Abstract
identifisering av nye biomarkører for preneoplastiske bukspyttkjertelen lesjoner (PanINs, IPMNs) og tidlig bukspyttkjertel ductal adenokarsinom (PDAC) er avgjørende på grunn av sykdommer høy dødelighet ved sen gjenkjenning. For å løse denne oppgaven vi brukte romanen teknikken av matrix-assistert laser desorpsjon /ionisering (MALDI) bildebehandling massespektrometri (IMS) på genmanipulerte musemodeller (GEM) av kreft i bukspyttkjertelen. Various GEM ble analysert med MALDI IMS å undersøke peptid /protein-uttrykk mønster av forstadier i forhold til normal bukspyttkjertel og PDAC med mobilnettet oppløsning. Statistisk analyse avdekket flere diskriminerende
m /z
specier mellom normalt og sykt vev. Intraepitelial neoplasi (Panin) og intraductal papillær mucinous svulst (IPMN) kunne skilles fra normal bukspyttkjertelen vev og PDAC med 26 betydelig
m /z
specier. Blant disse
m /z
specier, identifiserte vi Albumin og Thymosin-beta 4 ved væskekromatografi og tandem massespektrometri (LC-MS /MS), noe som ble ytterligere bekreftet ved immunhistokjemi, western blot, kvantitativ RT- PCR og ELISA i både murine og humane vev. Thymosin-beta 4 ble funnet signifikant økt i sera fra mus med Panin lesjoner. Oppregulert Panin uttrykk for Albumin ble ledsaget av økt uttrykk av lever-begrenset gener som tyder på en levertransdifferensiering program av preneoplastiske celler. I konklusjonen viser vi at GEM av endogen PDAC er en passende modellsystem for MALDI-IMS og påfølgende LC-MS /MS-analyse, slik at
in situ
analyse av små forstadier og identifisering av forskjellig uttrykt peptider og proteiner.
Citation: Grüner BM, Hahne H, Mazur PK, Trajkovic-Arsic M, Maier S, Esposito jeg, et al. (2012) MALDI Imaging massespektrometri for
In Situ
proteomikk Analyse av preneoplastiske lesjoner i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 7 (6): e39424. doi: 10,1371 /journal.pone.0039424
Redaktør: Frank T. Kolligs, Universitetet i München, Tyskland
mottatt: 15 januar 2012; Godkjent: 20 mai 2012; Publisert: 26 juni 2012
Copyright: © 2012 Grüner et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den tyske Research Foundation (SFB824-C4), den tyske føderale Kunnskapsdepartementet (BMBF; # 01GS08115) og Association of Cancer Research (AICR; # 07-0543); alt til JTS. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er den fjerde største årsaken til kreftdød i den vestlige verden [1]. På grunn av den avansert stadium ved diagnose og den høye iboende resistens overfor terapi, forekomsten av PDAC korresponderer med dens dødelighet med en median overlevelsestid på mindre enn 6 måneder og en samlet fem-års-overlevelse under 5% [2]. Identifisering av proteiner uttrykt i preneoplastiske lesjoner kan bidra til å identifisere sykdommen i en preinvasive tilstand, en klinisk svært relevant mål som reseksjon er fortsatt den eneste kurative tilnærmingen ofte frustrert tidlig uoppdaget metastaser eller lokalavansert sykdom [2].
Klinisk og histopatologiske studier har identifisert tre PDAC forstadier: bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi (Panin), intraductal papillær mucinous svulst (IPMN) og mucinous cystisk svulst (MCN). Den desidert vanligste forløpere er Panin lesjoner, men på grunn av forbedret bildediagnostikk cystisk svulster som IPMNs og, i mindre grad, Nettverkene er i økende grad diagnostisert [3], [4]. Identifisering og klassifisering av PanINs som forløpere for PDAC [5] har muliggjort utvikling av en morfologisk og genetisk progresjon modell (oversikt i [3]). Disse fremskrittene har bidratt til utviklingen av avanserte
Cre /lox
-baserte genmanipulerte mus (GEM) for endogen PDAC [6]. En godt etablert musemodell recapitulating de molekylære og morfologiske stadier av menneskelig PDAC utvikling er
Kras
G12D
modellen, der onkogene
Kras
G12D
er aktivert i den endogene
Kras
locus. Mus utvikle lokalt invasive og metastatisk PDAC gjennom definerte Panin lesjoner utvikler seg fra PanIN1 til PanIN3 [7]. Tilleggs aktivering av EGFR-signalering fører til en akselerert utvikling av PDAC gjennom Panin og IPMN lesjoner, utvide spekteret av klinisk relevante PDAC musemodeller [8]. På grunn av den definerte genetisk bakgrunn og eksperimentelt adresser tidsforløpet av preneoplastiske lesjon utvikling og progresjon til PDAC, vi hypotese disse modellene til å være verdifulle studie verktøy for å etablere et preklinisk tidlig deteksjon biomarkør identifikasjon tilnærming.
Matrix-assistert laser desorpsjon /ionisering (MALDI) bildebehandling massespektrometri (IMS) har utviklet seg som en ny teknikk og lovende verktøy i biomarkører og translasjonell onkologi [9]. Eksempler inkluderer Parkinsons [10] og Alzheimers [11] sykdom, så vel som en rekke kreftformer, inkludert gliomer [12], [13], [14], [15], eggstokk [16], prostata [17], bryst [18] og tykktarmskreft [19]. Ved å gi en molekylær
ex vivo
utsikt over resected vev, etiketten frie sporing av endogene forbindelser med romlig oppløsning og molekylær spesifisitet er aktivert (oversikt i [9], [20]).
i denne studien, søkte vi MALDI-IMS for å undersøke gjennomførbarheten av denne teknikken for identifisering av potensielle biomarkører i nye Panins lesjoner. Vi kjennetegnes to Panin-spesifikke topper, som ble identifisert som ALB1 og TMSB4X. Vi bygge ytterligere ALB1 uttrykk som en del av en levertransdifferensiering program av forstadier og gi bevis for økte serumnivåer av TMSB4X i mus med Panin lesjoner.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
studiet ble godkjent av etikkomiteen av det medisinske fakultet ved det tekniske universitetet i München. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter før inkludering i studien.
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med tyske dyrevern lover og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved det tekniske universitetet i München .
musestammer
Kras
+ /LSL-G12D, Ptf1a
+ /Cre, Ela-TGFa Hotell og
Trp53
+ /LSL-R172H
stammer er blitt beskrevet tidligere [7], [8], [21], [22], [23]. Musene ble blandet seg for å få mus linjer
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D; Ela-TGFa; Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D Hotell og
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D; Ela-TGFa; Trp53
+ /LSL- R172H Hotell og ble backcrossed til C57BL /6J bakgrunn i minst fire generasjoner. C57BL /6J mus tjente som kontroll.
humane prøver
Serumprøver ble tatt fra 57 individer med en histologisk påvist diagnosen bukspyttkjertel ductal adenokarsinom (21 kvinner, 26 menn, median alder 67,1 år) . Fullblod ble samlet før operasjonen. Kontrollserumprøver ble tatt fra 10 friske forsøkspersoner (2 kvinner, 8 menn, median alder 66,2 år) og fra 12 pasienter med kronisk pankreatitt (3 kvinner, 9 menn, median alder 55,8 år).
MALDI-IMS på vevssnitt fra Mouse pankreata
For MALDI-IMS pankreata ble resected og snap-frosset i flytende nitrogen uten forbehandling. 10 um frysesnitt ble kuttet og overført til indium-tinn-oksyd (ITO) belagte glassplater forbehandlet med poly-lysin 1:01 i vann med 0,1% NP-40. Snittene ble fiksert i 70% etanol og 100% etanol i ett min. Matrise (10 g /l sinapinic syre i 60% acetonitril og 0,2% trifluoreddiksyre) ble jevnt avsatt på objektglasset ved hjelp av ImagePrep anordningen (Bruker Daltonics). Massespektra ble målt ved hjelp av MALDI TOF /TOF Analyzer Ultraflex III (Bruker Daltonics) med en romlig oppløsning på 70 mikrometer i lineær modus. Ioner ble oppdaget i en masse spekter av
m /z
2500-25000 med en samplingsfrekvens på 0,1 GS /s. En ferdiglaget proteinstandard (Bruker Daltonics) ble anvendt for kalibrering av spektre, som ble gjort utvendig på det samme målet før hver måling. Etter målingen objektglassene ble vasket i 70% etanol for å fjerne grunnmassen, og motfarget med hematoxylin /eosin (H E). Høyoppløselige bilder av fargete snitt ble tatt ved hjelp av Mirax Scan system (Carl Zeiss) og co-registrert med MALDI-IMS data å korrelere massespektra med histologiske trekk ved den samme delen.
Statistisk analyse av MALDI-IMS-data
MALDI-IMS data ble innhentet og analysert ved hjelp av Flexcontrol 3.0, FlexImaging 3.0 og ClinProTools 2.2-programvaren (bruker). Med FlexImaging programvare regioner av interesse (ROI) ble definert i henhold til morfologi (Panin, IPMN, PDAC, WT) og 40 tilfeldig valgt enkelt spektra per mus per ROI-gruppen ble eksportert til ClinProTools for videre analyse. Respektive lesjoner ble klassifisert av en ekspert bukspyttkjertelen patolog (DVS.). De ekstraherte massespektra ble rekalibrert på felles «Bakgrunn» topper (spektral justering) og normalisert på deres totale ion teller. I alle analysene ble spektra av to grupper av Rois forhold og
p
verdiene ble beregnet med den kombinerte Wilcoxon rank sum test for to ikke-parametrisk, ordinal, uavhengige utvalg og Benjamini-Hochberg korrigert.
P
verdier ≤0.05 ble betraktet som signifikant.
For validering av diskriminerende topper betydningen Analyse av mikromatriser (SAM) Testen ble utført og funksjoner med en falsk funnrate mindre enn 0.001 ble betraktet som signifikant. Den optimale diskriminerende terskel ble fastsatt ved hjelp Receiver Driftsegenskaper (ROC) analyse. Valideringen ble utført med et uavhengig sett med prøver (Fisher eksakte t-test,
p
0,001).
Peptide og Protein Identifikasjon av væskekromatografi og Tandem massespektrometri (LC-MS /MS)
peptider og proteiner ble hentet direkte fra sinapinic syre forberedt vevssnitt. For ekstraksjon ble 1 pl av 30% acetonitril i 0,1% trifluoreddiksyre påført skive, fjernet og enten blandet med et likt volum av α-cyano-4-hydroxy-kanelsyre-oppløsning (10 mg /ml i 30% acetonitril , 0,1% trifluoreddiksyre) på en rustfritt stål MALDI mål for første MALDI MS måling eller fortynnet til 10 mL av 0,1% maursyre for påfølgende LC-MS /MS-målinger.
for å få nøyaktig
m /z
verdier for
m /z
arter av interesse, ble matrix utdrag fra tilstøtende deler av mus pankreata med høy intensitet av de respektive m /z arter analysert av positive ion reflektor modus MALDI MS. Målingene ble utført på en ultrafleXtreme MALDI-TOF /TOF massespektrometer utstyrt med en 1 kHz SmartBeam-II-laser (Bruker Daltonics). Hvert spektrum ble eksternt kalibrert ved hjelp av Peptide kalibreringsstandard II (Bruker Daltonics) og «kubisk utvidet» kalibreringsfunksjon, typisk ettergivende masse nøyaktighet. 20 ppm
LC-MS /MS-analyse av matriks-ekstraktene ble utført på en LTQ Orbitrap massespektrometer (Thermo Fisher Scientific) koblet til en nano-HPLC (nanoLC Ultra, Eksigent Technologies). Peptider ble separert på en selvstendig pakket 75 um x 40 cm reversfasekolonne (Reprosil, Dr. Maisch) ved hjelp av en 25 min lineær gradient (2-35% acetonitril i 0,1% maursyre, strømningshastighet 300 nl /min). Intakte masser av eluerte peptider ble bestemt på 30.000 oppløsning og de tre mest intense toppene ble valgt for ytterligere fragmentering av kollisjon indusert dissosiasjon (CID) og kjøp av fragment spektra med lav oppløsning (1000). Enkeltvis ladede ioner samt ioner med ukjent ladetilstand ble avvist. Dynamisk eksklusjon ble aktivert og dynamisk eksklusjon varighet ble satt til 10 sekunder. Peaklist filene ble generert ved hjelp Mascot Distiller versjon 2.2.1.0 (Matrix Science) og søk i databaser ble utført ved hjelp av Mascot søkemotor versjon 2.2.04 (Matrix Science) mot IPI mus database (versjon 3.26). Søkeresultat filene ble importert til Stillas (Proteome Software).
immunfluorescens og Immunohistochemistry
immunfluorescens eller immunhistokjemi ble utført i henhold til standard protokoller. Følgende antistoffer ble brukt: ALB1 (Santa Cruz Biotechnology, og Thermo Fisher Scientific), HepPar1 (DAKO), TMSB4X [24], [25] (Immundiagnostics, Bens) og CK19 (TROMA-III, utviklingsstudier hybrid Bank)
Kvantitativ RT-PCR
real-Time PCR ble utført som previsouly beskrevet [8]. Cyklofilin ble anvendt for normalisering.
P
verdiene ble beregnet med Wilcoxon test. Følgende primere ble brukt:
Cyclophillin-F /-R ATGGTCAACCCCACCGTGT /TTCTGCTGTCTTTGGAACTTTGTC
Tmsb4x-F /-R CCTCTGCCTTCAAAAGAAACA /GGGCAGCACAGTCATTTAAAC
Alb1-F /-R TTGGTCTCATCTGTCCGTCA /GGCAGCACTCCTTGTTGACT
Transferrin-F /-R ATCAAGGCCATTTCTGCAAGT /GGTTCAGCTGGAAGTCTGTTCC
alfaføtoprotein-F /-R GGAGGCTATGCATCACCAGT /CATGGTCTGTAGGGCTTTGC
Apolipoprotein A4-F /-R AGAGCCTGAGGGAGAAGGTC /AGGTGTCTGCTGCTGTGATG
ELISA -Enzyme tilknyttede immunosorbent analysen
ELISA kit for kvantitativ måling av TMSB4X konsentrasjoner i serum ble hentet fra Immundiagnostics (Bensheim). ELISA ble utført i henhold til produsentens protokoll.
Western Blot
Western Blot analyse ble utført i henhold til standard protokoller med antistoffer mot ALB1 (Santa Cruz Biotechnology) og HSP90 (Cell Signaling).
Resultater
MALDI-IMS i preneoplastiske lesjoner og PDAC av GEM modeller
for å identifisere nye biomarkører for de to vanligste preneoplastiske bukspyttkjertelen lesjoner, Panin og IPMN, resected vi pankreata fra etablert PERLE av PDAC: 13
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
, 8
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D; Ela-TGFa Hotell og 5
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D; Ela-TGFa; Trp53
+ /LSL-R172H
mus av blandet alder (3-18 måneder, avhengig av genotypen). Disse musene utvikler Panin og IPMN lesjoner utvikler seg til invasiv og metastatisk PDAC med forskjellige angrep og aggressivitet [7], [8], [23]. Fire C57BL /6J mus fungerte som villtype kontroll. Alle pankreata ble målt i en Ultraflex III MALDI TOF /TOF analysatoren med en romlig oppløsning på 70 um. MALDI-IMS arbeidsflyt er vist i figur 1A. For å teste nøyaktigheten av metoden vi først gjen visualisert de allerede kjente molekylionet av insulin [M + H
+] ved 5808 på pankreata av villtype-mus. Den insulin-signalet, som er gitt som et varme kart illustrasjon (hvor blå betyr laveste og rød høyest relativ intensitet), pent co-lokalisert med de Langerhanske øyer (figur 1B), som viser den korrekte korrelasjonen av målte
m /z
specier til morfologiske funksjoner med MALDI-IMS.
(A) oversikt over MALDI-IMS arbeidsflyt. (B) Re-visualisering av det molekylære ion av insulin [M + H
+] ved 5808 (red bar) i gjennomsnittsspektrumet av en pankreatisk seksjon fra en C57BL /6 mus målt i MALDI-IMS. Intensiteten av det målte signal er fargekodet, hvor rød farge betyr høyest intensitet på angående posisjonen på delen. Toppen av insulin co-lokaliserer med bukspyttkjertelen holmer (forstørret i utdrag). (C) Definisjon av ROIs på H E farget seksjoner etter MALDI-IMS måling. Øvre panel: H E farget deler av en
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D product: (
CK
) og en
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D; TGFa product: (
CKT
) mus. Svarte linjer sirkel eksokrin vev, grønne linjer PanIN1, gule linjer PanIN2, oransje linjer PanIN3, blå linjer IPMN og røde linjer PDAC diagnostisert regioner i de respektive avsnitt. Scale bar representerer 1 cm. Nedre panel: eksempler på de ulike morfologiske Rois som angitt nedenfor. Skala barer representerer 50 mikrometer.
Å sammenligne spektra av ulike morfologiske områder, områder av interesse (ROI) for Panin, IPMN, PDAC, og normal eksokrine vev ble definert av en ekspert i bukspyttkjertelen patologi på den pankreata ved hjelp av FlexImaging programvare og ble anvendt for sammenligning av spektrene av de respektive områder fra den samme delen, så vel som fra andre deler til hverandre. Figur 1C gir eksempler på definisjonen av regionene på målte seksjoner (figur 1C øvre panel) og forskjellige morfologiske egenskaper (figur 1C, lavere panel). Singelen spektra av disse Rois ble eksportert til ClinProTools analyse programvare. Som et første kontroll eksperiment vi sammenlignet spektra av normal bukspyttkjertelen vev (acini og kanaler) fra villtype (WT) mus med fenotypisk normal vises acinar og duktalt vev fra
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
mus skjuler den onkogene
Kras
G12D
mutasjon. Ingen forskjeller i spektrene mellom disse to gruppene var detekterbare derfor å sikre at det ikke er noen påviselige variasjoner i spektrene til WT og GEM (tabell 1). For ytterligere analyse, ble fenotypisk normal ROIs fra begge genotyper klassifisert som «normal»
Vi neste analysert spektra fra normalt vev av C57Bl /6J og
Ptf1a
+ /Cre;. Kras
+ /G12D
mus (n = 11) mot spektra fra preneoplastiske lesjoner av
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D Hotell og
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D; Ela-TGFa
mus (PanINs og IPMNs, n = 24). Disse to gruppene kan være preget av 76 statistisk signifikante topper (Wilcoxon rank sum test,
p
verdier Benjamini-Hochberg korrigert), hvorav 26 var lesjon spesifikke (dvs. spesifikke for IPMNs og PanINs) og 50 normal- spesifikke med
p
verdier mellom 0.000001 og 0,05. For PanINs fant vi 25 (
p
= 0,000001 til
p
= 0,05) og for IPMNs 18 (
p
= 0,03 til
p
= 0,05 ) bestemt
m /z
specier henholdsvis, som kan diskriminere dem fra normalt vev. Også IPMNs og PanINs kan bli diskriminert fra hverandre med 6 Panin-spesifikke topper (
p
= 0,02 til
p
= 0,05, n = 19 vs. 13 mus). Når man sammenligner de preneoplastiske lesjoner med PDAC (n = 24 vs. 10 mus) vi har oppdaget 57 lesjon spesifikke og 11 PDAC-spesifikke masser (
p
= 0,00169 til
p
= 0,038). Tabell 1 gir en oversikt over alle forhold grupper, antall diskriminerende
m /z
specier, tilsvarende
p
verdier og antall dyr som brukes. Supplerende Tabell S1 gi detaljert informasjon om alt vesentlig identifisert
m /z
specier av de viktigste sammenligninger.
m /z
specier 2790, 2812 og 2829 er spesielt funnet i Panin lesjoner
En nærmere undersøkelse av Panin-spesifikke topper viste at
m /z
specier 2790, 2812 og 2829 ble skjønns PanINs fra normalt vev (Figur 2A). Den overlegg av gjennomsnittlig spektra fra PanINs og normal bukspyttkjertelen vev avdekket at i sistnevnte toppene var nesten ikke oppdages (figur 2A). Videre statistisk undersøkelse av disse toppene (Wilcoxon test, Bonferronikorreksjon) avslørt
p
verdier under 0,00001. Fordelingen Box Plot og Principle Component Analysis (PCA) av PanINs og eksokrine vevet avbildet klar forskjellsbehandling mellom de to gruppene (figur 2B + C).
(A) Overlegg av et utdrag av den gjennomsnittlige spektra fra ROI -gruppen «Panin» (blå) og ROI-gruppen «WT» (rosa). Spredningen av enkelt Spectra intensiteter er angitt i barer; a.u. (vilkårlige enheter). (B) Dot Plot av intensiteten-fordeling av
m /z
specier 2829 i PanINs (blå) og WT (rosa) for hver enkelt spektrum. (C) PCA-basert differensiering av eksokrin (rosa) og Panins (blå) celler. (D) Re-visualisering av betydelige topper.
m /z
specier 2829 tydelig re-visualiserer på Panin lesjoner (øvre panel, forstørret i utdrag), mens topp på 6645 er spesifikk for eksokrin rommet i bukspyttkjertelen (nedre panel, forstørret på høyre side). Nedenfor er gjennomsnittlig spekteret av den målte delen.
neste visualisert
m /z
2829 på vevet seksjoner som viser spesifisitet av denne toppen for Panin regioner i varmen kartet illustrasjon ( Figur 2D, øvre panel), mens en topp på
m /z
6645, som var unik for normalt vev spesifikt re-visualisert i regioner med morfologisk normal bukspyttkjertelen vev (figur 2D, nedre panel).
Validering av vesentlige Diskriminerende Peaks i en uavhengig prøvesett
for å validere betydningen av
m /z
arter 2790 og 2829 i en uavhengig prøvesett, vi utførte mottaker Driftsegenskaper (ROC ) analyse med disse toppene for å bestemme de optimale kresne terskler. Med disse tersklene var det mulig å skille vev fra 10 uavhengige mus pankreata (4
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D Hotell og 6 villtype kullsøsken i en alder av 6 måneder) en nøyaktighet på 100% (Fisher test,
p
0,001).
protein Identifikasjon av de tre mest Betydelig Arter av LC-MS /MS
for protein identifikasjon av diskriminerende Panin spesifikke betydelig
m /z
arter, peptider var direkte hentet fra MALDI-IMS lysbilder og først analysert av reflektor modus MALDI MS for å få nøyaktige masser ( 20 ppm) for de MALDI IMS arter før LC-MS /MS-analyser. Sekvens database søk på LC-MS /MS-resultatene med Mascot søkemotor tillatt identifisering av tre svært viktige
m /z
arter som peker til to forskjellige proteiner.
m /z
2790 arter ble identifisert som et peptid som representerer amino-terminalen av den modne form av serum albumin (ALB1), mens begge,
m /z
2812 og
m /z
2829 arter representert to forskjellige peptider som hører til den karboksy-terminale ende av Thymosin beta-4 (TMSB4X). Identifiseringen av TMSB4X ble ytterligere understøttet ved identifikasjon av ytterligere fire forskjellige peptider av proteinets karboksy-terminale region. De manuelt verifiserte peptid identifikasjoner av ALB1 og TMSB4X og tilsvarende MS /MS spektra er oppført i tabell 2 og tilgjengelig i Supplemental Material (figur S1).
nærmere undersøkelse og validering av identifiserte Kandidater
For å undersøke om ALB1 og TMSB4X er også til stede på transkripsjonsnivået i tumorigent pankreata, isolert vi samlet bukspyttkjertelen RNA fra 8
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D Hotell og 6 villtype kullsøsken på blandet alder mellom 4,5 og 9 måneder og utført kvantitativ RT-PCR-analyse for disse to kandidatene. Uttrykket av både transkripsjoner var signifikant oppregulert i
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
i forhold til villtype mus (
p
≤0.05, 3B og . 4A)
(A) Immunhistokjemisk analyse av ALB1 viser spesifikk farging av Panin lesjoner av
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D product: (
CK
) mus, men ikke ductal-celler (n = 10 mus). Immunfluorescens farging for ALB1 og duktalt markør CK19 demonstrerer ko-lokalisering av de to proteinene. Alle skala barer representerer 50 mikrometer. (B) mRNA av
Alb1 Hotell og av lever gener
alfaføtoprotein (Afp)
,
Apolipoprotein A4 (ApoA4) Hotell og
Transferrin (TFN)
er alle signifikant oppregulert i pankreata fra
CK
mus sammenlignet med villtype kontroll (
p
= 0,04 for
Alb1
,
p
= 0,008 for
Afp
,
p
= 0,04 for
ApoA4
,
p
= 0,004 for
TFN
, n = 7 vs. 5 mus). Expression nivåene er normalisert til prøver av villtype mus. Alle feilstolper indikerer standardavvik normalisert til gjennomsnittet av villtype. (C) Western Blot for ALB1 på hele pankreas lysatene fra villtype og
CK
mus (n = 3). ALB1 uttrykk i preneoplastiske vev er robust økt sammenlignet med normal bukspyttkjertelen. (D) Immunhistokjemisk analyse av lever markør HepPar1 i et menneske PanIN3 lesjon
(A) TMSB4X mRNA er betydelig økt i
Ptf1a
+ /Cre;. Kras
+ /G12D (CK)
mus sammenlignet med villtype kontroll (
p
= 0,01, n = 8 mot 6 mus). Expression nivåer er normalisert til villtype. Feil linjer indikerer standardavvik normalisert til gjennomsnittet av villtype. (B) Farging for TMSB4X på vevsprøver 10-30 uker gammel
CK
mus (n = 10), viser uttrykk i PanINs (pilspiss), men ikke i acinar (stjerne) celler (i). Høyverdig mPanIN3 uttrykke TMSB4X (ii). Ekspresjon i human PanIN3 (iii) og human PDAC (iv) er også synlig. Skala barer representerer 50 mikrometer. (C) ELISA for TMSB4X fra serumprøver av villtype og
CK
mus (n = 7 vs. 14 mus). Serumkonsentrasjonen av TMSB4X er betydelig oppregulert i
CK
mus (
p
= 0,043, Wilcoxon test). (D) ELISA for TMSB4X fra serumprøver av PDAC og CP pasienter samt friske donorer. Medianer er markert med røde linjer.
For å validere riktig ALB1 identifikasjon immunhistokjemi flekker og Western Blot analyse for ALB1 ble utført. ALB1 uttrykk på seksjoner fra
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
mus ble observert i Panin lesjoner, men ikke i normal bukspyttkjertelen kanaler og akinærceller (n = 10). Også immunfluorescens analyse for ALB1 og duktalt markør CK19 på frysesnitt fra
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D Hotell og
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D; Ela-TGFa
mus viste ko-lokalisering av de to proteiner i Panins lesjoner (figur 3A). Viktigere,
m /z
arter 2790 ikke re-visualisere på små og store fartøy av MALDI-IMS målte seksjoner (Figur S2). Også Western Blot analyse av hele bukspyttkjertelen lysatene avslørte økt ALB1 protein uttrykk i
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D Hotell og
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
mus i forhold til villtype-kontroller (figur 3C).
Det ble tidligere rapportert at bukspyttkjertelen eksokrine celler kan transdifferentiate til hepatocytter og at lever foci kan bli funnet i voksen bukspyttkjertelen og i PDAC [26], [27], [28], [29]. Derfor ble vi fascinert å vite om den svært økte ALB1 signal identifisert av MALDI-IMS kan skyldes en levertransdifferensiering prosess med
Kras
G12D
-aktiverte bukspyttkjertelen celler. For å teste denne hypotesen vi isolert RNA fra hele pankreata av
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D Hotell og villtype mus mellom 4,5 og 9 måneder og utført kvantitativ RT-PCR for leveren spesifikke markører
Transferrin plakater (TFN),
Alfa-fetoprotein plakater (Afp) og
Apolipoprotein A4 plakater (ApoA4). Uttrykket nivået på disse markørene ble betydelig økt i
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
sammenlignet med villtype mus som indikerer en mulig transdifferensiering prosess som skjer i PanINs (
p
≤0.05, figur 3B). I tillegg utførte vi immunhistokjemisk analyse for leverspesifikke markør HepPar1 på 14 PanIN1, 4 PanIN2 og 4 PanIN3 lesjoner. To PanIN3 lesjoner ble positivt farget for HepPar1 (figur 3D), som indikerer levercellefunksjoner i høy grad PanINs.
Når det gjelder det andre identifiserte protein, vi validert TMSB4X uttrykk i murine og humane Panin lesjoner og PDAC men ikke i acinar, ductal og øyceller (fig. 4B). For kvantifisering vi farget seksjoner fra 10
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
mus med PanINs og fant dem alle til å være positivt for TMSB4X. Av notatet uttrykk var høy allerede i lav grad PanINs og bodde i maligne lesjoner, støtter resultatene av vår MALID-IMS basert tilnærming for identifikasjon av preneoplastiske lesjon markører som er fortsatt til stede i PDAC. Siden TMSB4X er et lite molekyl og har blitt oppdaget i kroppsvæsker som tidligere, vi neste undersøkt om det kan påvises ved ELISA i serumprøver av mus med Panin lesjoner. Interessant, fant vi signifikant oppregulert i blodet i
Ptf1a
+ /Cre; Kras
+ /G12D
i forhold til å kontrollere WT mus, støtter rektor verdien av present markør deteksjon strategi (fig 4C. ). Men når vi utført en analyse ved hjelp av et sett av humane prøver fra donorer og pasienter med kronisk pankreatitt og PDAC, ingen signifikant forskjell var bemerkelsesverdig mellom disse gruppene (fig. 4D).
Diskusjoner
på grunn av den pågående svikt i terapeutiske tilnærminger for å forbedre overlevelse i PDAC pasienter, er tidlig påvisning av sentral betydning for bedre resultat i denne ellers dødelig sykdom. I denne studien har vi brukt MALDI Imaging massespektrometri (MALDI-IMS) med romlig oppløsning for
in situ
proteomikk analyse av preneoplastiske lesjoner i bukspyttkjertelen i GEM med endogen PDAC. Vi spesielt adressert spørsmålet om det er mulig å identifisere proteiner eller peptider som kan diskriminere mellom morfologisk normale bukspyttkjertelen vev, Panin /IPMN forstadier og PDAC.
Mens behovet for tidlig deteksjon av PDAC, helst i en preinvasive staten, er av åpenbar betydning, er proteomikk analyse hos mennesker hindret av iboende inter og intratumorale genetiske variasjoner samt konfunderende faktorer, inkludert miljø- og næringsforhold. I tillegg skaffe bukspyttkjertelen vev med preneoplastiske Panin eller IPMN lesjoner er ikke mulig for åpenbare grunner. Således GEM rekapitulere human pankreatisk karsinogenese gir en utmerket studium plattform og har vært anvendt for påvisning av serum ved hjelp av biomarkører SELDI-TOF-analyse [7]. I en annen studie,
Pdx1-Cre; Kras
+ /G12D; Ink4a /Arf
Lox /lox
mus ble brukt for plasma proteomikk analyse og kandidater ble validert i blodet hos pasienter med PDAC [ ,,,0],30]. En fersk studie fra Taguchi og kolleger sammenlignet plasmaproteinprofiler av fire musemodeller av lungekreft med profiler av modeller av bukspyttkjertelen, eggstokkene, tykktarm, prostata og brystkreft og to modeller av betennelse. De viste relevans for human lungekreft av proteinsignaturene som er identifisert på grunnlag av musemodeller [31]. Vi har derfor en hypotese disse GEM å være en egnet plattform for biomarkør identifisering ved hjelp av MALDI-IMS.
MALDI-IMS er en rask utvikling tilnærming for molekylær vev analyse med høyt potensial for klinisk relevante spørsmål, inkludert identifisering av biomarkører, tumor klassifisering , terapi respons overvåking og narkotika bildebehandling [14], [16], [32], [33], [34], [35], [36].
