Abstract
Cisplatin (
cis
-diamminedichloroplatinum, CDDP) er et velkjent kjemoterapeutisk middel for ved behandling av en rekke kreftformer. Men den nøyaktige mekanisme liggende apoptose av kreftceller indusert ved CDDP er fortsatt uklar. I denne studien viser vi mekanistisk at CDDP induserer GM3-mediert apoptose av HCT116-celler ved å hemme celleproliferasjon, og øker DNA-fragmentering og mitokondrier-avhengig apoptose signaler. CDDP indusert apoptose i celler via generering av reaktive oksygenarter (ROS), reguleres den ROS-mediert ekspresjon av Bax, Bcl-2, og p53, og induserte nedbrytning av poly (ADP-ribosyl) polymerase (PARP). Vi har også sjekket ekspresjonsnivåer av forskjellige gangliosider i HCT116-celler i nærvær eller fravær av CDDP. Interessant, blant gangliosidene, CDDP forsterket ekspresjon av bare GM3 syntase og dens produkt GM3. Reduksjon av GM3-syntase-nivå gjennom ektopisk ekspresjon av GM3 liten interfererende RNA (siRNA) reddet HCT116-celler fra CDDP-indusert apoptose. Dette ble vist ved inhibering av apoptotiske signaler ved å redusere ROS produksjon gjennom regulering av 12-lipoxigenase aktivitet. Videre apoptotiske følsomhet for CDDP ble merkbart øket i GM3-syntase-transfekterte HCT116-celler sammenlignet med kontroller. I tillegg GM3-syntase-transfekterte celler behandlet med CDDP oppviste en økt akkumulering av intracellulært ROS. Disse resultatene antyder den CDDP-indusert oksidativ apoptose av HCT116-celler formidles av GM3
relasjon:. Chung-T-W, Choi H-J, Kim S-J, Kwak C-H, Song K-H, Jin U-H, et al. (2014) gangliosidet GM3 er assosiert med cisplatin-indusert apoptose i Human Colon kreftceller. PLoS ONE 9 (5): e92786. doi: 10,1371 /journal.pone.0092786
Redaktør: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, USA
mottatt: 02.07.2013; Godkjent: 25 februar 2014; Publisert: 14. mai 2014
Copyright: © 2014 Chung et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den nåværende studien er støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av Kunnskapsdepartementet, Science and Technology (MEST) Korea (NRF-2013R1A1A2005387) og personlig Tumor Engineering Research Center stipend (2008- 0062611). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cisplatin (
cis
-diamminedichloroplatinum, CDDP) er et vanlig kjemoterapeutisk middel for behandling av flere solide tumorer. CDDP binder seg til DNA for å generere DNA-addukter [1]. Tidligere studier har vist at CDDP regulerer aktiviteten av visse ionekanaler, transportproteiner og diverse plasmamembranenzymer [2], [3], og induserer reaktive oksygenarter (ROS) i løpet av kreft kjemoterapi [4]. Derfor CDDP regulerer DNA-reparasjon, transkripsjonshemming, cellesyklus og apoptose [5]. Det har blitt rapportert at de ekstracellulære signalregulerte kinaser (ERK), c-Jun N-terminale kinaser (JNKs) /spenning-aktivert protein kinase (SAPK) og p38-mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) er aktivert i CDDP -indusert apoptose av kreftceller [6], [7]. I tillegg induserer CDDP Fas /Fasl-mediert apoptose i humane epitelceller [8] og mitokondriell skade ved å regulere ekspresjonsnivåer av Bcl-2-familien, som har enten pro- eller anti-apoptotiske funksjoner. Ved å påvirke CDDP cytotoksisitet i kreftceller, p53-mediert transaktivering av de pro-apoptotiske Bax, redusert Bcl-2-ekspresjon og spaltning av bud fører til en reduksjon i mitokondriell potensial og øker caspase-mediert PARP degradering ved frigjøring av cytokrom c fra mitokondrier [9] – [12]. Flere studier har rapportert at disse apoptotiske fenomener er på grunn av endring av membransammensetningen [13]. Blant de membrankomponenter, er det blitt rapportert at ekspresjonsnivåene av gangliosider er endret hos medikamentbehandlede cancerceller [14].
klynger sialinsyre-inneholdende glykosfingolipider (GSLs) er allestedsnærværende i membranen microdomain i alt pattedyrceller og er involvert i et bredt spekter av biologiske funksjoner, inkludert celle-celleinteraksjoner og signaloverføring [15]. Mange studier har rapportert at spesifikke gangliosider som GM3, GD3, og GD1b indusere apoptose i forskjellige typer celler [16], [17]. GM3 behandling i umoden prolifererende gliale og neuronale celler resulterer i suppresjon av celleproliferasjon og induksjon av apoptose [18], [19]. I tillegg er GM3 involvert i celledød gjennom akkumulering av ROS og intracellulært kalsium-ion innstrømning inn i de neuronale celler [20], [21]. I murine blærekreftceller, induserer apoptose GM3 overekspresjon og reduserer malignitetspotensiale [22]. I denne studien undersøkte vi den funksjonelle betydningen av gangliosid GM3 i CDDP-behandlede kolorektal kreft celler.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
Den menneskelige tykktarmskreft cellelinje HCT116 ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; JBI, Daegu, Korea) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter /ml penicillin og ved 37 ° C, 100 mikrogram /ml streptomycin under 5% CO
2. Cisplatin ble kjøpt fra Dong-A farmasøytisk CO., LTD (Seoul, Korea).
N
acetyl-
L-cystein (NAC) ble oppnådd fra Molecular Probes ™ (Invitogen, CA). Baicalein var fra Sigma-Aldrich. Antistoffer ble oppnådd som følger: Anti-poly (ADP-ribosyl) polymerase (PARP), BCL-2, Bax, og p53 ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-glyseraldehyd-3-phosphode-hydrogenase (GAPDH) ble kjøpt fra Chemicon (Temecula, LA). Anti-GM3 (M2590) ble anskaffet fra Biotest Laboratories (Japan).
Revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
Total RNA fra hver celle ble isolert ved anvendelse av Trizol reagens ( Invitrogen). En mikrogram av RNA ble utsatt for revers transkripsjon med oligo dT primere bruker AccuPower RT-premiks (Bioneer Co, Daejon, Korea), i henhold til produsentens protokoll. CDNA ble amplifisert ved PCR med følgende primere ved bruk av EF-Taq-polymerase (SolGent, Seoul, Korea): GM3 syntase (413 bp) 5′-CCCTGCCATTCTGGGTACGAC-3 «(sense) og 5′-CACGATCAATGCCTCCACTGAGATC-3′ (antisense ); GD3-syntase (460 bp) 5»-TGTGGTCCAGAAAGACATTTGTGGA-3 «(sense) og 5′-TGGAGTGAGGTATCTTCACATGGGT-3′ (antisense) GalNAc-T (GM2 /GD2-syntase) (230 bp) 5»-CCAACTCAACAGGCAACTAC-3 «( forstand) og 5»-GATCATAACGGAGGAAGGTC-3 «(antisense); β-aktin (247 bp) 5»-CAAGAGATGGCCACGGCTGCT-3 «(sense) og 5′-TCCTTCTGCATCCTGTCGGCA-3» (antisens). Bruken av like mengder av mRNA i RT-PCR-analyse ble bekreftet ved å analysere uttrykket nivåer av β-aktin. PCR-produktene ble separert ved gel elektroforese på 1,5% agarose-inneholdende etidiumbromid med 0,5 x Tris-acetat-EDTA (TAE) -buffer.
Celleviabilitet assay
celle proliferasjon ble undersøkt ved anvendelse av en kommersielt tilgjengelig spredning kit II (XTT; Boehringer Mannheim, Mannheim, Tyskland). I korthet ble cellene sub-dyrket i 96-brønns kulturplater med en tetthet på 103 celler /brønn i 100 pl DMEM /10% FBS. Etter 24 timers inkubasjon ble mediet fjernet og erstattet med 100 ul friskt medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av CDDP. Platene ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO2 i 12 timer. Ved slutten av inkubasjonen ble 50 ul av XTT-testoppløsningen fremstilles ved å blande 5 ml av XTT-merking reagens og 100 ul av elektron-koblingsreagens, som ble tilsatt til hver brønn. Etter 4 timers inkubering ved 37 ° C og under 5% CO2-forhold, ble absorbansen målt ved anvendelse av en ELISA-leser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ved en testbølgelengde på 490 nm.
Strømningscytometrisk estimert intracellulære redoks statlige
ROS produksjon ble evaluert ved farging celler med dichlorodihydrofluorescein diacetate (H
2DCFDA, molekylære prober, Carlsbad, California). Cellene ble vasket to ganger med DMEM inneholdende 10% FBS, inkubert i 10 uM H
2DCFDA fortynnet i DMEM i 20 minutter ved 37 ° C, vasket med PBS, og trypsinisert. Dissosierte celler ble vasket to ganger med iskald PBS, resuspendert i PBS, og analysert ved flowcytometri hjelp FACS Calibur (Becton Dickinson, Mountain View, California).
Western blot analyse
Celler ble homogenisert i en buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,02% NaN
3, 100 mikrogram /ml fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 1 ug /ml aprotinin og 1% Triton X- 100. Proteinkonsentrasjoner ble målt ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse (Bio-Rad, Richmond, CA). Tretti-mikrogram av totalt cellelysat ble størrelsesfraksjonert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE) og overført til nitrocellulosemembraner ved hjelp av Hoefer Elektro-system (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). For å oppdage målet proteiner, inkuberes vi membraner med de respektive antistoffer. Deteksjon ble utført ved hjelp av sekundær pepperrotperoksidase bundet anti-mus og anti-kanin antistoffer (Santa Cruz) og ECL chemiluminescence system (Amersham Biosciences).
Over-uttrykk for gangliosid GM3 syntase og dets produkt i HCT116 cellene
Å konstruere GM3-syntase-ekspresjonsplasmidet, et 1,1 kb DNA-fragment inkludert den menneskelige GM3-syntase-kodende region ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av primer oligonukleotider 5′-CTAAGCTTATGAGAAGGCCCAGCTTGTTATTAAAAGACATC-3 «(sense), 5»-ATGAATTCGTTCAAAATTCACGATCAATGCCTCCACTGAGATC-3- «(antisens) og human føtal hjerne cDNA som et templat. Sanse og antisensprimere inneholde
Hind
III og
Eco
RI restriksjonsseter (understreket), henholdsvis. Fragmentet ble renset fra en 1% agarosegel ved hjelp av veiviseren SV Gel og PCR rensesystemer (Promega) og spaltet med passende restriksjonsenzym, og ligert ved anvendelse av T4 ligase (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) i en pcDNA3 vektor, for å generere pcDNA-GM3. Å identifisere konstruksjon med GM3 syntase gen, ble restriksjonskartlegging og DNA-sekvensering utført. HCT116-celler ble sådd ut på 6-brønners plater ved tetthet på 10
5-celler /brønn og dyrket over natten. Cellene ble transfektert med en mikrogram pcDNA og pcDNA-GM3 plasmid ved WelFect-EX ™ PLUS-metoden (JBI). Etter inkubering de transfekterte cellene ble dyrket i nærvær av 500 ug /ml G418 (Life Technologies, Inc.). Etter 21 dager i selektivt medium, ble individuelle G418-resistente kolonier isolert. Tre positive kloner uttrykker GM3 syntase for høye nivåer, som bestemmes av RT-PCR, ble brukt for videre analyse.
Luciferase assay
Reporter plasmider, pGL3-1600 ble utarbeidet av innsetting av
Sac
i /
Bgl II
fragmenter fra hvert av plasmidene som genereres tidligere [23] inn i de tilsvarende områder av promoter-mindre luciferase vektor pGL3-Basic (Promega). Celler ble sådd ut på 6-brønners plater ved tetthet på 10
5-celler /brønn og dyrket over natten. Celler ble ko-transfektert med 0,5 pmol av GM3-syntase-promotor-luciferase reporter-konstruksjoner og 0,5 ug av β-galaktosidase plasmidet ved WelFect-EX ™ PLUS-metoden (JBI). Celler ble dyrket i medium inneholdende 10% FBS og inkubert med CDDP i 12 timer. Luciferaseaktivitet og β-galaktosidase-aktivitet ble analysert ved hjelp av luciferase og β-galaktosidase-enzym analysesystem (Promega). Luciferase-aktivitet ble normalisert til den β-galaktosidase-aktivitet i cellelysatet og den gjennomsnittlige ble beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter.
immunfluorescens-mikroskopi
HCT116 tykktarmskreft-celler ble sådd ut ved en sub-konfluent tetthet på 12 mm- diameter sterile dekkglass i seks-brønners vevkulturplater. Celler ble fiksert i 3,7% formaldehyd /PBS og vasket tre ganger med PBS og permeabilisert deretter i 0,5% Tween-20 /PBS i 5 minutter ved romtemperatur. Ikke-spesifikke seter ble deretter blokkert med PBS inneholdende 1% bovint serumalbumin i 30 minutter ved romtemperatur med forsiktig vugging. Deretter ble en løsning av GM3 (M2590), GD3 eller GM2-spesifikke antistoffer flommet over cellene ved 4 ° C over natten. Etter vasking med PBS ble cellene ytterligere inkubert med FITC-konjugert anti-mus-IgM i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av vasking med PBS, og endelig montert i anti-fade-reagens (Molecular Probes) inneholdende 4 «, 6-iamidino- 2-phenylindole (DAPI). Platene ble analysert ved bruk av et Nikon fluorescens mikroskopi (Nikon, Japan). Den pre-absorbert sekundært antistoff alene ble også inkludert som en negativ kontroll til eksperimentet.
DNA fragmenteringsanalyse
De dyrkede celler ble høstet, vasket med PBS, lysert i buffer (10 mM Tris -HCI (pH 7,4), 10 mM EDTA, 0,5% Triton X-100), og inkubert på is i 10 min. Prøvene ble sentrifugert ved 4 ° C i 10 minutter, og supernatanter ble inkubert med 200 pg /ml RNase A ved 37 ° C i 1 time. Deretter ble prøvene inkubert med 200 pg /ml protease K ved 50 ° C i 30 minutter. Etter utfelling med isopropanol, ble DNA resuspendert i en Tris-EDTA-oppløsning. Prøvene ble løst ved elektroforese på en 2% agarosegel og visualisert ved etidiumbromidfarging og UV transillumination.
Flowcytometrisk analyse av apoptotiske celler
For å identifisere apoptotiske celler, pcDNA- eller pcDNA-GM3 -transfectaed HCT116-celler behandlet med CDDP i 24 timer. Prøvene ble vasket med PBS, farget med 1 pg /ml FITC-Annexin V (BD Pharmingen, San Diego, CA) i 10 minutter i mørket ved romtemperatur og analysert ved hjelp av strømningscytometri ved anvendelse av en FACS Calibur instrument (Becton-Dickinson )
HPTLC analyse av gangliosider
gangliosider fra humane tykktarmkreftceller behandlet med eller uten CDDP (1,5 × 10
7 celler) ble ekstrahert med kloroform. metanol: vann (2: 1:0.4, v /v /v), og ble fraksjonert og analysert ved HPTLC anvendelse av silikagel 60-plater (Merck). Platene ble utviklet med kloroform: metanol: 0,2% vandig CaCl
2 (55:45:10, v /v /v). Gangliosider ble visualisert ved å spraye platen med resorcinol-reagens hydroklorid.
Fremstilling og transfeksjon av små interferens rnas (sirnas)
An siRNA tosidig utformet for å målrette den kodende sekvens av humant GM3 syntase mRNA og plante klorofyll a /b-bindende protein-mRNA som en negativ kontroll ble syntetisert ved Bioneer Corporation. De målsekvenser for GM3-syntase sirnas er 5′-GUAUGUAACGAUGUUGUAU-3 «, 5′-CAUCAAAGAGACUGCCUUU-3′, og 5»-CAGGUAUAGCGUGGACUUA-3 «. HCT116 tykktarm kreft celler ble transfektert med GM3 syntase sirnas og negativ kontroll siRNA henholdsvis ved hjelp WelFect-EX ™ PLUS (JBI), i henhold til produsentens instruksjoner. En dag etter transfeksjon, ble transfeksjon komplekser fjernet og erstattet med kulturmedium. Etter inkubasjon med CDDP i dyrkingsmedium for 24 timer, ble de transfekterte celler brukes for videre analyse.
Resultater
CDDP induserer apoptose gjennom oppbygging av ROS
For å bestemme evnen til CDDP til å indusere apoptose i HCT116-celler, ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av CDDP i 24 timer, og DNA isolert fra CDDP-behandlede HCT116-celler ble oppløst ved elektroforese. Som vist på fig. 1, CDDP indusert DNA-fragmentering. Vi undersøkte også effekten av CDDP på mitokondrier-avhengig apoptose signaler og ekspresjon av p53 i løpet av CDDP-indusert apoptose. Behandling av HCT116-celler med CDDP resulterte i økning av p53 og Bax ekspresjon, så vel som reduksjon av Bcl-2-ekspresjon. Videre CDDP behandlingen resulterte i øket spaltning av PARP, noe som indikerer caspaseaktivering ved frigjøring av cytokrom c gjennom reduksjon av mitokondriemembranpotensialet (fig. 1B). Da genereringen av ROS er blitt rapportert å spille en viktig rolle i CDDP-indusert cytotoksisitet [24], ble effekten av CDDP behandling på intracellulær redoks-status av HCT116-celler bedømt. Vi sammenlignet produksjonen av ROS i CDDP-behandlede celler til at i CDDP-ubehandlede celler ved flowcytometrisk analyse ved hjelp av H
2DCFDA. Som vist på fig. 1C, ROS produksjonen ble økt i CDDP- behandlede celler sammenlignet med CDDP- ubehandlede celler. Men samtidig behandling med NAC, en ROS-inhibitor, sammen med CDDP reduserte akkumulering av intracellulært ROS (Fig. 1C). Korrelert med hemmende evne til å indusere ROS, NAC var også i stand til å hemme celledødssignaler i nærvær av CDDP, som vist ved Western blotting. Som vist på fig. 1D, CDDP indusert ekspresjon av de apoptotiske proteiner Bax og p53 samt indusert PARP-spaltning og den reduserte ekspresjon av anti-apoptotiske Bcl-2-protein. Disse effektene av CDDP på humane tykktarm kreft celler ble blokkert av NAC. Disse resultater indikerer at generering av ROS med CDDP er nødvendig for apoptose av HCT116-celler.
(A) Etter behandling av CDDP ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer, ble genomisk DNA isolert og separert ved elektroforese på en 2% agarosegel. DNA ble farget med etidiumbromid og visualisert under UV-lys. (B) Totalt protein fra HCT116-celler ble isolert, og immunblotanalyse ble utført med de angitte antistoffer. (C) HCT116-celler behandlet med eller uten 30 mg /ml CDDP etter forbehandling med 10 nM NAC, etterfulgt av utskifting av kulturmediet med nylaget medium inneholdende 10 uM DCFH-DA. Etter 30 minutters inkubering ved 37 ° C, ble fluorescensintensiteten målt ved strømningscytometri. Resultater representerer dobling fra sine respektive kontroller (celler ikke behandlet med CDDP), ansett som 1. Data representerer gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige målinger.
*** P 0,001 vs. CDDP behandlede kontroll. (D) HCT116-celler behandlet med eller uten CDDP (30 ug /ml) etter forbehandling av NAC (10 nM). Protein ble isolert fra cellene og analysert ved immunoblotting ved bruk av angitte antistoffer. GAPDH ble inkludert som en intern kontroll.
CDDP øker gangliosid GM3 i tykktarm kreft celler
Tidligere studier har rapportert at celle apoptose er forårsaket av endring av membranen sammensetning [13], [14] .Vi undersøkt om CDDP i HCT116 cellene regulerer uttrykk nivåer av GM2 og GD3 syntase gener og gangliosidene av GM2 og GD3, men det var ingen endringer både i parametrene av genuttrykk (data ikke vist) og gangliosid produksjon (fig . 2D). CDDP øket ekspresjon av GM3-syntase bare i CDDP-induserte HCT116-celler (Fig. 2A). I tillegg til dette, også undersøkte vi hvorvidt CDDP induserer ekspresjon av GM3-syntase ved hjelp av andre tykktarmskreftceller, slik som DLD-1, LoVo, og WiDr. CDDP behandling resulterte i økt ekspresjon av GM3-syntase i andre humane koloncancer cellelinjer (data ikke vist). Vi har videre undersøkt hvorvidt ekspresjon av GM3 syntase i foreliggende modell av human kolon kreft HCT116-celler induseres ved bruk av andre kjemoterapeutiske midler (5-fluorouracil og Doxorubicin) som er godt kjent for å indusere apoptose av forskjellige humane cancerceller, samt tykktarmskreftceller. Ekspresjon av GM3-syntase ble ikke indusert av både anti-kreftmidler (data ikke vist). Som vist på fig. 2A, ble mRNA nivåer av GM3 syntase økt i HCT116-celler indusert av CDDP, som dokumentert av RT-PCR. I tillegg, undersøkte vi hvorvidt promoteraktivitet av GM3-syntase-genet blir stimulert i CDDP-induserte HCT116-celler. Nylig har vi rapporterte CREB-medierte transkripsjonsregulering av det humane GM3-syntase-genet [23]. Derfor, for å bestemme GM3 syntase gen promoter aktivitet av CDDP, GM3 syntase gen promoter (pGL3-1600), ble CREB mutasjon av GM3 syntase promoter (pGL3-1600 CREB Mu) og pGL3-grunnleggende plasmider transfektert inn HCT116-celler med eller uten CDDP henholdsvis, etterfulgt av måling av luciferaseaktiviteten ved hjelp av et reporter-analyse. Som vist på fig. 1B, den transkripsjonelle aktivitet av pGL3-1600 i HCT116-celler behandlet med CDDP var signifikant høyere enn i de ubehandlede kontrollcellene, og de pGL3-basis transfektert HCT116-celler med eller uten CDDP behandling. Som forventet, transkripsjonen aktivitet fra CREB mutant markert redusert med omtrent to ganger i forhold til pGL3-1600 promoter i CDDP-behandlede HCT116-celler. Videre, som vist i fig. 2C, er en økning i gangliosid GM3 produksjonen ble observert i HCT1116 celler indusert med CDDP, som vist ved immunofluorescens-analyse. Immunfluorescens aktivitet av GM3 i CDDP-behandlede celler ble sterkt detekterbar i en doseavhengig måte, mens det i de ubehandlede celler ikke ble detektert ved bruk av M2590 som en GM3-spesifikt monoklonalt antistoff og sekundært antistoff som en negativ kontroll, respektivt. Videre undersøkte vi gangliosid-mønstre i HCT116-celler behandlet med og uten CDDP ved hjelp av HPTLC-analyse. Interessant, blant gangliosidene, gangliosid GM3 ble markert økt i HCT116-celler behandlet med CDDP i forhold til ikke CDDP kontroll (Fig. 2D). Disse resultatene viser klart at både GM3-syntase-ekspresjon og gangliosid GM3 produksjon økes i HCT116-celler behandlet med CDDP.
(A) Total RNA fra HCT116-celler, ble isolert etter behandling med de angitte konsentrasjoner av CDDP behandling for 12 h og GM3 syntase mRNA ble påvist ved RT-PCR. (B) HCT116-celler ble transient transfektert med GM3 syntase-gen-promotoren (pGL3-1600) og CREB mutasjon av GM3-syntase-promoteren (pGL3-1600 CREB Mu), og deretter dyrket med eller uten CDDP i 12 timer. Luciferase-aktiviteten ble bestemt fra cellelysater som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Resultatene som er vist er middelverdier ± SD fra tre uavhengige eksperimenter med trippel-måling.
*** P 0,001 vs. CDDP behandlede kontroll. (C) HCT116-celler ble dyrket og deretter inkubert med angitte konsentrasjon av CDDP behandling i 12 timer. Immunreaktiviteten mot gangliosid GM3 ble påvist ved anvendelse av et fluorescein isothiocyanat (FITC) -konjugert geite-anti-mus-IgM, uten eller med M2590 antistoff. (D) De gangliosider isolert fra HCT116-celler behandlet med CDDP (0, 10, og 30 ug /ml) ble analysert ved HPTLC.
nedregulering av gangliosid GM3 ved siRNA målretting GM3 syntase beskytter celle apoptose av CDDP
Våre tidligere data viste at CDDP indusert apoptotiske signal hendelser gjennom ROS produksjon og økt uttrykk av gangliosid GM3 syntase og dets produkt GM3. Således, for å bestemme om den økte gangliosid GM3 i CDDP-behandlede HCT116-celler ble forbundet med CDDP-mediert apoptose, vi utviklet tre sirnas rettet spesielt mot GM3-syntase (siGM3). No. 2 og 3, men ikke No. 1 av tre siGM3 tydelig nedregulert ekspresjon av GM3-syntase i CDDP-behandlede HCT116-celler, som bestemt ved RT-PCR-analyse (Fig. 3A). I tillegg siGM3 2 og 3, men ikke 1 (fig. 3B) gjengitte uttrykk mønstre av Bax, Bcl-2 og p53 i CDDP-behandlede celler som de i CDDP-ikke-induserte celler. Disse resultater antyder at den opp-regulering av GM3 er nødvendig for apoptose av CDDP-induserte HCT116-celler.
HCT116-celler ble transfektert med tre siRNA som målretter GM3 og negativ kontroll siRNA. Celler ble deretter dyrket i 12 (30 ug /ml). Total RNA og proteinlysatene fra cellene ble fremstilt som beskrevet i Materialer og Metoder. (A) Nivåene av GM3-syntase mRNA i total RNA oppnådd fra hver celle ble påvist ved RT-PCR. (B) Totalt protein ble fremstilt fra cellene og analysert ved western blotting ved å bruke de angitte antistoffer.
Den forbedring av gangliosid GM3 i CDDP-behandlede HCT116-celler regulerer 12-lipoxigenase (12-LOX) aktivering for ROS produksjon
Nervecelledød indusert av glutamat resulterer i ROS-produksjon ved 12-LOX-aktivering, og indusert lokalisering av 12-LOX til membranen, som er relatert til aktivering av 12-LOX [25]. Våre kolleger har rapportert at 12-LOX er rekruttert til glykosphingolipid-beriket mikroområder (GEM) i en gangliosid GM3 avhengig måte i løpet av oksidative glutamat toksisitet [21]. Våre data viser at CDDP indusert mitokondrier-avhengig apoptose signaler gjennom gangliosid GM3-mediert ROS generasjon i HCT116-celler (fig. 3 og fig. 4A). Således undersøkte vi hvorvidt en spesifikk inhibitor av 12-LOX, Baicalein inhiberer 12-LOX-aktivitet for ROS-produksjon i HCT116-celler som uttrykker gangliosid GM3 indusert av CDDP. Som vist på fig. 4B, CDDP indusert GM3 syntase uttrykk og ROS produksjon. Men Baicalein trykt CDDP stimulert ROS produksjon, selv om GM3 syntase uttrykk indusert av CDDP ikke ble regulert av Baicalein. Videre ROS scavenger NAC, hemmet ROS generasjon, men ikke GM3-syntase i CDDP-behandlede HCT116-celler. Disse resultater antyder at CDDP-indusert gangliosid GM3 ekspresjon kan regulere 12-LOX-aktivitet for ROS-produksjon ved 12-LOX rekrutteringen til GEM.
(A) HCT116-celler ble transfektert med siRNA målretting GM3 og negativ kontroll siRNA. Cellene ble deretter dyrket i 12 timer i nærvær eller fravær av CDDP (30 ug /ml). Dyrkningsmediet ble erstattet med nylaget medium inneholdende 10 uM DCFH-DA. Etter 30 minutters inkubering ved 37 ° C, ble fluorescensintensiteten målt ved strømningscytometri. Data representerer gjennomsnittet ± SD av 3 uavhengige målinger.
** P 0,01 og
*** P 0,001 vs. CDDP behandlede kontroll. ns: ingen betydning. For RT-PCR, ble totalt RNA og proteinlysatene fra cellene fremstilt som beskrevet i Materialer og Metoder. Nivåene av GM3-syntase mRNA i total RNA oppnådd fra hver celle ble påvist ved RT-PCR. (B) HCT116-celler behandlet med eller uten 30 mg /ml CDDP etter forbehandling av 10 nM NAC eller 1 uM Baicalein, og deretter kulturmedium ble erstattet med nylaget medium inneholdende 10 uM DCFH-DA. Etter 30 minutters inkubering ved 37 ° C, ble fluorescensintensiteten målt ved strømningscytometri. Data representerer gjennomsnittet ± SD av 3 uavhengige målinger.
*** P 0,001 vs. CDDP behandlede kontroll. For RT-PCR, ble totalt RNA og proteinlysatene fra cellene fremstilt som beskrevet i Materialer og Metoder. Nivåene av GM3 syntase mRNA totalt RNA hentet fra hver celle ble oppdaget av RT-PCR.
CDDP-indusert apoptose er forbedret i HCT116 celler som overuttrykker GM3 syntase
For å undersøke følsomheten av CDDP-mediert apoptose mellom HCT116-celler og HCT116-celler som overuttrykker GM3-syntase, genererte vi stabile transfektanter som uttrykte GM3. PcDNA3-GM3 ekspresjonsvektor skjuler det menneskelige GM3 syntase cDNA (HCT116 /GM3) og pcDNA3 tom vektor (mock) ble transfektert inn HCT116-celler. Etter seleksjon av G418-resistente kolonier, bekreftet vi at ekspresjon av GM3-syntase mRNA og gangliosid GM3 ble sterkt uttrykt i HCT116 /GM3-celler sammenlignet med mock-transfekterte celler, som vist ved RT-PCR og immunofluorescens-analyse (Fig. 5A). Disse resultater viser at den enzymatisk aktive GM3-syntase er syntetisert i HCT116 /GM3-celler. Under normale dyrkningsforhold (10% FBS), veksten av HCT116 /GM3 celler var ikke annerledes sammenlignet med kontrollceller, og endringer i apoptotiske signaler ble ikke observert i disse cellene, noe som gjenspeiles av western blot analyse (data ikke vist). Imidlertid, når disse transfektanter ble behandlet med CDDP i en doseavhengig måte, høyere antall cellene dissosiert fra platen i HCT116 /GM3 sammenlignet med mock-celler behandlet med 30 ug /ml CDDP. Faktisk ble HCT116 /GM3-celler vist seg å være mer følsomme for CDDP enn mock celler i cellevekst-inhibering som gjenspeiles av XTT-assay (fig. 5B). I tillegg ble det observert en økning i DNA-skade etter CDDP eksponering i HCT116 /GM3-celler sammenlignet med mock-behandlede celler ved anvendelse av en DNA-fragmentering assay (fig. 5C). Siden Annexin V flekker på snudd ut fosfatidylserin på den ytre siden av plasmamembranen, å vippe ut av fosfatidylserin fra innersiden til yttersiden av plasmamembranen er kjent for å være en av karakteristikkene av apoptotiske celler. I den foreliggende undersøkelse, som vist i fig. 5D, annexin V-positive celler, målt ved flow-cytometri ble også signifikant økt i CDDP-behandlede HCT116 /GM3-celler sammenlignet med mock-celler. For å undersøke den molekylære mekanismen som ligger til grunn den sensibiliserende virkning av GM3 i CDDP-indusert cytotoksisitet, ble caspase-mediert PARP nedbrytning ved reduksjon av mitokondriell potensiell undersøkt etter CDDP behandling ved forskjellige konsentrasjoner (fig. 5E). Western blot-analyse viste at i HCT116 /GM3 celler spaltingen nivået av PARP ble øket sammenlignet med mock-celler. Disse resultatene tyder på at GM3 sensitizes HCT116-celler til CDDP-indusert apoptose. Våre resultater viser at ROS spiller en sentral rolle i CDDP-indusert HCT116-celler, noe som fører til celle apoptose. Vi sammenlignet produksjon av ROS i HCT116 /GM3 celler som i mock celler ved flowcytometrisk analyse ved hjelp av H
2DCFDA. Som vist på fig. 5F, den CDDP-indusert ROS-produksjonen ble utvidet i HCT116 /GM3-celler sammenlignet med mock-celler, men ikke i NAC-forbehandlede celler, noe som indikerer at en økning i GM3 nivåer er nødvendig for ROS-produksjon i CDDP-indusert apoptose av HCT116-celler. Disse data indikerer at ROS-produksjonen er avhengig av GM3-nivåer i CDDP-induserte HCT116-celler.
(A) RT-PCR og immunofluorescens-analyse bekreftet ekspresjon av GM3-syntase og dens GM3 produkt i en stabil transfektant av pcDNA- GM3 i HCT116 cellene. Som en kontroll, gjorde vektor alene (pcDNA) -transfected HCT116 ikke uttrykke GM3. Mock, vektor (pcDNA3) -transfected celle HCT116 /GM3, pcDNA3-GM3-transfekterte celler. (B) Celleviabilitet ble evaluert 24 timer etter CDDP behandling ved de angitte konsentrasjoner ved hjelp XTT analysen i HCT116 /GM3 celler sammenlignet med mock-behandlede celler. Dataene er middelverdier ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (C) Etter behandling av CDDP ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer, ble genomisk DNA analysert på en 2% agarosegel. (D) apoptotisk cellepopulasjoner ble målt ved FACS-analyse ved anvendelse av Calibur Annexin V-farging som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Pilene viser apoptotiske populasjoner i mock og HCT116 /GM3 celler, henholdsvis. (E) HCT116 /GM3 eller mock-celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av CDDP i 12 timer. Hel-cellelysater og supernatant media ble fremstilt og analysert ved immunoblotting som beskrevet i Materialer og Metoder, ved hjelp av de angitte antistoffer. (F) Effekten av CDDP behandling ble målt på fluorescensen fordelingen av DCFH oksydasjon i HCT116 /GM3 eller mock-celler. Som vist på fig. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
