Abstract
Fhit protein blir tapt eller reduseres i en stor fraksjon av humane tumorer, og dens restaurering utløser apoptose og hemmer tumordannelse eller progresjon i prekliniske modeller. Her beskriver vi identifisering av kandidat Fhit-samspill proteiner med cytosoliske og plasma membran lokalisering. Blant disse ble Annexin 4 (ANXA4) validert av co-immunoprecipitation og konfokalmikroskopi som partner i denne romanen Fhit proteinkompleks. Her kan vi rapportere at overekspresjon av Fhit hindrer Annexin A4 trans fra cytosol til plasma membran i A549 lungekreft celler behandlet med paklitaksel. Videre paclitaxel administrasjon i kombinasjon med Ad
FHIT
virker synergisk for å øke apoptotiske frekvensen av tumorceller både
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter.
Citation: Gaudio E, Paduano F, Spizzo R, Ngankeu A, Zanesi N, Gaspari M, et al. (2013) Fhit Delocalizes Annexin A4 fra plasmamembranen til cytosol og sensitizes lungekreft celler til Paclitaxel. PLoS ONE 8 (11): e78610. doi: 10,1371 /journal.pone.0078610
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, Universitetet i Catanzaro, USA
mottatt: 26 mars 2013; Akseptert: 14. september 2013, Publisert: 06.11.2013
Copyright: © 2013 Gaudio et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av AIRC (Associazione Italiana Ricerca Cancro) og National Institutes of Health (NIH) tilskudd CA152758 (CMC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
FHIT
genet, som omfatter
FRA3B
, den mest aktive felles skjøre området på kromosom 3p14.2 [1], [2] er et medlem av histidin triaden (HIT) familie av proteiner, som omfatter en gruppe av nukleotid-binding og hydrolysere proteiner med histidin triaden motiver, representert i alle organismer [3].
FHIT
koder for et tumor suppressor protein som tap er innblandet i en stor andel av kreft; faktisk, har sin delesjon eller tap av ekspresjon er rapportert i hode og hals [4], [5], gastrointestinal [6], cervical [7], lunge [8], bryst [9], [10], og hematopoetisk tumorer [11]. Rollen til Fhit i tumorgenese ble bekreftet i mus, hvor
Fhit
genetisk ablasjon resulterte i økt mottakelighet for et bredt spektrum av spontane tumorer [12], [13]. Videre sletting av enten en eller begge
Fhit
alleler hos mus forbedret følsomhet for kreftfremkallende N-nitrosomethylbenzylamine (NMBA), med mest
Fhit
– /- Hotell og
Fhit
+/- mus utvikler forestomach tumorer (adenomer, papillomer og invasive karsinomer) etter at en dose av NMBA sammenlignet med villtype-kontroller [12], [14] som er utviklet svært få. Interessant,
FHIT
ble også med hell anvendes som et terapeutisk gen i cancercellelinjer, hvor det utløser apoptose, og flere prekliniske modeller av
FHIT
-null kreft, inkludert lungekreft, spiserør, bukspyttkjertel, bryst og leukemi [15] – [20]. Imidlertid har rapporter om mekanismene for Fhit suppressor funksjon vært mer sparsom og nyere. Fhit koder et diadenosine polyfosfat (Apna) hydrolase som kløyver underlag som diadenosine
P
1,
P
3 trifosfat (ApppA) og diadenosine 5 «, 5» « «-
P
1,
P
4–tetrafosfat (AppppA) til AMP pluss andre nucleotide [21], [22]. Gjennom adenovirus uttrykk for
FHIT
mutante alleler, viste vi at Fhit-substrat bindende er begrensende for svulst undertrykkelse, mens den katalytiske aktiviteten ikke er nødvendig for Fhit evne til å utløse apoptose [23]; Videre viste vi at høyt konservert Fhit tyrosin 114 (Y114), som kan bli fosforylert av Src [24], er nødvendig for å utløse den caspase-avhengige Fhit-mediert apoptose [25]. I den senere tid ved hjelp av en proteomikk tilnærming, identifiserte vi en Fhit proteinkompleks inkludert hsp60 og Hsp10, som kan formidle både Fhit stabilitet og dens mitokondrielle lokalisering; en gang i mitokondriene, binder Fhit og stabiliserer ferredoxin reduktase (Fdxr), som fører til modulering av produksjon av reaktive oksygenarter (ROS), et tidlig trinn i Fhit-indusert apoptose [26]. Beviset for Fhit mitokondriell lokalisering også ført til den erkjennelse at det øker akkumulering av Ca2 + inn i organeller, i samsvar med dens rolle i apoptose under passende betingelser [27].
bred subcellulære fordeling av Fhit oppmuntret oss å fortsette jakten på romanen Fhit protein partnere for å videre belyse sin rolle i tumor undertrykkelse. Her viser vi at Fhit samhandler med Annexin 4; dette samspillet kan blokkere translokasjon av Annexin 4 fra cytosol til plasma membran under behandling av lungekreft celler med paclitaxel. Som en konsekvens av eksogene
FHIT
restaurering i
FHIT
-null kreftceller fungerer i synergi med paclitaxel i utløser apoptose
in vitro Hotell og tumor regresjon
in vivo
. Til sammen våre funn tyder på at Fhit restaurering kunne ha en rolle i å overvinne legemiddelresistens og at kombinasjon med paclitaxel kan representerer en gyldig metode for kreftbehandling.
Resultater
Isolering av Fhit protein komplekser fra celle membraner
I forrige proteomikk tilnærming, isolert vi et løselig Fhit proteinkompleks fra A549 kreftceller [26]. Ved å bruke en litt modifisert tilnærming, med sikte på å identifisere Fhit-samspill proteiner i cellemembraner, vi brukte en rekombinant adenovirus som bærer en
FHIT
cDNA endret på sitt 3 «ende med en sekvens som koder for en histidin-seks epitop tag ( Ad
FHIT-
His6), som tidligere beskrevet [26]. Kort fortalt ble A549 lungekreftceller infisert med enten Ad
FHIT plakater (brukt som en kontroll) eller Ad
FHIT-
His6 på MOI50 og behandlet med ditiobis [succinimidylpropionate] (DSP), et kors -linker som krysser membraner og løser proteiner i komplekse i levende celler. Celler ble lysert og membran anrikede fraksjon isolert; Fhit-His6 rekombinant protein sammen med sine kandidat protein partnere ble isolert med nikkel perler Avid for His6 epitop tag. Rensede proteiner ble behandlet med ditiotreitol (DTT) for å spalte DSP og dissosiere komplekset, og fordøyd med trypsin; proteinkomponenter ble identifisert ved hjelp av væske /kromatografi tandem massespektrometri (LC-MS /MS). Etter protein identifikasjon av database-søk, inspeksjon av LC-MS /MS data ble gjennomført for å vurdere eksklusive nærvær av masse topper som tilhører kandidat partner proteiner i prøver fra celler infisert med Ad
FHIT-
His6. Proteiner er identifisert er oppført i Tabell 1.
Fhit protein samhandler med Annexin 4
Det ble tidligere vist at fravær av Fhit protein i kreftceller resulterte i motstanden mot paklitaxel [28] ; Annexin 4, et protein med både plasmamembran og cytoplasmisk lokalisering, er blitt rapportert å være overuttrykt i mange kreftceller; Spesielt har det blitt demonstrert at Annexin 4 overekspresjon medvirker til kreftceller som er resistente mot paclitaxel [29]. Derfor, for å belyse mekanismene for resistens i
FHIT
minus-kreftceller, bestemte vi oss for å fokusere på Annexin fire blant de fersk identifiserte kandidat Fhit partnere. Annexin 4 tilhører en superfamilie av nært beslektet kalsium- og membranbindende proteiner som deltar i en rekke forskjellige cellulære funksjoner, blant annet vesikkel trafikk, celledeling, apoptose, kalsiumsignalisering og vekstregulering. Det er blitt foreslått at noen endringer i annexin ekspresjon i løpet av tumorgenesen kan føre til resistens mot kjemoterapeutiske midler, og at de enkelte annexins kan vise seg å være terapeutiske mål [30] – [35]. Den Annexin 4 (ANX4) genet koder for et protein (nemlig ANX4 eller A4) nesten utelukkende uttrykt i epitel-celler [31] og overuttrykkes i løpet av paclitaxel behandling og i paclitaxel-resistente cellelinjer; transfeksjon av ANX4 cDNA inn i 293 T celler resulterte i en tredobling i paclitaxel motstand [29], [36]. En sammenheng mellom forekomsten av Annexin 1 (ANX1) og MDR (multiresistens) proteiner i brystkreftceller, ga den første direkte bevis for en rolle i en annexin i multiresistens [37].
For å vurdere Fhit og Annexin 4 interaksjon, utførte vi en ko-immunoutfelling eksperiment ved å bruke protein lysater fremstilt som beskrevet ovenfor (figur 1, A og B). Fhit og Annexin 4 colocalization ble undersøkt av konfokal mikroskopi. Som vist i figur 1E, både Fhit og Annexin 4 viser i hovedsak en cytoplasma subcellulære colocalization.
A. A549 lungekreft celler ble infisert med Ad
FHIT
-wild type eller Ad
FHIT-
His6 på MOI50; 48 timer etter infeksjon, ble cellene behandlet med DSP og lysert med Mem-PER Eukaryote Membrane Protein Extraction Kit for å tilveiebringe total lysater anriket i membranfraksjon. Totalt lysatene ble immunopresipitert med nikkel perler. Immunopresipitater ble analysert ved immunblotting (IB) med anti-Fhit og anti-Annexin A4- antistoffer. B. A549 celler ble transient transfektert med et uttrykk plasmid som koder for pattedyr
Annexin4-
V5 (8 mikrogram). 48 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med DSP og total lysater ble immunopresipitert (IP) med anti-V5-antistoff. Immunopresipitatene ble analysert ved immunblotting (IB) med anti-Fhit og anti-Annexin 4-antistoff. C-D. HEK293 celler ble mock tretated eller tretaed med paclitaxel i 24 timer (800 Nm) og lysert. Totalt proteinlysatene ble Immunoprecipited med IgG, Fhit og annexin 4 antistoffer, som angitt. Påvisningen av endogent Annexin 4 og Fhit ble utført uten anvendelse av DSP-tverrbinder.
Som vist i figur 1A og 1B, Fhit og Annexin 4 interaksjon var hovedsakelig påvist i cytosoliske ekstrakter. Vi har videre utført ko-immunoutfellingsstudier eksperimenter på endogen Fhit og annexin-4-proteiner i HEK293-celler og vi demonstrert samspillet mellom disse proteinene også i fravær av DSP-tverrbindingsmiddel, enten med eller uten paclitaxel (figurene 1C og 1D). Den immunoprecipitation utføres med Fhit antistoff etterfulgt av en immunblotting utført med en Annexin fire antiserum, var helt klart tyder på en Fhit-Annexin fire endogent kompleks i intakt cells.the direkte måte av IP-adresser mellom endogene proteiner var klart i samspillet (IP : Fhit, og IB: Annexin 4). Dessverre, på grunn av tekniske problemer på grunn av co-migrering av IgG og Fhit protein, motsatt tilnærming, er at immunoprecipitation av endogen Annexin 4 protein fulgt av Fhit deteksjon, ble unsuccessuful.
Fhit overekspresjon blokker Annexin 4 translokasjon fra cytosol til plasmamembranen
Fhit og Annexin fire protein-ekspresjon ble undersøkt i et panel av kreftcellelinjer (fig S1), er Fhit uttrykk tapt i de fleste cellelinjer som ble undersøkt. For å kaste lys over betydningen av Fhit-Annexin fire proteinkompleks, utførte vi våre eksperimenter på to av dem, A549 og Calu-2, som viser liten eller ingen Fhit uttrykk, henholdsvis. For bedre å definere subcellulære lokalisering av Fhit-Annexin fire proteinkompleks, utførte vi cellulære fraksjoneringsforsøk. Som vist på figurene 2A og 2C, er basal Annexin 4 distribuert i både cytosol og plasmamembran. Behandling av A549 og Calu-2 lungekreftceller med paclitaxel indusert cytosoliske uttømming av Annexin 4 som gjennomgikk en tilsynelatende fullstendig translokasjon til den indre siden av plasmamembranen. Fhit overekspresjon blokkert Annexin fire trans fra cytosol til plasma membran, observert etter paclitaxel administrasjon. For å vise at virkningen var spesielt drevet av Fhit-Annexin 4 interaksjon, ble et lignende eksperiment utført med tanke på den subcellulære lokalisering av Annexin 1 og MDR (multimedikamentresistens-protein), som begge er involvert i resistens mot kjemoterapi [37] [38]. Som vist i figur 2B og 2D, ble verken Annexin jeg eller MDR subcellulære lokalisasjoner påvirket av Fhit overekspresjon. Samlet utgjør disse dataene indikerer at Fhit protein forstyrrer spesielt med Annexin fire trans fra cytosol til plasma membran, observert i paclitaxel-behandlede A549 og Calu-2 celler.
A-C. A549 og Calu-2 lungekreft celler ble infisert med Ad
GFP
eller Ad
FHIT
MOI50; 48 timer senere ble cellene mock-behandlet eller behandlet med paclitaxel (800 nM) i ytterligere 24 timer. Proteiner fra cytosoliske og membranfraksjoner ble separert på en polyakrylamidgel, overført til nitrocellulosefilter, og probet med Annexin 4 antistoff. GAPDH og E-cadherin ble anvendt for å normalisere protein lasting av cytosoliske og plasmamembranproteiner, respektivt. B-D. A549 og Calu-2 lungekreft celler ble infisert med Ad
GFP
eller Ad
FHIT
-wild-type; 48 timer senere ble cellene behandlet med paclitaxel (800 nM) i ytterligere 24 timer. Proteiner fra cytosoliske og membranfraksjoner ble separert på en polyakrylamidgel, overført til nitrocellulosefilter, og probet med Annexin 1 og MDR (multimedikamentresistens protein) antistoff. GAPDH og E-cadherin ble brukt til å normalisere protein lasting av cytosoliske og plasma membran proteiner, henholdsvis.
Annexin 4 uttømming kombinert med Fhit overekspresjon og paclitaxel behandling synergi induserer hemming spredning og utløser apoptose av lungekreftceller
for å undersøke rollen til Fhit-mediert blokk av Annexin fire translokasjon fra cytosol til plasmamembranen i mekanismen for medikamentresistens, utførte vi cellevekstkurver under forskjellige forhold. Som vist i figur 3A og 3B for A549 og Calu-2 lungekreftceller, ble celletallet redusert i Ad
FHIT-
infiserte celler sammenlignet med kontroller; en litt sterkere hemming av cellevekst ble observert i celler behandlet med paclitaxel. Til slutt, i samsvar med tidligere rapporter [26], observerte vi en synergistisk effekt på proliferasjonsrate hemming i A549 celler behandlet med paclitaxel pluss Ad
FHIT
. I et representativt eksperiment illustrert i figur 3C, flowcytometri ble brukt til å undersøke cellesyklus forstyrrelser i A549 celler infisert med Ad
FHIT
, med (800 nM i 24 timer) eller uten paclitaxel behandling; A549 celler infisert med Ad
FHIT
viste en sub-G1 peak var påviselig (13%), i tråd med våre tidligere funn [26]; en lignende virkning ble oppnådd etter 800 nM paclitaxel administrasjon. En synergistisk effekt ble oppdaget etter å kombinere Ad
FHIT Hotell og paclitaxel behandling (25% av sub-G1 fraksjon).
A-B. A549 og Calu-2 celler var mock-smittet, Ad
GFP
eller Ad
FHIT
infiserte celler på MOI10 i 24 timer, deretter behandlet med eller uten 800 nM paclitaxel for ytterligere 6 timer og telte . Bar grafene viser gjennomsnitt ± SEM for verdier fra tre ulike eksperimenter (* P 0,05). Chou-Talalay methos ble brukt for å beregne innholdet av kombinasjonene (CI 1, synergisme). C. A549 celler var enten mock-infiserte eller infisert med Ad
GFP
eller Ad
FHIT
, eller ubehandlet eller behandlet med 800 nM paclitaxel, og deretter analysert ved flowcytometri.
Disse dataene tyder på at gjenopprettelse av Fhit funksjon til Fhit-negative maligne celler, i kombinasjon med paclitaxel, kan representere en potensiell ny fremgangsmåte for behandling av pasienter som lider av lungekreft. Faktisk, ved å senke terskelen for følsomhet for narkotika administrasjonen i Annexin 4-mediert kjemoresistent svulster, kan Fhit restaurering representere en spennende tilnærming for å få en bedre pasienter utfall.
For å finne ut om samspillet mellom Fhit og Annexin 4 kunne ha en rolle på Fhit-mediert hemming av cellevekst og apoptose, Annexin fire ble brakt til taushet med små interfererende RNA (siRNAs) er utformet for å blokkere Annexin 4 protein uttrykk. Som vist i figur 4A, ble Annexin 4-protein ekspresjonsnivåer betydelig redusert etter Annexin 4 sirnas transfeksjon, i fravær eller nærvær av paclitaxel. I samsvar med tidligere studier [36], mock-transfekterte celler og celler transfektert med egge sirnas viste Annexin 4 protein oppregulering etter paclitaxel administrasjon sammenlignet med kontroller, mens ble det ikke observert endringer i A549 Annexin 4-utarmet prøver enten i fravær eller nærvær av paclitaxel. Kombinasjonen av paclitaxel behandling med Annexin 4 uttømming hadde en synergistisk effekt på inhibering celleproliferasjon, med celletallet er betydelig lavere sammenlignet med behandling med paclitaxel eller Annexin 4-spesifikk siRNA alene (figur 4B). Ingen effekt på spredning ble observert etter transfeksjon med egge sirnas. Vi testet også A549 celleproliferasjon sats etter Annexin 4 lyddemping eller infeksjon med Ad-
FHIT
MOI25 eller kombinerte behandlinger (Figur 4C). Annexin 4 uttømming og Fhit overekspresjon forårsaket en signifikant reduksjon i celletallet sammenlignet med kontroller; en ytterligere dramatisk reduksjon i celletallet ble observert ved tilsetning av paclitaxel, noe som indikerer en synergistisk effekt.
A. A549 celler var mock-transfektert eller transfektert med Annexin 4 sirnas (50 Nm) eller egge sirnas (50 Nm) i 72 timer. Celler lysatene ble immunoblottet med Annexin 4 og GAPDH antistoffer. B. A549 celler ble mock transfektert eller transfektert med Annexin 4 sirnas (50 nm) eller egge siRNA (50 nM), infisert med Ad
FHIT
MOI25 i 72 timer, og deretter til venstre ubehandlet eller behandlet med paclitaxel ( 800 nM). Cellene ble først regnet 12 timer etter paclitaxel behandling. Bar grafene viser gjennomsnitt ± SEM for verdier fra 3 eksperimenter (* P 0,05). Chou-Talalay methos ble brukt for å beregne innholdet av kombinasjonene (CI 1, synergisme). C. A549-celler ble transfektert uekte eller transfektert med Annexin 4 siRNA (50 nM) eller egge sirnas (50 nM) i 72 timer, deretter ubehandlet eller behandlet med paclitaxel. Cellene ble først regnet 12 timer etter paclitaxel behandling. Bar grafene viser gjennomsnitt ± SEM for verdier fra 3 eksperimenter (* P 0,05). Chou-Talalay methos ble brukt for å beregne innholdet av kombinasjonene (CI 1, synergisme). D. A549-celler, behandlet som beskrevet i B og C, ble analysert ved TUNEL assay.
A TUNEL-analysen bekreftet at alle sub-populasjoner G1 er beskrevet i figur 3C var hovedsakelig sammensatt av apoptotiske celler (figur 4D). Videre ble også parallelt effektene på hemming celleproliferasjon av resultatene av en TUNEL analysen; faktisk, apoptose nådde sitt høyeste grad i Annexin 4-utarmet celler infisert med Ad
FHIT Hotell og behandlet med paclitaxel (Figur 4D).
Fhit /Annexin 4 samhandling pluss paklitaxel indusert tumorregresjon i en preklinisk modell av lungekreft
for å undersøke effektene av Fhit /Annexin A4 samhandling
in vivo
med eller uten paclitaxel i en preklinisk modell av lungekreft, utførte vi et eksperiment på 11 grupper av mus (n = 5 mus /gruppe). Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Ohio State University godkjent denne studien. Tre grupper ble subkutant injisert med 1 x 10
7 A549 celler. Når tumorer nådde 15 mm i diameter, ble musene behandlet mock-, behandlet med DMSO eller behandlet med en enkelt intravenøs administrering av 40 mg /kg paclitaxel; Musene ble overvåket på en jevnlig basis. Tre dager senere ble musene avlivet og tumorene ble evaluert etter vekt. Svulster fra mus behandlet med paclitaxel viste en 50% reduksjon i forhold til kontrollene. Denne korte endepunktet tillot oss å forsterke virkningene av både enkelt tretaments og deres kombinasjon, som med lengre tidspunkter effekten av Fhit behandlingen ville bli dekket av paclitaxel. To grupper av mus ble injisert med 1 × 10
7 A549 celler pre-infisert med Ad
GFP
eller Ad
FHIT
MOI50, og to mer grupper ble injisert med 1 × 10
7 A549 celler pre-infisert med Ad
FHIT
ved lav mangfold av infeksjon (MOI5); en av de sistnevnte gruppene ble også behandlet med paklitaxel, som beskrevet ovenfor. Tumor vekt viste 83% reduksjon i forhold til kontrollene i mus injisert med Ad
FHIT
MOI50 pre-infiserte celler versus 27% reduksjon i mus injisert med Ad
FHIT
MOI5; interessant, Ad
FHIT
MOI5 xenografter behandlet med paclitaxel viste tumor regresjon til 7% av kontroll svulster, noe som indikerer en synergistisk effekt av Fhit og paclitaxel.
For å fullføre panel, to grupper av mus var injisert med Annexin 4-utarmet celler (en som ble behandlet med paklitaksel, som beskrevet ovenfor) og to grupper med Annexin 4-utarmet celler pre-infisert med Ad
FHIT
MOI5 (en behandling med paclitaxel). Annexin-4-utarmet celler viste en svak, men ikke signifikant tumor-reduksjon sammenlignet med kontroller, mens en høyere reduksjon ble observert i Annexin 4-utarmet xenotransplantater behandlet med paclitaxel sammenlignet med xenotransplantater ble behandlet med paclitaxel alene (70% og 50%, respektivt). Endelig, nesten ingen svulster ble oppdaget i mus med xenografter med slått ned Annexin fire pre-infisert med Ad
FHIT
MOI5 pluss paklitaxel. Resultatene av disse forsøk er angitt i figur 5A og 5B. Samlet utgjør disse dataene understreker betydningen av Fhit /Annexin 4 samhandling
in vivo Hotell og fremheve verdien av kombinert Fhit genterapi og cellegift i prekliniske kreft modeller.
A. Nude mus ble subkutant injisert med 1 x 10
7 A549 celler. Noen grupper (n = 5 mus /gruppe) ble injisert med mock behandlede celler, andre med celler transfektert med Annexin 4 siRNA eller infisert med Ad
FHIT plakater (MOI5 eller MOI50) eller kombinasjoner av begge. Når tumorer nådde 15 mm i diameter, ble musene behandlet mock-, behandlet med DMSO eller behandlet med en enkelt intravenøs administrering av 40 mg /kg paclitaxel; Musene ble overvåket på en jevnlig basis. Tre dager etter PTX ble musene avlivet og tumorene ble evaluert etter vekt. Bar grafene viser gjennomsnitt ± SEM for verdier fra 5 mus (* P 0,05). Chou-Talalay methos ble brukt for å beregne innholdet av kombinasjonene (CI 1, synergisme). B. Tumor volumer rapporteres over tid.
Diskusjoner
Tap av Fhit uttrykk under tumorigenesis har blitt rapportert for de fleste typer kreft hos mennesker. Dens rolle i ondartede sykdommer understrekes av det faktum at Fhit tap er en tidlig begivenhet i tumorer, som rapportert for lunge-forstadier til kreft. Også den vellykkede
FHIT
genterapi i en rekke prekliniske modeller for kreft hos mennesker gjør Fhit protein en god kandidat for å lete etter innovative terapier [1]. Til tross for arbeidet med å avklare hvordan Fhit protein fungerer, definere konkrete mekanismer gjennom hvilke Fhit modulerer apoptotiske og andre tumor suppressor funksjoner har vært utfordrende. Dette skyldes i hovedsak det faktum at inntil for få år siden, Fhit hadde ingen bekreftet protein partnere identifisert ved konvensjonelle studier rettet mot isolering av protein-protein komplekser. Vi har rapportert isolering av Fhit-samspill proteiner av en proteomikk tilnærming [26]; Undersøkelsen førte til isolering og karakterisering av et oppløselig Fhit proteinkompleks som inneholder Hsp10 /hsp60 og ferredoxin reduktase (Fdxr) er blant de mitokondrielle proteiner. I den studien, viste vi at Hsp10 /hsp60 komplekset ble involvert i translokasjon av Fhit protein i mitokondriene, hvor dets interaksjon med Fdxr var involvert i modulering av produksjon av reaktive oksygenforbindelser, den tidligste trinnet i Fhit-mediert apoptose. Denne tilnærmingen, med sikte på identifisering av protein komplekser, foreslo oppfølgingsstudier for å identifisere andre Fhit interactors og deres funksjonelle signalveier. I subcellulære fraksjone studiene ble Fhit protein påvist i alle cellekamre, men kjernen [26]. Således isoleres vi nye Fhit proteinkomplekser fra A549 protein lysater anriket i cellemembraner. Denne tilnærmingen produsert en liste over kandidat Fhit partnere, hvorav noen ble også identifisert i vår forrige analyse [26]. Blant disse nye kandidater, hadde Annexin A4- (ANXA4) blitt rapportert å spille en rolle i medikamentresistens, sammen med dets ekspresjon øket i kloner som er resistente mot paclitaxel [36], et medikament som vanligvis brukes ved behandling av kreftpasienter. Som vi viste i det siste at Fhit selv er involvert i å overvinne paclitaxel motstand [26], [27], bestemte vi oss for å utforske dette potensialet sammenhengen nærmere.
Samspillet mellom Fhit og respons på kjemoterapi har vært tidligere studert ved Andriani et al [41]. Spesielt Fhit uttrykk resulterte i redusert sensitivitet overfor etoposid, doksorubicin, og topotecan. Denne funksjonen ble forbundet med Fhit-indusert nedregulering av DNA-topoisomeraser I og II. I motsetning til dette produserte Fhit ekspresjon en svak økning i følsomhet overfor cisplatin, som vist ved kolonidannende assays [41].
Inaktivering av begge FHIT og TP53-gener blir ofte observert i primære ikke-småcellet lungekreft ( NSCLC) og cellelinjer og kan bidra til motstandsdyktighet mot apoptotiske stimuli fremkalt av forskjellige anti-tumor medikamenter [42]. I denne studien demonstrerte vi at paclitaxel administrering induserer både Annexin A4- opp-regulering og modifisering av dens intracellulære distribusjon; i virkeligheten, etter paclitaxel behandling, beveger annexin A4 fra cytosol til cellemembranen. Interessant, Fhit overekspresjon i Fhit-negative lungekreftceller hindrer annexin A4 trans fra cytosol til celle membran; Videre samtidig behandling av A549 kreftceller med Ad
FHIT Hotell og paclitaxel er mye mer effektive i utløser apoptose av kreftceller sammenlignet med kontroller; Lignende resultater ble oppnådd med administrering av paclitaxel til annexin-A4-utarmet A549-celler. Disse dataene tyder på at både annexin A4 overekspresjon og sin plasmamembran subcellulære lokalisering i paclitaxel-resistente kreftceller er ikke en tilskuer effekt, men heller spiller en aktiv rolle i mekanismene for resistens; ytterligere undersøkelser av funksjon annexin A4 i cellemembranen kan kaste lys over de komplekse mekanismene for resistens hos kreftpasienter. Disse
in vitro
funnet ytterligere støtte i en preklinisk modell av lungekreft; faktisk både
FHIT
genterapi og annexin A4 utarming handlet synergi med paclitaxel i indusere tumor regresjon i mus sammenlignet med kontroller; denne kombinasjonen kan være av interesse nyttig i behandlingen av lungekreftpasienter. I konklusjonen, understreker tidligere og nyere undersøkelser Fhit tap, en vanlig funksjon i kreft hos mennesker, som en markør for dårlig prognose hos kreftpasienter, noe som tyder på at Fhit-negative tumorer er utsatt for utvikling av resistens.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Mus ble vedlikeholdt og dyreforsøk utført under institusjonelle retningslinjer som er fastsatt for dyre~~POS=TRUNC ved Ohio State University. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i Ohio State University. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Ohio State University (IACUC protokollnummer: 2010A00000146; godkjenning dato 8/15/2011). Alle operasjoner ble utført under natrium-pentobarbital-anestesi, og alle forsøk ble gjennomført for å redusere smerte.
cellekultur og transfeksjon eksperimenter
A549-celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 i det aktuelle vekstmedium med kosttilskudd tilsatt som anbefalt. HEK-293-celler ble brukt for å generere og forsterkning av rekombinante adenovirus [18]. Transfections av Annexin 4 små interfererende RNA (Smart basseng, Dharmacon) ble utført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Immunoblotting og fraksjone analyse
Totalt proteiner ble ekstrahert med Nonidet P40 (NP-40 ) lysebuffer; cytosoliske og plasmamembrane proteinene ble hentet med FractionPREP cellefraksjone system (Biovision). Totalt lysatene med beriket plasma membran proteiner, som brukes for både masse spectometry og immunoutfellinger analyser, ble oppnådd ved hjelp av Mem-PER Eukaryote Membrane Protein Extraction Kit (Pierce).
For immunoblotting, proteiner (50 mikrogram) ble separert på polyakrylamid geler og overført til nitrocellulose filtermembraner. Membraner ble blokkert i 5% fettfri tørrmelk, inkuberes med primære anti-Annexin 4, GAPDH og E-cadherin antistoffer (Santa Cruz Biotechnology), oppdaget av de aktuelle sekundære antistoffer, og avslørt av forsterket kjemiluminescens (ECL, Amersham Inc .).
proteininteraksjon Analyse
Co-immunoutfellingsstudier eksperimenter, med eller uten dithiobis- [succinimidylpropionate] (DSP), en tverrbinder fra Pierce, ble utført ved å inkubere 1 mg totalt proteinlysatene (inneholdende anriket plasmamembranfraksjon) med enten NIN-TA agarose magnetisk nikkel-kuler (Qiagen) eller med anti-V5-antistoff konjugert til Sepharose-kuler, over natten ved 4 ° C; etter vask, ble perler kokt i 1 × SDS sample buffer og proteiner separert på 4-20% polyakrylamidgeler (Bio-Rad).
immunfluorescens
A549 celler, pre-infisert med Ad
FHIT
, ble fiksert i 4% PFA (paraformaldeyde) i 10 minutter, permeabilisert 4 min med 0,05% Triton og analysert ved konfokal mikroskopi. Endogen Annexin 4 ble påvist med et primært antistoff fra BD; sekundært antistoff (594 nm) var fra Molecular Probes.
In vitro vekst vurdering
A549 celler ble sådd på 1 × 10
5 celler per tallerken 60 mm diameter og mock smittet eller infisert med Ad
GFP
eller Ad
FHIT
MOI (mangfold av infeksjon) 50 og behandlet med 800 nM paclitaxel. Celler ble overvåket og telles på tjuefire timers mellomrom etter smitte. Paclitaxel (LC-Laboratories) ble oppløst i DMSO som en 1 mM stamløsning.
Generering av rekombinante adenovirale vektorer
adenovirus som bærer
FHIT
eller
FHIT-
His6 cDNA (Ad
FHIT Hotell og Ad
FHIT-
His6, henholdsvis) under transkripsjonen kontroll av en cytomegalovirus promoter ble generert ved homolog rekombinasjon i HEK-293 celler som tidligere beskrevet [26] . Annonse
GFP
vektor ble brukt som kontroll.
Protein Fordøyelse
immunopresipitert proteinkomplekser ble fordøyd med sekvense klasse trypsin fra Promega hjelp av Multi Solvinert filterplater fra Millipore (Bedford ).
