Abstract
Wnt5a er en av de såkalte ikke-kanoniske Wnt ligander som ikke handler gjennom β-catenin. I normal utvikling, er Wnt5a skilles og styrer migrering av målceller langs konsentrasjonsgradient. Effekten av Wnt5a på målceller reguleres av mange faktorer, inkludert ekspresjonsnivået av inhibitorer og reseptorer. Feilregulert Wnt5a signale muliggjør invasjon av flere krefttyper i tilstøtende vev. Imidlertid har uttrykket og fordeling av Wnt5a i kutant squamous cell carcinoma (SCC) og basalcellekreft (BCC), så vel som effekten av Wnt5a på keratinocytt-migrasjon ikke blitt studert i detalj til dags dato. Vi her rapporterer at Wnt5a blir oppregulert i SCC og BCC og lokalisert til den fremre kant av tumorer, samt tumorassosierte fibroblaster. Den Wnt5a-utløst bundling av sin reseptor Fzd3 tilsier Wnt5a konsentrasjons gradienter som rager inn i svulsten. In vitro-analyser viser at migrasjon Wnt5a konsentrasjonsgradienter bestemme dens virkning på keratinoctye migrasjon: Mens kjemotaktisk migrering inhiberes av Wnt5a til stede i homogene konsentrasjoner, blir det forsterket i nærvær av en Wnt5a gradient. Uttrykk profilering av Wnt veien viser at oppregulering av Wnt5a i SCC er koblet til undertrykkelse av kanoniske Wnt signalering. Dette bekreftes av immunhistokjemi viser mangel på kjernefysisk β-catenin, samt fraværende opphopning av Axin2. Siden begge typer Wnt signale handle gjensidig antogonistically på flere nivåer, samtidig undertrykkelse av kanoniske Wnt signal antyder hyper-aktiv Wnt5a signaltransduksjon. Betydelig, er denne kombinasjonen av genet feilregulering ikke observert i godartet hyperproliferative inflammatorisk hudsykdom psoriasis. Samlet våre data sterkt at Wnt5a signale bidrar til vev invasjon av ikke-melanom hudkreft
Citation. Pourreyron C Reilly L, Proby C, Panteleyev A, Fleming C, McLean K, et al. (2012) Wnt5a er sterkt uttrykt i forkant i Non-melanom hudkreft, Forming Aktive Graderinger, mens Canonical Wnt Signale er undertrykt. PLoS ONE 7 (2): e31827. doi: 10,1371 /journal.pone.0031827
Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA
mottatt: 24 oktober 2011; Godkjent: 12 januar 2012; Publisert: 22 februar 2012
Copyright: © 2012 Pourreyron et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Cancer Research UK (C. Pourreyron, APS). C. Pourreyron ble finansiert av Debra International (dystrofe Epidermolysis Bullosa Research Association) og European Research Council (ERC) (APS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Vingeløse-type (Wnt) ligander er signalmolekyler viktig i utvikling. Wnt ligander er klassifisert som «kanonisk» eller «ikke-kanoniske» [1]. Kanonisk Wnts, eksemplifisert ved Wnt3a, binder til Fzd-type reseptorer, så vel som LRP5 /6 co-reseptorer, fulgt av rekrutteringen av et heteromert proteinkompleks inkludert Dishevelled, Axin, og GSK3P til reseptorkomplekset. Dette fører til fosforylering av LRP5 /6, frigjøring og kjernefysisk translokasjon av β-catenin, som kulminerte i induksjon av målgener. I motsetning til ikke-kanonisk Wnts, inkludert Wnt5a, bind Fzd reseptorer i forbindelse med alternative ko-reseptorer, inkludert ROR1 /2 eller Ryk, forårsaker β-catenin-uavhengig endringer som for eksempel PKC-aktivering og cytoskeletal rearrangementer [2]. Viktigere, ved å binde seg til vanlige Fzd reseptorer, kanoniske og ikke-kanoniske Wnts fungere som konkurrerende antagonister ved felles reseptorer [3].
I utvikling, er underlagt nøyaktig temporal og romlig kontroll sekresjon av alle Wnt ligander inkludert Wnt5a hvorved konsentrasjons gradienter er oppnådd [4]. Disse gradienter direkte morfogenetiske bevegelse av målceller, så vel som anordningen av asymetrical polarisering av epitelceller [5]. Således Wnt5a vesentlige retning og migrering av celler inn i omgivende vev, for eksempel i lem utvikling. Et sentralt element å bestemme effekten av Wnt på målceller er nærværet av utskilte inhibitoriske proteiner. Disse inkluderer Dickkopf (DKK) familien, som spesifikt binder LRP5 /6 og dermed fungere som spesifikke hemmere av kanoniske Wnts. Andre inhibitorer omfatter Wif og det utskilte frizzled beslektede proteiner (SFRP) som binder begge typer wnt ligander så vel som Fzd-reseptorer, og hemmer både kanonisk og kanonisk Wnts [6]. Den romlige fordelingen av SFRP, Fzd, DKK, og Wnt er minutt orkestrert i utvikling (f.eks [7], effektivt skaper diffusjon korridorer for Wnt aktivitet.
Ikke overraskende gitt sin rolle som regulator av cellevandring i tilstøtende vev den uregulerte aktivering av Wnt5a har vært forbundet med invasivitet og i flere tumortyper, inkludert melanom [8], [9], brystkreft [10], magekreft [11], bukspyttkjertelkreft [12], og osteosarkom [13] . Wnt5a messige tumorinvasjon, kan også være mediert av tumor-assosierte celler. Således, brystcancer-celler induserer Wnt5a ekspresjon i tumor-infiltrerende makrofager, forårsaker syntese av matriks-metalloproteinase (MMP) 7 [10].
Wnt5a kan binde flere frizzled reseptorer, inkludert Fzd2, Fzd5, Fzd3, Fzd4. av disse har vi tidligere vist at Fzd5 og Fzd3 er uttrykt i foreldre vev for både plateepitelkarsinom (SCC), epidermis, og basalcellekarsinom (BCC ), hårsekken, henholdsvis [14]. Disse Fzd reseptor-isoformer har også blitt vist å mediere Wnt5a-indusert retnings motilitet i melanoma [15], så vel som invasiv migrasjon i brystkreft [16]. Viktigere, Fzd3 har nylig blitt vist å samle inn polariserte brenn aggregater når cellene utsettes for en gradient Wnt5a in vitro [15]. Mens Wnt5a gradienter ikke kan oppdages direkte i primær vev, åpner muligheten for å utnytte den intracellulære fordeling av Fzd3 som indikator på funksjonelle Wnt5a gradienter som virker på celler
in vitro
.
Ikke-melanom denne oppdagelsen hudkreft bestående BCC og SCC er den vanligste kreft hos mennesker og fortsatt øker i forekomst med mer enn 100.000 tilfeller diagnostisert hvert år i Storbritannia. Selv om bare SCC metastasizes i immunkompetente individer, SCCS er svært lokalt invasive, noe som gjør dem lett tilgjengelige natur modeller for å studere vev invasjon. Uttrykket av Wnt5a og beslektede reseptorer har ikke blitt studert på proteinnivået i disse svulstene og få data finnes på effekten av Wnt5a på retnings migrasjon i SCC celler eller keratinocytter in vitro.
Her rapporterer vi fordelingen av Wnt5a og reseptorene Fzd5 og Fzd3 i SCC og BCC. Vi benytter Fzd3 lokalisering for å identifisere Wnt5a gradienter operative i voksen hud samt i SCC /BCC. Vi gir ytterligere funksjonell bevis på at Wnt5a gradienter gir deg flere rettet bevegelighet av keratinocytter. Expression profilering viser at invasiv SCC, i motsetning til godartet inflammatorisk hyper av keratinocytter, er preget av den samtidige oppregulering av ikke-kanoniske og undertrykkelse av kanoniske Wnt signalering. Våre data tillate utformingen av en fungerende modell av hvordan Wnt5a kan fungere for å forbedre bevegelighet og invasivitet i disse svulstene.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Før biopsi, pasienter ga skriftlig samtykke til lagring og analyse av biopsiprøver. Lagring og bruk av alle vev som inngår i arbeidet som presenteres her ble utført i henhold til Helsinki deklarasjonen og godkjent av Tayside komité for medisinsk forskningsetikk B (REC ref. Nr. 07 /S1402 /90).
tumorprøver
SCC studert her ble fjernet fra immunkompetente pasienter fra hodet (n = 7) eller hender /ben (n = 4), i hvert fall stille rundt tegn på solskader og klassifisert som godt differensiert (n = 8), eller moderat /dårlig differensiert (n = 3). BCC (n = 9) var alle fra hodet, bortsett fra en BCC fjernet fra hånden
Immunohistochemistry
Antistoffer som ble brukt var anti Wnt5a (R .. D, ordre nr AF645, slutt fortynning 1:400, alternativ antistoff (vist i figur S1.. Abcam, klone 3D10, ordre nr Ab86720, brukt på 1:10000 fortynning), anti-frizzled 3 (Insight Biotech, bestilles gjennom acris antistoffer, Tyskland, ordre nr. SP4568P, 1:200), anti-frizzled 5 (Cambridge Bioscience, ARP41245_P050, 1:800), β-catenin (Millipore, 05-665). Immunohistochemistry ble utført nøyaktig som beskrevet [14] med parafininnstøpte eksempler hentet fra den Tayside Tissue banken.
Stall uttrykk for Wnt5a og cellekultur
Etablering av Wnt5a-stabilt transfekterte HaCaT celler.
HaCaT celler ble oppnådd som beskrevet tidligere [17]. celler ble sådd ut i 6-brønn cellekulturplater ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /brønn før lipofektamin transfeksjon med enten pcDNA3 WNT5A-HA-konstruksjonen (full lengde humant rekombinant Wnt5a med C-terminale HA-tag) eller en pcDNA3 tom vektor. -Celler ble transfektert med 1 jjg plasmid DNA kompleksbundet med 8 ul Lipofektamin 2000 Transfeksjon reagens og inkubert med transfeksjon kompleks i 4 timer. Supernatanten ble fjernet og DMEM + 10% FCS inneholdende 800 pg /ml G418 ble tilsatt til hver brønn. Celler ble observert i løpet av to uker, med media endres hver 2-3 dager. Når kolonier begynte å dukke opp, ble cellene trypsinisert og overført til 25 cm
2 cellekultur kolber. Kulturer ble opprettholdt i DMEM inneholdende 10% FCS (ikke-varmeinaktivert) med 800 ug /ml G418. Fortsatt Wnt5a uttrykk ble bekreftet ved Western blot hjelp anti- Wnt5a (R D, AF645, fortynning 1:1000).
Transwell migrasjon analysen
En Transwell system som innarbeidet en polykarbonat filter membran med en diameter på 6,5 mm og porestørrelse på 8 um (Corning, Sigma-Aldrich, Poole, UK) ble anvendt for å vurdere graden av cellemigrering. Mitomycin C-behandlede celler (1 x 10
5) ble suspendert i 100 ul 0,1% BSA DMEM med eller uten human /mus rekombinant Wnt5a (0,1 ug /ml) (R . Tabell 1). Som med Fzd3, svulster som gjorde uttrykkelig Fzd5 utstilt Fzd5-positive regioner som alternerer med Fzd5-negative regioner (fig. 3a). I motsetning til tumor – forbundet endotelceller gående oppviste sterk Fzd5 ekspresjon (fig 3c, t.). Tumor-assosiert fibroblaster var svakt til moderat positiv for Fzd5 (fig. 3c, innfelt). Således, mens Fzd5 uttrykk er variabel i ikke-melanom hudkreft celler, er dets ekspresjonsnivå i tumorkarene i overensstemmelse med en rolle for denne reseptoren i mediering Wnt5a-avhengige inflammatoriske veier, i samsvar med tidligere rapporter [20], [21].
Immunhistokjemi av SCC (a-d), eller BCC (e-h), i hvert tilfelle som viser et eksempel av tumorer som oppviser høy (SCC: a, c, BCC: e, g) eller lav (SCC : b, d; BCC: f, h) Fzd5 uttrykk. Farging intensiteter i svulstene kan sammenlignes direkte med flekker intensiteter av Fzd5 i kornet lag av epidermis (svarte pilspisser). Paneler a, b, e, f er vist ved 40 x og c, d, g, h ved 200 x forstørrelse. Den innfelt nederst til høyre (c) viser en tumor-assosiert fibroblast. Røde piler betegne blodkar.
Wnt5a og Fzd reseptorer uttrykt av ikke-overlappende svulst celle undergrupper
neste studert den romlige forholdet mellom Wnt5a, Fzd3 og Fzd5 i enkelte tumor prøver. For å oppnå dette, fant vi ut fargeintensitetene av disse proteiner i seriesnitt av individuelle tumorer, henholdsvis, ettersom antistoffene som er egnet for ko-immunofluorescens i parafininnstøpte prøver var utilgjengelig. Som vist i figur 4, ble Wnt5a hovedsakelig uttrykt på tumor marginer i SCC (så vel som i tumorassosierte stroma). I motsetning til dette Fzd3 lokalisert til cellene i tumormassen, noen ganger danner nest lignende Fzd3-positive tumor-domener (midtre panel, hvit pil hode) og, som beskrevet ovenfor, utviser fokalt polarisert intracellular fordeling. Fzd5 utstilt heterogen intra-tumor distribusjon, blir lokalisert til intra-tumor klynger (øverst), svak /diffust på kanten (nederst), eller homogent hele (i midten). Analoge ordninger ble observert i BCC, med Wnt5a å være sterkest uttrykt ved den fremre kanten, samt i tumor-assosiert stroma (figur 5, venstre panel), mens Fzd3 viste polariserte ekspresjon i tumor (figur 5, øverst i midten), eller i Fzd3-positive reir (hvit pil hoder). Fzd5 var svak eller fraværende i de fleste BCC (nederst til høyre, jf tabell 1). Der uttrykte, Fzd5 utstilt diffus intratumorlokalisasjon (øverst til høyre), eller i svulsten kanten (i midten til høyre). Sett i sammenheng, viser dataene at Wnt5a og dets reseptorer er uttrykt ved ikke-overlappende underpopulasjoner. Den sterke ekspresjon av Wnt5a ved forkanten, samt i tumor-området stromaceller, i forbindelse med den polariserte ekspresjon av Fzd3 i tumormassen tyder på at Wnt5a gradienter rage inn i tumoren for å forbedre bevegeligheten i forskjellige subpopulasjoner.
serie~~POS=TRUNC deler av tre parafin innebygd SCC tumorprøver (topp, midten, nederste rad, henholdsvis) ble farget for Wnt5a, Fzd5, Fzd3, henholdsvis som beskrevet i metoder, og vist på 200 × forstørrelse. Rød stjerne betegner kunstig nukleær farging muligens på grunn av antigen gjenfinning forhold. Røde piler betegne grensene for svulster, peker mot stroma
Immunohistochemistry av serielt kuttet prøver farget for Wnt5a, Fzd5, eller Fzd3 som angitt, forstørrelse. 100 × (øverste rad), 200 × (i midten, nederste radene).
Wnt5a konsentrasjonsgradient forbedre retnings bevegelighet av keratinocytter
dataene som presenteres ovenfor foreslåtte Wnt5a konsentrasjons gradienter kan være viktig for sin effekt på cellemotilitet. For å teste denne hypotesen funksjonelt, brukte vi menneskelige HaCaT keratinocytter som modell. Vi stabilt transfektert HaCaT celler med en Wnt5a-uttrykke vektor, eller tom kontroll vektor (betegnet HaCaT pcDNA). Uttrykk av rekombinant Wnt5a ble verifisert av western-blot (fig. 6A). Først, vurderte vi rettet cellemigrering i en to-kammer Transwell-analyse. Som vist på figur 6B, da rekombinant Wnt5a ble tilsatt direkte til HaCaT-keratinocytter pcDNA i det øvre kammer, noe som er til stede i en homogen konsentrasjon rundt migrerende celler, det hemmet kjemotaktisk migrering mot 5% FCS til stede i den nedre brønnen. Likeledes kjemotaktisk migrasjon ble betydelig redusert i celler som overuttrykker Wnt5a forhold til ikke-overuttrykk celler (fig. 6C). En tilsvarende resultat ble oppnådd i et kort sikt (6 timer) migrasjonsanalyse ved anvendelse av enten 5% FCS eller EGF som kjemotiltrekkende (fig. S2A). Videre, i skrape analyser, migrering av Wnt5a-overekspresjon HaCaT-celler i 10% FCS DMEM (fig. 6D) mot bunnen av kanten var sterkt redusert sammenlignet med HaCaT-pcDNA-celler (lignende resultater ble funnet ved anvendelse av 1% FCS som kjemotiltrekkende, fig. S2A). Således er migrasjon keratinocytt inhibert når Wnt5a omgir cellene ved homogen konsentrasjon. Ved sammenligning, når Wnt5a-utskillende HaCaT-celler ble sådd ut på bunnen av en Transwell kammer, for derved å etablere en oppadgående Wnt5a konsentrasjonsgradient, migrering av ikke-Wnt5a overekspresjon HaCaT-celler sådd i øvre kammer mot Wnt5a kilden ble betydelig forbedret (fig. 6e). Disse data viser at humane keratinocytter blir indusert til å migrere mot en Wnt5a-gradient, men at ikke-gradient Wnt5a avtar motilitet overfor andre kjemoattraktanter.
A. Uttrykk av endogen og rekombinant Wnt5a i helcellelysater av stabilt transfektert Wnt5a-overekspresjon HaCaT eller kontroll (HaCaT-pcDNA) celler verifisert av western blot. B. Ikke-Wnt5a overekspresjon HaCaT-pcDNA-celler ble sådd ut i det øvre kammer av en Transwell i 0,1% BSA DMEM i fravær eller nærvær av rekombinant Wnt5a ved 1 ug /ml, som indikert i figuren. Det nedre kammer ble fylt med 600 ul DMEM inneholdende 5% FCS som kjemotiltrekkende. Resultatene er uttrykt som prosent av migrerende cellene når HaCaT-pcDNA ble sådd ut i 0,1% BSA DMEM bare. Resultatene som er vist representerer gjennomsnitt ± S.D. av to uavhengige forsøk, hvert utført in triplo, * p≤0.05. C. Sammenligning av Wnt5a-overekspresjon og pcDNA kontroll celle migrasjon. Celler suspendert i 0,1% BSA DMEM ble sådd ut i det øvre kammer. Det nedre kammer ble fylt med 600 ul DMEM inneholdende 5% FCS som kjemotiltrekkende. Migrering ble målt ved 18 timer ved anvendelse av en kolorimetrisk analyse. Resultatene er uttrykt som prosent av HaCaT-pcDNA migrerende celler. Resultatene som vises representerer gjennomsnitt ± standardavvik av n = 4 uavhengige forsøk, hvert utført in triplo, *** p≤0.001. D. Scratch sår analyse utført på mitomycin-C behandlede celler. Under overføringen HaCaT-pcDNA (a, b, c), eller Wnt5a-overuttrykkende celler (d, e, f), ble holdt i DMEM inneholdende 10% FCS. Bildene ble tatt like etter at bunnen var laget (0 timer) (a og d), så vel som 18 h (b og e), og 24 timer senere (c og f). E. Migrering av HaCaT-pcDNA kontrollceller i nærvær av en Wnt5a konsentrasjonsgradient. Wnt5a-overekspresjon eller pcDNA HaCaT-celler ble sådd ut i de nedre brønnene av Transwell platene. Umiddelbart før du legger innleggene inneholder HaCaT-pcDNA celler i det øvre kammeret, ble media i de nederste brønnene byttes ut for å fjerne pre-utskilt Wnt5a. Migrasjon ble vurdert til 18 timer. Resultatene er uttrykt som prosent av HaCaT-pcDNA migrerende celler. Resultatene som vises representerer gjennomsnitt ± standardavvik n = 3 uavhengige eksperimenter, hver utført i tre eksemplarer, *** p≤0.001.
Økt Wnt5a uttrykk i kutan SCC er ledsaget av undertrykkelse av kanoniske Wnt signal og nedregulering av signale hemmere
Siden kanoniske og ikke-kanoniske trasé kryss-hemmer hverandre, er effekten av Wnt5a signale
in vitro
er avhengig av den relative overflod av andre ligander, modulatorer, reseptorer, og nedstrøms effektorer i Wnt signal nettverk. Vi utførte derfor en omfattende analyse av uttrykket av Wnt-signale komponenter i primær invasiv kutant plateepitelkarsinom. Som vist i tabell 2, Wnt5a var mest signifikant oppregulert av alle wnt ligander (fire ganger, p = 8 x 10
-6), independenly bekrefter dataene immunhistokjemi. I motsetning til de mest sterkt uttrykt kanoniske Wnt medlem, Wnt3a, er betydelig nedregulert, for derved å lette konkurrerende antagonisme for Wnt5a på reseptornivået. (En annen kanonisk Wnt ligand, Wnt8b, er formelt oppregulert, men ser ut til å bli uttrykt ved mye lavere totalnivå, tabell 2). Blant anerkjente Wnt5a bindende frizzled reseptorer, er Fzd2 og Fzd5 oppregulert, om enn på marginal statistisk signifikans (Tabell 3). Blant ekstracellulære Wnt antagonister SFRP1 er oppregulert i samsvar med ytterligere undertrykkelse av kanoniske Wnt signal (se nedenfor, diskusjon). DKK2, spesifikke for kanoniske Wnt medlemmer, er også undertrykt, men et uttrykk for den mye høyere uttrykt DKK1 er uendret. I motsetning antagonister som målretter både kanonisk og ikke-kanonisk Wnts, Wif og SFRP2 /3, så vel som nøkkel intracellulære signale antagonist Axin2, er alle vesentlig nedregulert. Disse endringene er grafisk angitt i fig. 7a. Samlet foreslår de at den oppregulering av Wnt5a i invasiv SCC er en del av et sett med endringer som virker sammen for å øke ikke-kanoniske, men undertrykke kanoniske Wnt signal (se nedenfor, diskusjon).
(a) Cartoon illustrerer funksjonelle relasjoner mellom wnt signalkomponenter som er oppført i tabellene 2 og 3. Red: oppregulert, Grønn: nedregulert. Store stiplede linjer representerer proteinbinding. (B) Spesifikk feilregulering av SFRP1 og SFRP2 i invasiv SCC, men ikke psoriasis. Fold-feilregulering av vitnemål i psoriasis plakk ble beregnet som beskrevet tidligere [19] og justert til SCC datasett beskrevet i tabellene 2 og 3. Fargekoding og fet skrift satt som i tabell 2. «ns». Ikke signifikant
Samtidig inverse transcriptional regulering av Wnt5a og Wnt3a skiller SCC fra ikke-invasiv godartet hyper
transcriptional oppregulering av Wnt5a selv er usannsynlig å forårsake invasivitet, siden det er også sterkt oppregulert i psoriasis, en hyperproliferativ men ikke-invasiv forstyrrelse [14]. Vi søkte derfor å identifisere flere faktorer snu fysiologiske Wnt5a handlingen inn i en forsterker for invasiv migrasjon. For å oppnå dette, sammenlignet vi genuttrykk av Wnt signalkomponenter i SCC med psoriasis. I begge betingelser, blir den respektive patologisk tilstand sammenlignet med friske kontroll hud. Det relative nivået av genekspresjon, uttrykt som rang nivå, ble funnet å korrelere godt mellom styre hudprøver i begge datasettene, henholdsvis, noe som indikerer at dysregulering av gener påvist i hver tilstand oppstår i forhold til en tilsvarende kontroll (Fig. S3). Figur 7b viser et fargekodet feilregulering varmekart av Wnt-signalkomponenter som er oppført i tabellene 2 og 3 for SCC vs. psoriasis. Som bekreftelse på våre tidligere funn [14], er Wnt5a og Fzd5 også oppregulert ved psoriasis. Likeledes kan nedregulering av den kanoniske wnt inhibitoren DKK2, CTNNBIP1 (ICAT), Axin2, samt FRZB (SFRP3) er felles for SCC og psoriasis. Imidlertid er undertrykkelse av Wnt3 samt feilregulering av SFRP1 og SFRP2 bare funnet i invasiv kutan SCC, men ikke psoriasis.
Mangel på kjernefysisk β-catenin flekker og svak Axin2 protein uttrykk bekrefter nedregulert kanoniske Wnt-signalering i SCC og BCC
for å oppnå en ytterligere uavhengig bevis for aktiveringsstatusen til kanonisk Wnt-signale vi utført immunohistokjemi av β-aktin, ved hjelp av et antistoff som er spesifikt for aktivert (Ser38 /Thr41 defosforylert) β – aktin. Som vist i figur 8, atom β-catenin var rikelig i den granulære lag av epidermis, men fraværende fra enten SCC eller BCC tumorer. Dette var sant for alle SCC (n = 12) og BCC (n = 7) prøver undersøkt. Vi videre tok fordel av offentlig tilgjengelig vev rekke depot tilgjengelig på ProteinAtlas nettstedet. Denne database inneholder data immunhistokjemi varierende i kvalitet, avhengig av reagensene som benyttes. I tilfelle av β-catenin, inneholder nettstedet serien farget med fire forskjellige antistoffer, hvorav tre har blitt grundig validert (se data S1). IHC bilder generert ved bruk av enten den samme antistoff som er spesifikt for aktivert β-catenin eller antistoffer som detekterer total β-catenin avslørte nærvær av membranen plassert β-catenin, men konsekvent fravær av kjernefysisk β-catenin i 12/12 SCC og i 11 /BCC bruker fire forskjellige antistoffer (fig. 9, data S1). Til slutt, vi også minelagt data på ProteinAtlas tilgjengelige for Axin2. Selv om nivået på validering av dette antistoffet er ikke fullt så robust som for β-catenin antistoffer, tilgjengelige data tyder sterkt på at Axin2 ikke klarer å samle seg i enten SCC eller BCC (figur S6). Således protein nivå data er i overensstemmelse med de uttrykk profilering av data, noe som tyder på undertrykkelse av kanonisk Wnt signaliseringen.
Immunhistokjemi av tre BCC (a-c) og SCC (d-f) prøver farget med et antistoff som er spesifikt for aktivert p-catenin. Legg merke til sterke kjerne β-catenin begrenset til den granulære lag av epidermis i hver prøve, så vel som i en forstørret hårsekken umiddelbart under SCC-celler (innfelt i d). Alle prøvene er vist ved 100 × forstørrelse, innfelt 400 ×.
Prøver ble farget enten med et antistoff spesifikt for aktivert ikke-fosforylert β-catenin (øverst) eller pan-β-catenin (nederst) . Bilder i (a) og (d) viser den β-catenin fordeling observert med det respektive antistoffet. Merk at sterke kjerne β-catenin er begrenset til det granulære lag av epidermis.
Diskusjoner
Tallrike studier har antydet en rolle Wnt5a i kreft invasjon (f.eks [16], [22] -.. [25] Ikke desto mindre rolle Wnt5a i kreft er kontroversiell, noen rapporter som tyder på at Wnt5a kan opptre som tumor suppressor ved å antagonisere kanonisk Wnt signalering (oversikt i [26]), på den annen side, både kanonisk og
