Abstract
På grunn av sin selvfornyelse og tumorigene egenskaper, tumor initiere celler (tics) har blitt antatt å være viktige mål for tykk- og endetarmskreft (CRC). Imidlertid studiet av tics er hemmet av det faktum at identifiseringen og dyrkning av tics er fremdeles gjenstand for omfattende debatt. Flytende tredimensjonale sfæroide kulturer (SC), som vokser i serumfritt medium supplert med vekstfaktorer er ment å være anriket på tics. Vi generert SC fra ferske kliniske vevsprøver og sammenlignet dem med SC isolert fra CRC cellelinjer samt til tilhenger differensierte kolleger. Pasient-avledet SC skjerm selvfornyelse kapasitet og kan indusere serietrans svulster i immuno-mangelfull mus, som fenotypisk ligner svulsten opprinnelsesland. I tillegg er den opprinnelige tumorvev og etablert SC beholde flere tilsvarende CRC-relevante mutasjoner. Primær SC uttrykke viktige stemness proteiner som SOX2, OCT4, Nanog og LGR5 og viktigere vise økt chemoresistance evne i forhold til sine heft differensiert kolleger og til cellelinje-avledet SC. Påfallende, celler avledet fra sfæroide eller vedhengdifferensieringskulturbetingelser viste lignende selvfornyelse kapasitet og like dannet tumorer i immun-manglende mus, noe som tyder på at selvfornyelse og tumor-initiering kapasitet tics er ikke begrenset til fenotypisk umodne sfæroide celler, som vi beskrive å være svært plastisk og i stand til å reacquire stamcelle-egenskaper selv etter lang differensieringsprosesser. Til slutt har vi identifisert to gener blant en sfære genuttrykk signatur som forutsier sykdom tilbakefall i CRC pasienter. Her foreslår vi at SC avledet fra friske pasienter tumorvev stede interessante fenotypiske egenskaper som kan ha klinisk relevans for chemoresistance og sykdom tilbakefall og representerer derfor et verdifullt verktøy for å teste nye CRC-behandlinger som vinne resistens.
Citation : Qureshi-Baig K, Ullmann P, Rodriguez F, Frasquilho S, Nazarov PV, Haan S, et al. (2016) Hva lærer vi fra spheroid Kultur Systems? Innsikt fra Tumorspheres Avledet fra Primær Colon Cancer vev. PLoS ONE 11 (1): e0146052. doi: 10,1371 /journal.pone.0146052
Redaktør: Alessandro Datti, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, CANADA
mottatt: 11 august 2015; Godkjent: 11 desember 2015; Publisert: 08.01.2016
Copyright: © 2016 Qureshi-Baig et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i papir og dets tilleggsinformasjon filer. Alle genuttrykk filer er tilgjengelige fra ArrayExpress database under deponeringsnummer E-mtab-3575
Finansiering:. Forfatterne ønsker å takke Fondation Cancer (gi F1R-LSC-PAU-13HY2C) for å finansiere denne studien og Fonds National de la Recherche (FNR) for å støtte KB og PU under AFR tilskuddsordningen. Vi takker også integrert Biobank av Luxembourg (IBBL) for å støtte denne studien. Forfatterne er også takknemlig til Fondation du Pélican de Mie et Pierre Hippert-Faber i regi av Fondation de Luxembourg for å støtte KB og PU. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Forkortelser : 5-FU, 5-fluorouracil; CRC, tykktarmskreft; TIC, tumor-initiering celle; CSC, kreft stamcelle; SC, sfæroide kulturer; SFC, sfære forming celle; TIC, tumor-initiering celle
Innledning
Colorectal karsinom (CRC) er den tredje hyppigst diagnostisert type kreft for både menn og kvinner og den nest vanligste årsaken til kreftdødelighet i vestlige land [ ,,,0],1]. Til tross for store fremskritt gjort i løpet av de siste tiårene, er fremdeles mye av striden om bakgrunn av kreft utbruddet, metastaser og CRC progresjon. De to dominerende begrepene kreft postulat stokastiske (klonal evolusjon modell) og hierarkisk (kreft stamcelle modell) organisering av svulster. I henhold til de sistnevnte, undergrupper av celler, den såkalte tumor initiere celler (tics) også kjent som kreft stamceller (cscs) er ansvarlig for tumorutvikling [2].
tics er først blitt beskrevet i rammen av hematopoietiske maligniteter [3]. Et par år senere, tics ble også identifisert i en rekke solide tumorer slik som brystkreft [4,5], hud [6], hjerne [7-9], bukspyttkjertel [10], lunge [11] og tykktarm [ ,,,0],12,13]. Tics er definert av sin (1) selvfornyelse, (2) å differensiere og (3) tumor-initiering kapasitet. De har blitt beskrevet for å forplante svulster som er i stand til å rekapitulere heterogeniteten av primære tumorer [3]. Den høye tumorigent potensialet tics er forverret av sin sterke motstand mot radio- og chemo-terapi. Tics er i stand til å unngå DNA skade under strålebehandling og kjemoterapi ved reduksjon av ROS og økt aktivitet av DNA sjekkpunkt kinaser [14]. De resterende delmengde av tics kan indusere dannelsen av nye tumorer, og dermed føre til en hurtig tilbakefall av kreft [15]. Som et resultat, kunne TIC-spesifikke behandlinger potensielt føre til en redusert risiko for svulst tilbakefall og en forbedret prognose for CRC pasienter. Interessant, diverse nyere studier støtter den kliniske relevansen av målretting TIC-assosierte gener [16].
Til tross for betydelige fremskritt i tykktarm TIC forskning, forblir isolering, identifisering og karakterisering av kolon tics ufullstendig etablert. Ulike strategier kan bli vedtatt for å få kolon tics ut av svulstvev. Isolasjonsteknikker for tics er basert enten på deres immunogene eller funksjonelle egenskaper [17]. Den antigene tilnærmingen tar fordel av en rekke celleoverflatemarkører, for eksempel prominin-1 (kjent som CD133), CD44, CD34, CD24, epitelial-spesifikt antigen (EpCAM /ESA), CD166, CD29, Lgr5, CD49f og ALDH -1 [17]. Funksjonell isolering av tics er avhengig av diverse egenskaper, slik som forankrings-uavhengig vekst, chemoresistance, selvfornyelse, asymmetrisk divisjon, og pluripotency. I løpet av de siste årene sfæroide kulturer (SC) som er avhengige av forankringsuavhengige vekstegenskapene til stamceller, har blitt brukt til å berike for tics i hjernen [18,19], bryst [5,20], og tykktarm [12,21 , 22] vev. Det er vel akseptert at SC bevare mer trofast egenskapene til opprinnelige svulster, inkludert genuttrykk profiler, svulst heterogenitet og tumor morfologi, sammenlignet med vanlige heft kulturer [12,19,21-25]. I tillegg kuler speile 3D mobil kontekst og relevante patofysiologiske graderinger av
in vivo
svulster [26]. Men i hvilken grad sfære formasjons analyser favorisere anriking av tics er ikke helt klart ennå. For det første er det verdt å merke seg at kulene inneholder også differensierte kreftceller [21,22,27,28]. For det andre kan noen studier på CRC faktisk demonstrere at SC har TIC egenskaper [12,21,29-31], mens andre ikke kunne finne noen berikelse når man sammenligner dem til tilhenger differensierte kulturer [31-36]. Viktigere de fleste av de tidligere nevnte studier er basert på cellelinjer. Det kan spekuleres i inkonsekvent observasjoner fått med cellelinjer kan skyldes fenotypiske forskjeller mellom utvalgte kloner som kan ha oppstått i løpet av lange perioder med cellekultur [37].
Vurderer disse motstridende resultater, bestemte vi oss for å karakterisere SC fra ulike opprinnelse i lys av TIC berikelse. I motsetning til tradisjonelle cellelinjer, pasient-avledede primærkulturer reflektere den heterogene natur av tumorbiologi, som det eksisterer i pasienter. Dermed blir betydningen av denne studien er å karakterisere som genereres SC direkte avledet fra friske kirurgiske prøver og sammenligne dem til deres tilhenger differensiert motstykke samt SC avledet fra CRC cellelinjer. Vi ønsker å finne ut om SC utstillingen funksjonene stemness, inkludert selvfornyelse, stamcelle markør uttrykk, differensiering potensial, motstand mot kjemoterapi og tumorigenicity
in vivo
.
Materiale og metode
Generering av primær SC og deres differensierte kolleger
prøver menneskelige kolon vev ble samlet av den integrerte Biobank av Luxembourg (IBBL, www.ibbl.lu) i henhold til institusjonelle retningslinjer. Alle humane prøver som benyttes innenfor rammen av dette arbeidet ble donert fritt og skriftlig informert samtykke ble oppnådd fra donor for bruken av denne prøve i forskning. Etisk godkjenning ble innhentet fra Comité National d’Ethique de Recherche, Luxembourg (Reference 201009/09). Fersk resected kolon svulstvev fra 35 CRC pasienter ble samlet og umiddelbart behandlet i kultur. Vevet ble vasket flere ganger i serumfritt Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) -F12 supplert med antibiotika-antimykotisk middel (Invitrogen). Prøvene ble oppmalt til 1-2 mm
3 stykker, etterfulgt av inkubering i kollagenase type IV (0,05 mg /ml; Invitrogen) og hyaluronidase (2 ug /ml; Sigma) i 1 time ved 37 ° C. Enkeltcellesuspensjonen ble oppnådd ved å blande hvert 15. minutt og etter filtrering gjennom et 70 mikrometer celle sil (BD Biosciences). Primær kolon SC ble opprettholdt i ultra-lav feste (ULA) cellekultur fartøy (Corning) i serumfrie stamcelle medium som inneholder DMEM-F12 supplert med B-27 (1x) og N-2 (1x) kosttilskudd (Invitrogen), BSA (4 mg /ml; Roth), ikke-essensielle aminosyrer (1x; Sigma), glukose 0,15% (Sigma), Insulin (4 U /l; Sigma), heparin (4 ug /ml), N-Acetylcystein ( 1 mM, Sigma), EGF (20 ng /ml; Biomol), bFGF (20 ng /ml; Miltenyi Biotec), og penicillin /streptomycin (1x; Lonza). Dette medium vil ytterligere bli referert til som stamcelle medium (SCM). For karakterisering formål, vi bare brukt tidlig passasje SC i denne studien (ikke mer enn 15 passeringer).
Vi ga tilhenger voksende differensierte kulturer fra SC på veldig tidlig passasjer. Til dette ble det differensierende betingelser anvendt: tidlige sfæroider ble dissosiert og dyrket i DMEM-F12 supplert med 10% FCS og 1% penicillin /streptomycin i vanlige cellekulturbeholdere. I motsetning til SC, differensierte kulturer vokser som adherente celler. Disse kulturene ble opprettholdt under differensierende forhold for minst 5 passeringer før den brukes for eksperimenter.
spheroid kulturer som stammer fra CRC cellelinjer
HT29, HCT116, LS174t, SW480, og SW620 CRC cellelinjer ble erholdt enten fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, USA) eller den tyske samling av mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) og holdt i anbefalte kulturbetingelser. For kulturen til SC, ble cellelinjer dyrket i serumfritt DMEM-F12 supplert med B-27 (1 x; Invitrogen), Insulin (4 U /l; Sigma), heparin (4 ug /ml; Sigma), EGF ( 20 ng /ml; Biomol), bFGF (20 ng /ml; Miltenyi Biotec), og penicillin /streptomycin (1x; Lonza). Cellelinje identitet ble bekreftet av kort tandem repeat genotyping ved DSMZ.
3D spheroid invasjon analysen
5000 celler av SC ble belagt i rundbunnet 96-brønners ULA plater i 100 ul DMEM- F12 medium med 1% penicillin /streptomycin. Etter 3 dager med sfære formasjon, 10% FCS og 1,25 mg /ml kollagen (PureCol, CellSystems) ble tilsatt. Etter 1 time av størkning, ble de sfæroide /kollagensuspensjon belagt med 100 ul /brønn DMEM-F12 med 10% FCS. Invasion ble overvåket ved å måle maksimal spheroid utvekst diameter etter 7 dager.
Cell vekst og spredning
heftende celler ble sådd i 6-brønns plater og SC i ULA seks-brønns plater i sine respektive medium. Etter 5 dager, ble cellene dissosiert til enkeltcellesuspensjon, farget med Trypan blått og tellet med en celletelleinnretning (CEDEX, Roche).
In vitro
begrensende fortynning kuledannelsesanalyser
SC ble dissosiert i TrypLE Express (Gibco) ved å pipettere opp og ned i 1 minutt, inkubert ved 37 ° C i 3 minutter og ført gjennom et 40 um celle sil (BD Biosciences) for å oppnå en enkelt cellesuspensjon.
enkelcelleanalyse
: Celler ble sådd ut i en tetthet på 1 celle pr brønn i en 96-brønns plate i et sluttvolum på 100 ul. Enkelt celle seeding effektivitet var ca. 30% og bare brønnene som opprinnelig inneholdt enkle celler ble evaluert for senere analyser. Spheroids ble talt etter 10-14 dager, avhengig av veksten i de ulike primær SC. 50-60 enkle celler pr tilstand ble analysert for sfære formasjon og bare sfærer er større enn 50 mikrometer i størrelse ble inkludert i analysene. Den ekstreme begrensende fortynning analyse ELDA programvare (https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/) [38] ble anvendt for å bestemme den estimerte stamcelle-frekvens for enkeltcelleanalyser.
1000 celleanalyse
. 1000 celler /brønn ble sådd i en ULA seks-brønns plate og kuler ble talt etter 7 dager
immunfluorescens
immunfluorescens ble utført på cytospins ( EZ Cytofunnels) (Thermo Scientific) for SC og på Dekk for heftcellekulturer. Prøvene ble fiksert med iskald metanol i 10 minutter ved -20 ° C, blokkert med 3% BSA /PBS-løsning, etterfulgt av inkubasjon over natten ved 4 ° C med primært antistoff. Sekundært antistoff ble applisert i 1 time ved romtemperatur; Prøvene ble montert med DAPI holdig Fluoromount G (Southern Biotech) og analysert på en konfokal mikroskop (Zeiss LSM 510 Meta). For å bekrefte at fargingen var positiv gjennom hele spheroid, ble z-stabler utført. Antistoffene anvendt er oppført i tabell S1A.
fluorescensaktivert cellesortering og flowcytometri
For flowcytometri, Prøvene ble fremstilt som tidligere beskrevet (Shmelkov et al, 2008) og kjørt på en FACS Canto II. De primære antistoffer som brukes er oppført i S1B tabell.
Sanntids qPCR
AllPrep utvinning kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ble brukt til å trekke RNA. cDNA ble oppnådd ved revers transkripsjon ved å bruke høy kapasitet cDNA revers transkripsjon kit (Applied Biosystems). Absolutte Blå qPCR SYBR grønn lav ROX Mix (Thermo Scientific), 2,5 pmol av hver primer og 5 ng cDNA per reaksjon ble anvendt, og reaksjonen ble kjørt på en 7500 FAST Sanntids PCR Detection System (Applied Biosystems) cycler med følgende innstillinger : 40x (95 ° C i 30 sek, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sek). Ekspresjonsnivåer av genet av interesse ble normalisert mot flere referansegener [39] ved å bruke qbase + programvare [40], i henhold til retningslinjene MIQE. De brukte referanse gener var: EFF1A1, B-Actin, 28S, YWHAZ. Primerene anvendt for RT-qPCR er vist i tabell S1C.
kolonidannelse assay
Celler avledet fra SC eller differensierte-kulturer ble sådd ut ved forskjellige tettheter på 250, 100, 50, 20 celler /godt i differensierende medium som inneholder serum. Etter 10 dager ble kolonier farget og telles under et mikroskop.
kjemosensitivitet analyser
For å kunne vurdere chemoresistance vi benyttet ulike analyser. Den første analysen ble basert på et 3D sfæroide system, hvor cellene er avledet fra SC eller differensierte motstykker ble sådd i en rundbunnet 96-brønns ULA plate ved en tetthet på 5000 celler /brønn i serumfritt DMEM-F12 supplert med 1% penicillin /streptomycin. Etter 3 dagers celleklump formasjon, 5-fluorouracil (5-FU) (Sigma) ble tilsatt ved forskjellige konsentrasjoner. Sfære størrelse ble målt hver 24. time i 5 dager, og sfære krymping ble vurdert ved å bestemme den relative størrelse sfære av kontroll og behandlede betingelser. Den andre analysen ble basert på et 2D-monolag systemet ved hjelp av celleproliferasjonen reagens WST-1 (Roche, Tyskland). For dette ble 30.000 celler av både SC og de differensierte motstykker sådd ut i 96-brønners plater i 200 ul DMEM-F12-medium, supplert med 10% FCS og 1% penicillin /streptomycin medium med eller uten 50 uM 5-FU. WST-1 ble tilsatt i en sluttkonsentrasjon 01:10 etter 5 dager, og det ble inkubert i 1 time ved 37 ° C og relativ overlevelse ble bestemt. I tillegg utførte vi enkelt celle og kolonidannende analyser i nærvær av 5 pm 5-FU for vurdering av chemoresistance.
In vivo
svulstdannelse analyser
Ikke-obese diabetic /alvorlig-kombinert immunsvikt (NOD /SCID) mus ble hentet fra Harlan Laboratories Nederland og eksperimenter utført i henhold til gjeldende lover og forskrifter etterfølgende skal godkjennes av institusjonens dyr omsorg og etisk komité ved University of Luxembourg (Permit Number: 14-MDM -02). Tumor-initiere kapasitet til SC i NOD /SCID-mus ble bedømt ved å fremstille seriefortynninger av celler (10. 000, 1000, 100 og 10 celler; 5-6 injeksjoner /celle dose). Enkle celler ble resuspendert i 100 ul av 1: 1 blandet serumfritt medium og matrigel (BD Biosciences) og injisert subkutant i flanken av 6-ukers-gamle mus. Tumorvekst ble fulgt 1-2 ganger i uken, og tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av formelen L * W
2/2. Enhver mus som viser alvorlige tegn på vekttap eller ubehag eller en tumorstørrelse nådde 1000 mm
3 ble fjernet fra studien og avlivet for å unngå unødvendig smerte og ubehag i henhold til de etiske retningslinjer. For serie transplantasjoner, ble svulster Eksplanterte, dissosiert i kultur og re-injisert i andre mottaker mus. Deler av generert xenotransplantater ble farget med eosin og hematoksylin og analyseres av en patolog. For å direkte sammenligne SC med sin differensiert motstykke, valgte vi den laveste dosen testet (10 celler /injeksjon for T20 og 100 celler /injeksjon for HT29; n = 5) og celler avledet fra differensierte eller sfæroide kulturer ble injisert på høyre og venstre flanke henholdsvis .
mikromatriser og mutasjon profilering
mikromatriser ble utført ved Luxembourg Institute of Health (LIH) etter RNA kvalitet og renhet kontroll på en 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Affymetrix genet chip Menneskelig Gene ST v2.0 arrays ble utarbeidet i samsvar med standardprotokollen. Microarray data ble preprocessed bruker Robust Multiarray Analysis (RMA) algoritme med GC-korreksjon ved hjelp av kommersiell programvare Partek Genomisk Suite (versjon 6.6, Copyright 2015 Partek Inc., St. Louis, MO, USA). Tre replikater ble kjørt for alle vilkår for mikromatriser unntatt T18 som vi kjørte 4 tekniske replikater. Vi måtte ta ut en prøve av HCT116-cellelinjen, på grunn av sin lave kvalitet etter hybridisering. Data ble analysert og resultatene visualisert i R /Bioconductor (versjon 3.1.2). Microarray data er tilgjengelige i ArrayExpress database under deponeringsnummer E-mtab-3575. Mest mutasjoner ble vurdert ved hjelp av TruSeq Amplicon-Cancer panel (TSACP) med MiSeq plattformen i henhold til Illumina retningslinjer med følgende kriterier: dybde 1000 og en variant frekvens på 0,05. For etiske formål var vi ikke i stand til å inkludere mutasjons profil for pasienten T6.
Differensial genekspresjon og overlevelsesanalyse
Mikromatriser (ArrayExpress database, sjonsnummer E-mtab-3575) ble utført i henhold til standard protokoller (se supplerende materiale og metodedelen). Differensielt uttrykte gener mellom SC og de respektive differensierte kolleger ble bestemt ved hjelp av lineær modellering med empirisk bayesiansk tilnærming realisert i
limma
pakke (https://www.bioconductor.org/packages/release /bioc /html /limma. html). En felles sfære gensignaturen mellom primær og cellelinje avledet SC ble bestemt som krysset av oppregulert gener med FDR 0,05 og logge ganger endring log2FC 0,6. To uavhengige offentlig tilgjengelige datasett fra en samling som er tilgjengelige i databasen PROGgeneV2 [41] som inneholder data om den totale overlevelse av CRC pasienter ble anvendt for å danne overlevelseskurver: GSE17536 [42] sammensatt av 177 pasientprøver og GSE29621 [43] som består av 64 pasientens prøver. Vi fant en signifikant sammenheng med dårlig pasient overlevelse i disse 2 datasett blant en samling tilgjengelig i nevnte verktøyet. Datasettet GSE39582 [44] består av 566 pasientprøver ble brukt for å undersøke effekten av de identifiserte sfære genet signatur på sykdomsfri overlevelse.
Statistisk analyse
GraphPad Prism 5 programmet ble brukt for statistisk analyse. Vi brukte uparede Student t-test for å sammenligne 2 forhold og to-veis ANOVA test med Bonferroni post-tester for å sammenligne behandlingseffekter over tid. Alle forsøkene ble utført i minst 3 uavhengige eksperimenter med mindre annet er oppgitt.
Resultater
Generert SC avledet fra primær svulstvev beholde egenskapene til opprinnelige svulster
Vi først vurderes muligheten å berike for tics i CRC prøver ved hjelp av flere av de tidligere rapporterte mulige overflatemarkører. Uttrykket av antatte stamcellemarkører CD44, CD24, EpCAM, CD166 og CD133 ble analysert ved flowcytometri. Vi fant at pasient biopsi er svært heterogen med tanke på fenotypiske markører (S1 Fig), avhør deres pålitelighet for identifisering av tics. Vi videre besluttet å sortere celler direkte fra pasient eller cellelinje-avledet SC i henhold til deres CD133 uttrykk og utføres funksjonelle encellete analyser. Sfæren forming celle (SFC) frekvens var lik mellom CD133 lav, middels og høy befolknings (S1 figur), noe som tyder på at CD133 uttrykk korrelerer ikke til økt sfære dannende kapasitet. Langs samme linje, flere
in vivo
studier viser at CD133 + og CD133- celler danner svulster med lik effektivitet [34,45,46]. Samlet er disse resultatene tyder på at mulige TIC markører er ikke pålitelig for identifisering av tics i vårt system.
SC kan reflektere svulst heterogenitet slik den eksisterer i pasienter og har blitt beskrevet å bli beriket i tics. Vi samles frisk tykktarmskreft vev fra 35 pasienter som ikke hadde fått kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. Etter enzymatisk fordøyelse, ble enkeltcellesuspensjon sådd ut i SCM for å fremme vekst sfæroide. Vevsprøver av 5 av 35 pasienter (15% effektivitet) førte til en stabil primær SC at vi var i stand til å opprettholde kulturen i lengre passasjer (mer enn 20 passasjer) (fig 1
A Hotell og S2 tabell). De resterende tykktarmskreft vev førte ikke til sfære formasjon eller mistet sin sfære dannende kapasitet etter noen passasjer. Det er bemerkelsesverdig at den suksessraten observert sammenlignes med andre forsøk på å etablere SC fra kolorektal tumorvev [47,48]. De biopsier som ga opphav til stabile SC var av ulike histologiske stadier av CRC (S2 tabell). Tre primære SC T6, T18 og T20, som representerer stadium IIIC, stadium IIA og scenen IVA CRC henholdsvis ble valgt for karakterisering (S2 tabell). Interessant, SC avledet fra T6 og T20 pasienter viste en økt invasiv kapasitet i forhold til T18 spheroid kultur, som ble hentet fra et tidligere stadium, nemlig stadium II (fig 1
B
og en
C
). Dette resultatet tyder på at SC avledet fra primære svulster kan beholde de invasive egenskapene deres svulst opprinnelse. Men denne observasjonen skal videre opp i mye større kohortstudier. Spesielt, flere CRC-relevante mutasjoner påviselige i tumoren opprinnelses var også til stede i den primære SC (S2 Fig). Vi i tillegg etablert heft differensierte kolleger av den primære SC (Fig 1
En
og Material og metoder avsnitt). Sammenligningen av SC med sine respektive motparter differensierte fra den samme pasient kan tillate å studere SC-spesifikke egenskaper med hensyn til tics. I nærvær av serum, SC endrer deres fenotype og vokse som et vedheftende cellelaget. Interessant, tilhenger differensierte kolleger viste økt spredning i forhold til SC (S3 fig). Dessuten bruker primær svulstvev, vi også testet muligheten for CRC cellelinjer for å danne SC. HT29, HCT116, LS174t, SW480 og SW620-cellelinjer ga opphav til sfærer over flere passasjer mens holdes i SCM (figur 1A og data ikke vist). Konsekvent til SC avledet fra primær vev, HT29- og HCT116- avledet SC viste en lavere spredning hastighet i forhold til foreldre tilhenger motstykke (S3 fig). Denne observasjonen, noe som er i tråd med tidligere studier [35,36], avslører at ved differensiering, erverve tics økt proliferative egenskaper. I de følgende forsøk, har vi fokusert på den omfattende karakterisering av tre SC etablert fra primære pasientmateriale og to SC avledet fra CRC cellelinjer, nemlig HT29 og HCT116.
(
en
) Morfologiske egenskaper 2 CRC cellelinjer (HT29, HCT116) og 3 primære pasientsvulster (T6, T18, T20) dyrket som SC (S, venstre panel) og deres differensierte kolleger (
D
, panel til høyre). (
b
) 3D spheroid invasjon analysen av SC avledet fra primær svulstvev T6, T18 og T20. Representative bilder av innebygde kuler etter 7 dager etter invasjonen. (
c
) Kvantifisering av den maksimale sfæroide utveksten diameter (um) etter 7 dager med invasjon. Representant figur av 3 uavhengige eksperimenter, skala bar = 100 mikrometer. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 8); * P 0,05, ** P. 0,01
spheroid kulturer viser uttrykk for stemness proteiner
For å undersøke nærmere de fenotypiske forskjeller mellom SC og de respektive differensierte kolleger analyserte vi uttrykk for viktige stemness proteiner som SOX2, OCT4, Nanog og LGR5 samt CK20, en nøkkel epitelial differensiering markør. Transkripsjonsfaktorer OCT4, SOX2 og Nanog er kjent som mester regulatorer av pluripotency og er ansvarlig for å opprettholde en udifferensiert tilstand [49] samt favoriserer selvfornyelse kapasitet på tics [50]. SC viste høye nivåer av stemness proteiner mens CK20 var knapt uttrykt (fig 2
A
). Viktigst, heft differensiert kolleger uttrykt CK20 og mistet uttrykk for viktige stemness proteiner. I likhet med protein nivåer, ble uttrykket av nøkkel stemness gener økt i SC i forhold til differensierte kulturer (fig 2
B
). Interessant,
LGR5
er sterkt uttrykt i primær SC, i motsetning til SC avledet fra CRC-cellelinjer (fig
2A og 2B
). Vi vurderte også uttrykk for β-catenin, en funksjonell markør for CRC stemness, og fant en høyere uttrykk i SC (fig 2
B
). Til sammen disse dataene viser at SC-skjerm høyere nivåer av stemness og lavere nivåer av epitel differensiering markører.
(
en
) Immunofluorescensanalyse farging av SC avslører en økt uttrykk av nøkkel stemness proteiner SOX2, OCT4 og LGR5, og en redusert uttrykk for CRC differensiering markør CK20 sammenlignet med heft differensierte kolleger. NTERA-2 humane embryonale karsinom-celler ble anvendt som positiv kontroll for farging og viser en tilsvarende signalintensitet for alle vurderte pluripotency markører (data ikke vist). Forstørrelse 40x. (
b
) Gene uttrykk for viktige stemness gener av SC og differensierte kolleger. Representant figur av 3 uavhengige eksperimenter. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD, * P 0,05, ** P 0,01, *** P. 0,001, ns = ikke signifikant
spheroid kulturer og heft differensierte kolleger vise lignende selv fornyelse og tumor-initiering kapasitet
Vi var interessert i å bestemme funksjonelle forskjeller i forhold til TIC egenskaper mellom SC og tilhenger differensierte kolleger. I begynnelsen prøvde vi å utføre sfære formasjons analyser av plating ulike celletettheter. Mange studier om tics viser selvfornyelse kapasitet ved hjelp av kuleformasjons analyser ved såing høyt antall celler per brønn. Men i vår erfaring og som allerede nevnt av andre [33], plating høy celletetthet fører til sfære formasjon gjennom aggregering og fusjon fulgt av påfølgende spredning i stedet for gjennom selvfornyelse kapasitet på en celle, og dermed forfalske sfære danner kapasitets resultater de ( S4A fig). Derfor, for å sikre sann klonalitet og ikke sammensmelting eller aggregering av celler vi utførte kuledannelses analyser på celle-nivået. Den tre stabil primær SC og to SC avledet fra CRC cellelinjer alle vises selvfornyende kapasitet som ble opprettholdt over flere passasjer (fig 3
A
). For pasienten T6, det var en sfære forming celle (SFC) i 9,14 celler for passering en, en SFC i 7,51 celler for passering to og en SFC i 11.66 celler for passasje 3 (S3 Table). Påfallende, T20, avledet fra en pasient som allerede hadde metastaser ved reseksjon, viste en økt SFC frekvens i forhold til T6 og T18 (S3 tabell). Interessant, stiger SFC frekvens fra tidlige passasjer (passasje 5) til sene passasjer (passasje 15-25), og dermed tyder på at kulturer opprettholdes i stamcelle berikende forhold viser økt TIC atferd over tid (figur 3
B
). Selv etter langvarig kultur i SCM, SC som er overført til differensiere dyrkningsforhold har fortsatt kapasitet til å følge og morfologisk ligne den differensierte motpart eller foreldrecellelinje (fig 1
A Hotell og S5D figur).
(
en
) Sphere dannelseshastigheten ble bestemt over flere generasjoner (gen.) ved såing enkeltceller av tidlig passasje SC vokst fra primær svulstvev og CRC cellelinjer. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. (
b
) selvfornyelse kapasitet på tidlig (passasje 5) og sen (passasje 15-25 avhengig av tumor) SC fra primær svulstvev. Data er presentert som gjennomsnitt med 95% konfidensintervall.
Neste, vi studerte tumorigent potensialet i SC. Primær SC generert fra svulstvev fra pasienter T6, T18 og T20 var i stand til å indusere tumordannelse i NOD /SCID-mus med celle tall fra 10.000 celler til 10 celler per injeksjon (fig 4
A
). TIC frekvens varierte fra ett i 6-1 i 22 sfæroide celler avhengig av respektive pasientprøven (S4 tabell). Tilsvarende SC avledet fra CRC cellelinjer også initiert tumorvekst i mus med celle tall fra 10.000 celler til 100 celler (S6a fig og S4 Table), men HCT-116 SC hadde en lavere svulst forekomst i forhold til primær SC (S4 Table) . I begge tilfeller, tumor vekt pent korrelert med injisert celle tall (Fig
4B Kjøpe og S6B Fig). Interessant, primære SC etablert fra tumor eksemplar av pasient T20 var i stand til å indusere tumordannelse hos mus mye raskere med høyere forekomst av svulster i forhold til T6 og T18 SC (Fig 4
A Hotell og S4 tabell). Fenotypen av T20-avledede SC, som er kjennetegnet ved høy frekvens SFC, tumorforekomst og tumorproliferasjon understrek og sammenfatter den aggressive natur av den primære tumor til pasienten T20. Seks til femten uker etter primær transplantasjon, ble svulster Eksplanterte, dissosiert til enkeltceller og serielt transplantert inn sekundære mottaker mus. Injeksjoner av 10.000 og 1000 celler tillot dannelse av en tumor i sekundær resipientmus. 0,05.
