vi fant at EGCG hemmet ekspresjon av JAK3 og STAT3 (fosfo og total), STAT transkripsjon og aktivering, og ekspresjon av STAT3-regulerte gener, noe som resulterer i inhibisjon av celle motilitet, migrering og invasjon, og induksjon av caspase-3- og PARP splittelsene. Hemming av STAT3 av shRNA i kreft i bukspyttkjertelen celler forbedrer hemmende effekt av EGCG på cellemigrasjon og bevegelighet. Våre resultater viser at aktivering av STAT3 signalveien er kritisk for veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler og foreslår at EGCG målretting STAT3 signalering kan være et potensielt terapeutisk intervensjon for kreft i bukspyttkjertelen. Videre er kombinasjonen av EGCG med gemcitabin eller CP690550 hadde additiv /synergistiske effekter på celle-levedyktighet og apoptose.
Materialer og metoder
Cellelinjer og dyrkningsbetingelser
Humant kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer ASPC-1 og PANC-1 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA), og dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Thermo Scientific) og 1% antibiotisk-antimykotisk (Invitrogen) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 95% luft og 5% CO
2.
Cell transfeksjon
STAT3 shRNAs ble utformet ved hjelp BLOCK-iT ™ RNAi Designer (Invitrogen) sikret sjonsnummer ble hentet fra genbanken. Sekvensene til STAT3 shRNAs (aksesjonsnummer: NM_139276) er tilsvarende de kodende regionene 398-416 (5′- CCA CTT TGG TGT TTC ATA A-3), 1070-1088 (5′-CCCGTCAACAAATTAAGAA-3 «), 1448 -1466 (5»-GCC TCT CTG CAG AAT TCA A-3 «) og 1935-1953 (5′-GGA CAA TAT CAT TGA CCT T-3») nukleotider. ASPC-1 og PANC-1-celler ble transfektert med en blanding av shRNAs ved hjelp Lipofetamine 2000 (Invitrogen). Etter 24 timer med transfeksjon, ble cellene behandlet med EGCG. Celler ble brukt for celleviabilitet deteksjon, scratch analysen, QRT-PCR og Western blotting.
XTT analysen
Cells (1 × 10
4 i 200 mL kultur medium per brønn) var sådd ut i 96-brønners plate (flat bunn), behandlet med eller uten medikamenter og inkubert i forskjellige tidspunkter ved 37 ° C og 5% CO
2. Før slutten av forsøket, 50 ul XTT merking blanding (sluttkonsentrasjon, 125 uM XTT (natrium-2,3-bis (2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide indre salt) og 25 uM PMS (fenazin metosulfat) per brønn ble tilsatt, og platene ble inkubert i ytterligere 4 timer ved 37 ° C og 5% CO
2. den spektrofotometrisk absorbans av prøven ble målt ved anvendelse av en mikrotiterplate (ELISA) leser. Bølgelengden for å måle absorbans av formazon produktet var 450 nm, og referansebølgelengden var 650 nm.
caspase-3/7-analysen
Cells (3 × 10
4 per brønn ) ble sådd i en 96-brønns plate med 200 ul kulturmedium. Omtrent 16 timer senere ble cellene behandlet med forskjellige doser av EGCG. Casapse-3/7-aktivitet ble målt i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen).
Scratch analysen
ASPC-en kryptert og STAT3 shRNA celler ble sådd i 6 brønners retter. Når alle kulturer var 50% sammenflytende, ble et kors merket i midten av hver tallerken med 10 mL tips. Cellene ble vasket med PBS, og dyrket i friskt medium. De skrape Bildene ble tatt under en fluorescens mikroskop på 0, 24 og 48 timer for de samme stillingene etter at cellene ble behandlet med EGCG.
Transwell migrasjon analysen
For å bestemme effekten av EGCG på cellemigrering, ASPC-1 og PANC-1-celler ble sådd ut i toppen av kammeret på noncoated membran (24-brønns innsats, porestørrelse, 8 um; Corning Costar) ved en tetthet på 1 x 10
4 celler /brønn i RPMI-medium inneholdende 1% FBS, og tillatt å migrere mot RPMI-medium inneholdende 10% FBS i det nedre kammer. EGCG ble tilsatt til begge kamre for å oppnå en konsentrasjon på 0, 20, 40, 60 uM, respektivt. Etter 24 timer inkubering ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd og farget med krystallfiolett. De migrerte celler ble talt under et lysmikroskop (fire tilfeldige felt per brønn).
Transwell invasjon analysen
For å bestemme effekten av EGCG på celle invasjon, ASPC-en og PANC-1 celler ble sådd ut i toppen av kammeret på Matrigel belagte membran (24-brønns innsats, porestørrelse, 8 um; Corning Costar) i en tetthet på 1 x 10
4 celler /brønn i RPMI-medium inneholdende 1% FBS, og lov til å invadere mot RPMI-medium inneholdende 10% FBS i det nedre kammer. EGCG ble tilsatt til begge kamre for å oppnå en konsentrasjon på 0, 20, 40, 60 uM, respektivt. Etter 48 timers inkubering ikke-invaderte celler ble fjernet ved bomullsdott, og invaderte celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd og farget med krystallfiolett. Den invaderte celler ble tellet under et lysmikroskop (fire tilfeldige felt per brønn).
Transient transfeksjon og STAT3 reporter
ASPC-1 og PANC-1-celler ble dyrket i 100 mm skåler og transfektert 70% konfluent med pGreenfire1-STAT3 reporter plasmid hjelp Lipofetamine 2000 (Invitrogen). Etter 24 timer ble cellene behandlet med EGCG (0-80 uM). Etter inkubasjon av 24 timer, ble luciferase aktivitet bestemmes ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega), i henhold til produsentens instruksjoner på en multilabel plateleser (Wallac Victor, Perkin-Elmer).
RNA isolering og real -time RT-PCR
Total RNA ble isolert fra ASPC-en og PANC-1 celler ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen). RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av Nano Drop 2000 spektrofotometer. cDNA ble syntetisert og RT-PCR-reaksjoner ble utført ved anvendelse av Superscript II (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Sanntids-PCR ble utført på en Applied Biosystems 7300 real-time PCR System, ved bruk av følgende program: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 minutter, og deretter 40 sykluser med 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. PCR-primere ble kjøpt fra Realtimeprimers.com. Alle reaksjoner ble utført i triplikat, og den relative ekspresjon av mål-mRNA i hver prøve ble normalisert med den av midlere GAPDH
PCR-primere sekvenser:. GAPDH, forover primer 5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT – 3 «; revers primer 5’TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG -3 «; STAT3, forover primer 5’CCT TTG ACA TGG AGT TGA CC -3 «; revers primer 5’TAA AAG TGC CCA GAT TGC TC -3 «; Cyclin D1, forover primer 5’TTC AAA TGT GTG CAG AAG GA -3 «, reverse primer 5’GGG ATG GTC TCC TTC ATC TT -3»; c-myc, forover primer 5’CGA CGA GAC CTT CAT CAA AA -3 «, reverse primer 5’TGC TGT CGT TGA GAG GGT AG -3»; Survivin, forover primer 5’TCC CTG GCT CCT CTA CTG TT -3 «, reverse primer 5’TGT CTC CTC ATC CAC CTG AA -3»; VEGF, forover primer 5’AGA CAC ACC CAC CCA CAT AC -3 «, reverse primer 5’TGC CAG AGT CTC TCA TCT CC -3»; BclX
L frem primer 5’GCT CTC ACT CCC AGT CCA AA -3 «, reverse primer 5′-GCT GAG GCC ATA AAC AGC TC -3».
Immunofluorescent flekker
ASPC-1 og PANC-1-celler ble dyrket i RPMI medium inneholdende 10% FBS og behandlet med EGCG (0, 40, 60 pM) i 24 timer. Cellene ble deretter fiksert med 4% paraformaldehyd og farget med antistoffer mot STAT3 (monoklonalt muse-lgG1, cellesignalisering) ved 4 ° C over natten. Cellene ble vasket og på nytt inkubert med anti-muse-FITC-sekundært antistoff (Sigma) sammen med DAPI (0,5 ug /ml). Fargede objektglass ble montert sammen med monteringsmedium og visualisert under et fluorescensmikroskop. For bedre visualitet, ble fargen DAPI endret fra blått til rødt. Den grønne fargen representerer uttrykk for STAT3.
Western blotting-analyse
For å oppdage ulike proteiner, ASPC-en og Panc-1 celler behandlet med EGCG (0-60 mm) ble vasket med PBS og lysert i RIPA-buffer inneholdende 1 x protease inhibitor cocktail. Lysatene ble sentrifugert, og supernatanten ble oppsamlet. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved bruk av Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad). Proteinekstrakter (40 pg) ble separert på 12,5% SDS-PAGE. Overførte Membranene ble blokkert ved anvendelse av 5% fettfri tørrmelk og inkubert over natten med primære antistoffer ved 1:1,000 fortynninger i TBS, etterfulgt av sekundære antistoffer konjugert med pepperrot-peroksidase ved 1:5,000 fortynninger i TBS-Tween 20 i 1 time ved romtemperatur. Membraner ble utviklet ved hjelp av ECL substrat. Proteinbånd ble visualisert på X-ray film ved hjelp av en forbedret chemiluminescence system.
Statistisk analyse
Gjennomsnitt og SD ble beregnet for hver forsøksgruppe. Forskjeller mellom gruppene ble analysert ved en eller toveis ANOVA hjelp PRISM statistisk analyse programvare (GrafPad Software, Inc., San Diego, California). Signifikante forskjeller mellom gruppene ble beregnet til P . 0,05
Resultater
EGCG hemmer migrasjon og invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler og induserer caspase3 aktivitet
Det er vist at STAT3 spiller en viktig rolle i regulering av celle bevegelse ved regulering cytoskjelett omstilling og celle vedheft [33]. På grunn av sammenhengen mellom STAT3 og celle bevegelse, undersøkte vi effekten av EGCG på migrering og invasjon av ASPC-1 og PANC-1. Celler ble sådd ut i toppen av kammeret på noncoated membranen og Matrigel belagte membran for migrering og invasjon deteksjon, respektivt. Etter behandling av EGCG, ble de migrerte og invaderte celler farget og telles. Resultatene viser at de migrerte og invaderte bukspyttkjertelen celler redusert på en dose-avhengig måte (Fig. 1A og B). Disse data antydet at EGCG kan hemme migrering og invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler.
(A), Transwell migrasjonsanalyse. ASPC-1 og PANC-1-celler ble sådd ut i den øverste kammer i transwell og behandlet med EGCG (0-60 uM) i 24 timer. Celler migrert til den nedre kammer ble fiksert med metanol, farget med krystallfiolett og tellet. Data representerer middelverdi ± SD. * Eller ** = signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P 0,05. (B) Matrigel invasjon assay. ASPC-1 og PANC-1-celler ble platet ut på Matrigel-belagte membran i det øvre kammer av transwell og behandlet med EGCG (0-60 uM) i 48 timer. Celler invaderte til det nedre kammer ble fiksert med metanol, farget med krystallfiolett og tellet. Data representerer middelverdi ± SD. * Eller ** = signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P 0,05. (C), Caspase-3-aktivitet. ASPC-en og PANC-1 celler ble behandlet med EGCG (0-40 mm) i 48 timer, og caspase-3-aktivitet ble målt i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen). Data representerer middelverdi ± SD. * = Signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P 0,05. (D), ASPC-1 og PANC-1-cellene ble behandlet med EGCG (0-60 uM), med eller uten gemcitabin (0,5 pM) i 48 timer. Cellene ble høstet, og Western blot-analyse ble utført for å undersøke ekspresjon av PARP og caspase-3. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. PARP antistoffet gjenkjenner spaltede PARP, og caspase-3 antistoffet gjenkjenner spaltede /aktiv caspase-3.
Caspase-3 er et medlem av cystein-asparaginsyre protease (caspase) familie og aktivert i den apoptotiske celle både ytre (død ligand) og indre (mitokondrie) trasé [34]. EGCG indusert caspase-3 aktivitet på en doseavhengig måte i begge ASPC-1 og PANC-1-celler, som målt ved hjelp av fluorometrisk analyse (Fig. 1C). Disse data tyder på at EGCG kan indusere apoptose ved å aktivere caspase-3.
EGCG forsterker gemcitabin-indusert spalting av caspase3 og PARP i kreft i bukspyttkjertelen celler
PARP er normalt involvert i DNA-reparasjon, DNA stabilitet og andre cellulære hendelser, og spaltes av medlemmer av caspase familien under tidlig apoptose; Derfor, er det et substrat for caspase-aktivitet og en pålitelig markør for apoptose [35]. Vi neste undersøkt om EGCG og gemcitabin samhandle sammen for å kløyve caspase-3 og PARP i ASPC-1 og PANC-1 celler. EGCG og gemcitabin alene indusert spaltning av caspase-3 i begge cellelinjene. Videre er kombinasjonen av EGCG med gemcitabin induserte signifikant mer caspase-3 spaltning enn enkelt middel alene (figur 1D.). EGCG og gemcitabin alene viste PARP-spaltning i ASPC-1 og PANC-1-celler. Til sammenligning, er kombinasjonen av EGCG med gemcitabin resulterte i en forbedret PARP spaltning. Disse data tyder på at EGCG kan indusere apoptose av caspase-3-aktivering og PARP cleavage.
EGCG hemmer JAK3 /STAT3 sti i bukspyttkjertelkreft
Vi neste undersøkte effekten av EGCG på uttrykk for STAT3, fosforylering av STAT3 og JAK3, og atom ekspresjon av fosfo-STAT3 i ASPC-1 og PANC-1-celler. For å undersøke effekten av EGCG på STAT3 uttrykk, utførte vi QRT-PCR-analyse (Fig. 2A).
(A), ASPC-1 og PANC-1 celler ble behandlet med EGCG (0-60 mm) i 48 timer, og ekspresjon av STAT3 ble målt ved Q-RT-PCR. Data representerer middelverdi ± SD. * Eller ** = signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P 0,05. (B), ble ASPC-1 og PANC-1-celler behandlet med EGCG (0-60 uM) i 48 timer. Ekspresjonen av STAT3, p-STAT3, JAK3 og p-JAK3 ble målt ved Western blot-analyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (C) Ekspresjon av STAT3 i ASPC-1 og PANC-1-celler. Celler ble behandlet med EGCG (0-60 uM) i 48 timer. Etter inkubasjonen ble ekspresjonen av STAT3 målt ved immunoflurescence. DAPI ble anvendt for å farge kjerner. For bedre visualitet, ble fargen DAPI endret fra blått til rødt. Den grønne fargen representerer uttrykk for STAT3. Rød farge = kjerner.
EGCG hemmet uttrykk for STAT3 mRNA i begge ASPC-1 og PANC-1 celler. Deretter ble ekspresjon av total og fosforylert JAK3 og STAT3 ved Western blot-analyse (Fig. 2B). EGCG hemmet fosforyleringen av både JAK3 og STAT3 på en doseavhengig måte i ASPC-1 og PANC-1-celler. Overraskende ekspresjon av både JAK3 og STAT3 ble også inhibert av EGCG. Disse data tyder på at EGCG kan hemme uttrykket av JAK3 og STAT3, samt deres post-oversettelse modifikasjon.
Siden STAT3 er konstitutivt aktiv i kreft i bukspyttkjertelen celler, vi neste undersøkt effekter EGCG på STAT3 uttrykk ved immunfluorescens . Som vist på fig. 2C, EGCG hemmet ekspresjon av STAT3 (tilstedeværelse av den grønne farge) på en doseavhengig måte i begge cellelinjene. Disse dataene antyder at hemming av apoptose av EGCG er forbundet med undertrykkelse av JAK3 /STAT3 sti.
EGCG hemmer STAT3 transkripsjon og uttrykk for Stat3 regulerte gener
STAT3 regnes som et onkogen fordi det er korrelert med tumorgenese [7]. Derfor er det nødvendig å bestemme virkningen av EGCG på STAT transkripsjonen aktivitet. Kreft i bukspyttkjertelen celler ble transfektert med pGreen fire1-STAT3 reporter plasmid og behandlet med EGCG (0-80 mm). Etter inkubering i 24 timer, ble luciferase-aktivitet bestemt ved reporter assay. Som vist på fig. 3A, EGCG hemmet STAT3 transkripsjonen aktivitet på en doseavhengig måte i bukspyttkjertelcancer ASPC-1 og PANC-1-celler.
(A), STAT3 aktivitet. ASPC-1 og PANC-1-celler ble transfektert med pGreenfire1-STAT3 reporter plasmid. Celler ble behandlet med EGCG (0-80 uM). Etter inkubasjon av 24 timer ble luciferase aktivitet bestemmes ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem, ifølge produsentens instruksjoner på en multilabel plateleser. Data representerer middelverdi ± SD. * = Signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P 0,05. (B), VEGF, Bcl-X
L, c-Myc, Survivin og Cyclin D1 ble påvist ved QRT-PCR. Data representerer middelverdi ± SD. * = Signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P . 0,05
Tidligere studier har vist at STAT3 kan regulere ekspresjonen av mange genprodukter er involvert i proliferasjon, celleoverlevelse, angiogenese og anti-apoptose [7] . For eksempel VEGF, Bcl-X
L, c-myc, Survivin og cyclin D1 er regulert av STAT3 aktivering [17], [36]. Som illustrert i fig. 3B, STAT3-regulerte gener, c-myc, Survivin og Cyclin D1 ble hemmet av EGCG i ASPC-en og PANC-1 celler. EGCG også redusert uttrykk for VEGF i ASPC-1 celler, og BCL-X
L i PANC-1 celler. Disse data viser at EGCG kan hemme ekspresjonen av STAT3-regulerte gener i kreft i bukspyttkjertelen celler. Disse STAT-3 målgener er blitt vist å regulere celleproliferasjon, cellesyklus, apoptose og angiogenese.
Inhibering av STAT3 forsterker de inhiberende virkninger av EGCG på celle motilitet og levedyktighet i kreft i bukspyttkjertelen celler
i dette arbeidet ble STAT3 shRNA brukt til taushet STAT3 genuttrykk i ASPC-en og PANC-1 celler. STAT3 shRNA hemmet ekspresjon av STAT3 i begge ASPC-1 og PANC-1-celler som demonstrert ved Western blot-analyse (Fig. 4A). For å undersøke effekten av EGCG på kreft i bukspyttkjertelen celler, scratch og Celleviabilitet analysene ble utført ved hjelp av både kryptert og STAT3 shRNA celler. I bunnen av analysen ble de inhiberende virkninger av EGCG på migrering av ASPC-1-celler forsterkes ved å hemme STAT3 genekspresjon (Fig. 4B). EGCG og STAT3 shRNA alene redusert prosent av levedyktige ASPC-1 og PANC-1-celler på en doseavhengig måte (fig. 4C). Interessant, inhiberende virkninger av EGCG på cellelevedyktigheten ble ytterligere forbedret ved STAT3 shRNA i begge cellelinjene.
(A), ASPC-1 og PANC-1 ble transfektert med STAT3 shRNA. Ekspresjon av STAT3 ble utført ved Western blotting. (B), ASPC-1 bunnen av analysen. ASPC-en kryptert og STAT3 shRNA-celler ble dyrket i 6-brønners skåler. Den grunnen var merket når rettene var 50% sammenflytende. Bildene ble tatt etter at cellene ble behandlet med EGCG og inkubert i 0, 24 og 48 timer. (C), Celleviabilitet analysen. ASPC-1 og PANC-1 (scrambled og STAT3 shRNA) celler ble sådd og behandlet med EGCG (0, 20, 40, 60 uM). Etter 72 timers behandling, ble cellelevedyktigheten utført ved XTT-assay. Data representerer middelverdi ± SD. * Eller ** = signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P . 0,05
Vi neste undersøkte effekten av STAT3 shRNA om regulering av STAT3-målgener av EGCG. EGCG hemmet ekspresjon av STAT3-regulert gen Cyclin D1 i både ASPC-1 /kryptert og PANC-1 /egge-celler (fig. 5 og b). STAT3 shRNA fullstendig hemmet ekspresjon av cyclin D1 i begge bukspyttkjertelcancercellelinjer i nærvær eller fravær av EGCG. EGCG også hemmet han ekspresjon av Bcl-X
L og c-Myc i PANC-1 /eggeceller. BCL-X
L og c-myc ble også hemmet i PANC-1 /STAT3 shRNA celler sammenlignet med Panc-1 /Egge celler. Imidlertid EGCG var ute av stand til ytterligere å inhibere ekspresjonen av Bcl-X
L og c-Myc i PANC-1 /STAT3 shRNA-celler. Disse data tyder på at EGCG kan regulere kreft i bukspyttkjertelen celle motilitet og levedyktighet som er forbundet med STAT3 svei.
(A), ASPC-1 /kryptert og ASPC-1 /STAT3 shRNA-celler ble behandlet med eller uten EGCG ( 60 uM) i 48 timer. Ekspresjon av cyclin D1 ble målt ved Q-RT-PCR. Data representerer middelverdi ± SD. * = Signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P 0,05. (B), PANC-1 /kryptert og PANC-1 /STAT3 shRNA-celler ble behandlet med eller uten EGCG (60 uM) i 48 timer. Ekspresjon av cyclin D1 ble målt ved Q-RT-PCR. Data representerer middelverdi ± SD. * = Signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P 0,05. (C), PANC-1 /kryptert og PANC 1 /STAT3 shRNA-celler ble behandlet med eller uten EGCG (60 uM) i 48 timer. Ekspresjonen av Bcl-X
L ble målt ved QRT-PCR. Data representerer middelverdi ± SD. * = Signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P 0,05. (D), PANC-1 /kryptert og PANC-1 /STAT3 shRNA-celler ble behandlet med eller uten EGCG (60 uM) i 48 timer. Den ekspresjon av c-myc ble målt ved Q-RT-PCR. Data representerer middelverdi ± SD. * = Signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P . 0,05
gemcitabin synergizes med EGCG å hemme cellenes levedyktighet og indusere apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler
Gemcitabin har dukket opp som en populær kjemoterapeutisk middel i behandling av avansert og metastatisk kreft i bukspyttkjertelen, og fordelen med denne mono er liten, men signifikant i forbedring av median total overlevelse [19]. For å teste effekten av gemcitabin med EGCG på celle-levedyktighet, ble kreft i bukspyttkjertelen celler behandlet med gemcitabin (0,5 uM), med eller uten økende konsentrasjoner av EGCG (0-60 uM) i 72 timer. Som vist på fig. 5A, celle-levedyktighet ble inhibert med EGCG og gemcitabin alene, og den inhiberende effekt av gemcitabin på cellelevedyktigheten ble ytterligere forbedret ved EGCG i disse to cellelinjer (Fig. 6A).
(A), ASPC-1 og PANC-1-cellene ble behandlet med EGCG (0, 20, 40, 60 uM), med eller uten gemcitabin (0,5 pM) i 72 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av XTT-assay. Data representerer middelverdi ± SD. * Eller ** = signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P 0,05. (B), ble ASPC-1 og PANC-1-celler behandlet med EGCG (0, 20, 40, 60 uM), med eller uten gemcitabin (0,5 pM) i 72 timer. Apoptose ble målt ved TUNEL assay. Data representerer middelverdi ± SD. * Eller ** = signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P 0,05. (C) Inhibering av STAT3 målgener ved EGCG og gemcitabin. ASPC-1 og PANC-1-cellene ble behandlet med EGCG (20 uM) eller gemcitabin (0,5 pM) i 48 timer. Uttrykket av VEGF, ble c-myc, Survivin og cyclin D1was målt ved QRT-PCR. Data representerer middelverdi ± SD. * = Signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P . 0,05
Vi neste undersøkte den interaktive effekten av EGCG med gemcitabin på apoptose i begge ASPC-en og PANC-en cellelinjer (figur 6B.). EGCG indusert apoptose i begge cellelinjene på en doseavhengig måte. Tilsvarende, gemcitabin indusert apoptose i begge ASPC-1 og PANC-1-celler. Alle dosene av EGCG ytterligere forbedret effekt av gemcitabin på apoptose. Disse data tyder på at EGCG kan bli kombinert med gemcitabin, for å behandle kreft i bukspyttkjertelen pasienter.
ved siden undersøkte virkningene av EGCG og gemcitabin på ekspresjon av c-myc og cyclin D1 i ASPC-1 og PANC-1-celler (fig. 6C). EGCG og gemcitabin alene inhiberte ekspresjon av VEGF, c-Myc, Survivin og cyklin D1was i begge cellelinjene. Kombinasjonen av EGCG og gemcitabin hadde additive effekter på disse målgener. Disse data tyder på at EGCG kan forsterke den terapeutiske potensialet av gemcitabin i bukspyttkjertelen kreftceller ved å hemme STAT3.
JAK3 inhibitor CP690550 hemmer celle levedyktighet i kreft i bukspyttkjertelen celler
CP690550 er en roman JAK3 hemmer og forventet å målrette JAK3, som uttrykkes vanligvis bare i immunceller og er kun bundet av gamma-kjede-bærende cytokinreseptorer som er involvert i JAK /STAT-signalveien [37]. Vi neste undersøkte effekten av CP690550 på cellelevedyktigheten i ASPC-1 og PANC-1-celler (Fig. 7). CP690550 hemmet celleviabilitet i begge cellelinjene på en doseavhengig måte. Disse data tyder på at CP690550 kan være et potensielt anticancer medikament for behandling av kreft i bukspyttkjertelen.
(A), ASPC-1-celler ble sådd ut i 96-brønners plater på 4 x 10
4 celler per brønn og behandlet med CP690550 (0-15 uM) i 72 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av XTT-assay. Data representerer middelverdi ± SD. * = Signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (B), ble PANC-1-celler sådd ut i 96-brønners plater på 4 x 10
4 celler per brønn og behandlet med CP690550 (0-15 uM) i 72 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av XTT-assay. Data representerer middelverdi ± SD. * = Signifikant forskjellig fra kontrollen, P . 0,05
CP690550 synergizes med EGCG å hemme cellenes levedyktighet i kreft i bukspyttkjertelen celler
Siden CP690550 indusert apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler, vi neste søkt for å undersøke de interaktive effektene av CP690550 og EGCG på cellelevedyktigheten og apoptose av kreft i bukspyttkjertelen celler (fig. 8). Som vist på fig.
