Abstract
APC tumor suppressor genet er ofte mutert i menneskelig tykktarmskreft, med nonsense mutasjoner står for 30% av alle mutasjoner i dette genet. Gjeninnføring av WT APC genet til kreftceller generelt reduserer tumorigenicity eller induserer apoptose. I denne studien utforsket vi muligheten for å bruke medisiner for å indusere tidlig avslutning kodon (PTC) gjennomlesning (aminoglykosider, negamycin), som et middel til å reaktivere endogen APC. Ved å kvantifisere gjennomlesning av 11 nonsense mutasjoner i APC, var vi i stand til å identifisere dem som gir de høyeste nivåene av gjennomlesning etter behandling. For disse mutasjonene, demonstrerte vi at aminoglykosid eller negamycin behandling førte til en gjenvinning av den biologiske aktivitet av APC i kreftcellelinjer, og viste at nivået av APC-aktivitet var proporsjonalt med nivået av indusert gjennomlesning. Disse funnene viser at behandling med gjennomlesning induse bør betraktes som en potensiell strategi for behandling av kreft forårsaket av nonsens mutasjoner APC-genet. De gir også en rasjonell grunnlag for å identifisere mutasjoner responsive til gjennomlesning indusere
Citation. Floquet C, Rousset JP, Bidou L (2011) gjennomlesning ved førtidig innfrielse kodoner i adenomatøs polypose coli Gene Stiller sin biologiske aktivitet i Human kreftceller. PLoS ONE 6 (8): e24125. doi: 10,1371 /journal.pone.0024125
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 02.02.2011; Godkjent: 04.08.2011; Publisert: 31 august 2011
Copyright: © 2011 Floquet et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC No. 5016 til JPR) og Association Française contre les Myopatier (kontrakt 13986). CF ble finansiert delvis av det franske Kunnskapsdepartementet og delvis av et fellesskap fra Ligue Nationale Contre le Cancer. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
APC (adenomatøs polypose coli) tumor suppressor genet koder for et 311 kDa multidomain protein med bindingssteder for mange samarbeidspartnere, inkludert mikrotubuli, Axin og beta-catenin [1]. Dette proteinet virker som en negativ regulator av Wnt reaksjonsveien som er innblandet i den transaktivering av målgener som oncogenet c-myc og cyklin D1-genet [2]. APC genet er mutert i 80% av tykktarm kreft og mutasjoner oppstå tidlig i utviklingen av de fleste polyploide kolorektal kreft. Det har vist seg at gjeninnføring av villtype APC-genet i cancerceller reduserer generelt tumorgenisitet eller induserer apoptose [3], [4]. Totalt 30% av alle mutasjoner i dette genet er nonsense mutasjoner [5].
I de siste årene har visse antibiotika vist seg å forstyrre pattedyr ribosom, indusere gjennomlesning av premature stoppkodoner (PTCs ). Aminoglykosider er de antibiotika som oftest studert i denne forbindelse, og flere studier har antydet at disse stoffene kan brukes i nye strategier for behandling av genetiske sykdommer forårsaket av nonsens mutasjoner (for oversikt [6], [7], [8]) . Dipeptidet antibiotikum negamycin ikke er strukturelt beslektet med aminoglykosider [9] og har blitt funnet å være mer effektive enn gentamicin for å fremme gjennomlesning av noen nonsense-mutasjon [10]. Dette stoffet kan dermed utgjøre et attraktivt alternativ behandling for pasienter som bærer en tull mutasjon.
I en fersk undersøkelse, viste vi at selv en beskjeden aminoglykosid-indusert gjennomlesning nivå (6%) utløst apoptose av kreftceller huse en tull -mutated p53-genet [11]. Disse resultatene gitt proof-of-concept som gjennomlesning induktorer kan anvendes ved behandling av kreft forbundet med tilstedeværelsen av en nonsense-mutasjon i et tumorsuppressorgen. I denne studien undersøker vi muligheten for å utvide denne tilnærmingen til kreft knyttet til en tull mutasjon i APC genet. Nylig, Zilberberg et al viste at gjennomlesning induktorer forbedrede kliniske symptomer på tumorgenese i en musemodell som bærer en nonsense-mutasjon i APC-genet. Men koblingen mellom den nedre delen av svulst utvikling og PTC gjennomlesning ble ikke etablert [12]. Det blir stadig tydeligere at bare en undergruppe av nonsense mutasjoner ville ha nytte av gentamicin behandling, avhengig av deres nucleotide sammenheng [13], [14], [15], [16].
Vi har evaluert gjennomlesning effektivitet for 11 nonsense mutasjoner involvert i tykktarmskreft, med sikte på å identifisere de nonsense mutasjoner i APC genet mest mottakelig for gjennomlesning fremkallende behandlinger. For mutasjonene med de høyeste gjennomlesning nivåer, inkludert en endogen mutasjon, antibiotikabehandling resulterte i gjenvinning av den biologiske aktiviteten av APC.
Diskusjon
Identifikasjon av APC nonsense mutasjoner responsive til Aminoglykosid behandling
Resultater og
Vi studerte 11 nonsense mutasjoner er funnet i 23% av kreftceller som bærer en tull mutasjon i APC genet (T. Soussi, personlig kommunikasjon). Gjennomlesning effektivitet har vist seg å være avhengig av arten av de sekvensene som omgir stoppkodonet [13], [17], [18], [19]. Således, for hver mutasjon, innsatt vi en region som omfatter de omkringliggende sammenheng (27 nukleotider) i den doble reporteren vektoren pAC99 (tabell 1). Gjennomlesning ble kvantifisert i NIH3T3-celler forbigående transfektert med den doble reporteren vektor, i nærvær eller fravær av gentamicin (figur 1). Gjennomlesning prisene varierte fra 0,01% (Q1131X) til 0,2% (L360X) for basal gjennomlesning, og fra 0,09% (APC Q789X) til 1,6% (L360X) i nærvær av 800 pg /ml gentamicin. Lignende variasjoner i basalgjennomlesning nivåer og mottagelighet for aminoglykosider har blitt rapportert i flere tidligere undersøkelser [13], [18]. Vi har også undersøkt et annet antibiotikum, amikacin, som ga gjennomlesning nivåer tilsvarende eller lavere enn de som ble oppnådd med gentamicin (data ikke vist). Dette resultatet er i samsvar med en tidligere undersøkelse av Howard et al, som har sammenliknet gjennomlesning aktivitet av flere aminoglykosider [20].
gjennomlesning virkningsgrader for 11 nonsens mutasjoner i APC-genet ble vurdert i NIH3T3-celler med og uten gentamicin ( 800 ug /ml) behandling i 24 timer. To nonsense mutasjoner (L360X og R1114X) vises nivåer av gentamicin-indusert gjennomlesning av mer enn 0,5%. Betyr verdier er presentert, sammen med standardfeilen for gjennomsnittet (SEM) (n = 5).
Vi har vurdert om gjennomlesning nivåene var like i celler i tykktarmen opprinnelse, ved også å evaluere den gjennomlesning ledet av hver nonsense-mutasjon i kreft kolorektal DLD-1 cellelinje. Resultatene var lik de for NIH3T3 celler (data ikke vist).
For ytterligere karakterisering, vi fokusert på L360X og R1114X nonsense mutasjoner, som viste de høyeste nivåene av gjennomlesing i nærvær av aminoglykosid gentamicin (1,6% og 0,7% henholdsvis). For de to valgte nonsense-mutasjoner, vi kvantifisert gjennomlesning nivåene erholdt i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av G418 (geneticin), fordi dette antibiotikum er den mest potente gjennomlesning inducer av aminoglykosider [11], [21], [22]. Begge nonsense-mutasjoner viste en doseavhengig respons på G418, noe som resulterer i gjennomlesning nivåer høyere enn de som ble observert for gentamicin, og nådde 2,3% for L360X og 1,8% for R1114X (figur 2 A og 2B henholdsvis). De gjennomlesning nivåer som oppnås i nærvær av dipeptidet negamycin var lavere enn (L360X) eller lignende (R1114X) til de som ble oppnådd med gentamicin (figur 2 henholdsvis A og 2B).
(A) gjennomlesning effektivitet for APC L360X nonsense-mutasjoner ble bestemt i DLD-1-celler i nærvær av G418 (10, 25, 50, 100 og 200 ug /ml), negamycin (1 mg /ml), amikacin (2 mg /ml) eller gentamicin (800 ug /ml). (B) gjennomlesning effektivitet for APC R1114X nonsense-mutasjoner ble bestemt i NIH3T3-celler i nærvær av G418 (50, 100 og 200 ug /ml) eller negamycin (1 mg /ml). De gjennomlesning effektivitet i DLD-1-celler var i samsvar med de i NIH3T3-celler (data ikke vist). (C) Aminoglykosid behandling gjenopprettet APC-aktivitet. APC binding til beta-catenin (reppression av pTOPGlow rapportør) gjenopprettes ved behandling av DLD-1-celler forbigående transfektert med cDNA APC L360X med G418 (10, 25, 50, 100 og 200 ug /ml), negamycin (1 mg /ml), amikacin (2 mg /ml) eller gentamicin (800 ug /ml). (D) APC binding til beta-catenin (undertrykkelse av pTOPGlow reporter) gjenopprettes ved behandling av LoVo-celler som bærer APC R1114X med G418 (50, 100 og 200 ug /ml) eller negamycin (1 mg /ml). Som en kontroll, ble LoVo-celler kotransfektert med den pTOPGlow reporter plasmid og enten APC-målretting siRNA (siRNA APC) eller et ikke-målsøkende siRNA (siRNA NT) og behandlet med G418 (200 ug /ml). (E) Virkningen av siRNA rettet mot APC mRNA. Vi transient transfektert LoVo celler med en siRNA målretting (siRNA APC) eller ikke målretting (siRNA NT) APC mRNA. Kvantitativ PCR ble anvendt for å bestemme mRNA-nivåer. Resultatene er uttrykt i forhold til mengden av mRNA i nærvær av siRNA NT. Middelverdier blir presentert sammen med SEM (n = 3).
gjennomlesning nivå avhenger av arten av stoppkodonet og den omgivende nukleotid sammenheng, men de reglene som styrer gjennomlesning nivå er komplekse og forbli som skal bestemmes for pattedyrceller. Tilstedeværelsen av en C-rest umiddelbart etter stoppkodonet (4) er korrelert med en høy grad av gjennomlesning, selv om dette ikke synes å være den eneste determinant av gjennomlesning nivå. Flere studier har også vist at bare noen få nonsens mutasjoner gi «betydelig» gjennomlesning i nærvær av gentamicin. I denne studien ble bare to av de elleve nonsense-mutasjoner som ble testet, L360X og R1114X, vist gentamicin-indusert gjennomlesning nivåer høyere enn 0,5%, men bare L360X hadde en C-rest i posisjon fire. Den R1114X mutasjonen ville derfor ha blitt forkastet dersom dette hadde vært det eneste kriteriet som brukes til å identifisere mutasjoner responderer bra på gjennomlesning indusere. Vår tilnærming gir dermed en rasjonell strategi for å identifisere pasienter sannsynlig har nytte av behandling med gjennomlesning indusere.
Recovery av APC biologisk aktivitet fra APC L360X cDNA etter aminoglykosid behandling
Vi deretter undersøkt om aminoglykosid behandling induserte påvisbare nivåer av biologisk aktivitet for en APC-protein som produseres fra et cDNA bærer L360X mutasjonen. Aktiv APC medierer lagring av beta-catenin i cytoplasma, og dermed hindre interaksjonen av dette molekylet med den trans faktor TCF som kreves for ekspresjon av målgener. APC proteinaktivitet ble evaluert ved bestemmelse av evnen av dette protein å binde p-catenin, ved hjelp av en reporter konstruksjon inneholdende TCF /p-catenin bindingsseter innført oppstrøms fra ildflue luciferase-genet (pTopGlow) [23]. I dette system reporter, samspillet mellom aktive APC og p-catenin resulterer i hemming av ildflueluciferase uttrykk.
DLD-1-celler fri for funksjonelle APC protein (APC del 1 bp 1406) ble transfektert med pCMV ekspresjonsvektor inneholdende enten WT eller L360X mutant APC cDNA, sammen med pTopGlow (figur 2C). Transfeksjon med WT APC vektoren resulterte i nivåene av ekspresjon ildflue en tiendedel de som ble oppnådd etter transfeksjon med en tom vektor. Uten behandling L360X vises restaktivitetsnivå, sannsynligvis på grunn av ufullstendig tap-av-funksjon av dette allelet, som gjenværende aktivitet har også blitt demonstrert for mutasjoner i nærliggende posisjoner [23]. Den høyeste dosen av G418 ble redusert luciferase-aktivitet ved en faktor på 2,5, noe som viser fremstillingen av en funksjonell APC protein på aminoglykosider behandling. G418 trykt luciferase-aktivitet på en doseavhengig måte korrelert med de gjennomlesning nivåene målt i DLD-1-celler (figur 2A). Behandlingen med aminoglykosider gentamicin eller amikacin, eller med negamycin også utløst undertrykkelse av luciferase-aktivitet, noe som indikerer syntesen av en aktiv APC-protein (figur 2C). For hver behandling ble det proteinaktivitet korrelert med graden av gjennomlesning nivå målt i den doble reporter system (figur 2A og 2C). Vi brukte Spearmans nonparametric korrelasjon test (tosidig) for å vurdere betydningen av denne sammenhengen. Vi fant at det var en sterk, meget signifikant korrelasjon (rs = -0,95, p 0,0001) mellom gjennomlesing nivå og reduksjonen i luciferase-aktivitet. Således, både aminoglykosid og dipeptidet negamycin kan indusere APC biologisk aktivitet fra en mutant cDNA, og aktivitetsnivået er proporsjonalt med gjennomlesning nivå. Som en kontroll, vi brukte pFopGlow vektor som inneholder muterte TCF /beta-catenin bindingssteder. Med denne vektoren, ble ingen signifikant endring observert etter aminoglykosid eller negamycin behandling (data ikke vist).
Recovery av APC biologisk aktivitet fra det endogene R1114X APC genet etter aminoglykosid behandling
Vi deretter undersøkt om den aminoglykosid behandling av endogene nonsens mutasjoner ville gi lignende resultater. LoVo celler (APC R1114X) ble transfektert med reporteren plasmid pTopGlow og ubehandlet eller behandlet med G418 eller negamycin. Aktiviteten av luciferase-rapportørgenet ildflue var maksimal i fravær av behandling, og ble satt til 100%, som følge av mangel på aktivitet av APC-proteinet. Behandling med negamycin og G418 redusert pTopGlow ildflue luciferase-aktivitet til 50% og 18% referanseverdi, henholdsvis (figur 2D). Aktivitetsnivået ble korrelert med gjennomlesning effektivitet (figur 2B). Overraskende, gentamicin behandling, til tross for å fremme nivåer av gjennomlesning som ligner de som ble oppnådd med negamycin, ikke redusere pTopGlow ildflue luciferase-aktivitet (data ikke vist). Således er gjennomlesing virkningsgrad ikke er den eneste bestemmende faktor for utvinning av full-lengde protein-aktivitet. Faktisk tilsvarer PTC gjennomlesing til inkorporering av en nær-beslektet aminoacyl tRNA [24], [25], [26], [27] (komplementære til to av de tre nukleotidene til et stoppkodon), eventuelt resulterer i erstatning av den normale rest av en aminosyre uforenlig med stabiliteten eller aktiviteten til full-lengde protein [10]. Det er mulig at forskjellige aminosyrer er innlemmet i stedet for stoppkodonet i nærvær av disse to stoffene, med bare negamycin behandling som fører til inkorporering av (en) aminosyre (r) er kompatibelt med den biologiske aktivitet av proteinet. Denne situasjonen kan oppstå på grunn av de forskjellige moduser av aktivitet av disse stoffene: aminoglykosider synes å binde utelukkende til dekodings sentrum [28], mens negamycin er blitt vist å binde seg ikke bare til et område av den lille ribosomale subenhet [9], men også til veggen av den begynnende kjede utgang tunnel av den store ribosomale subenhet [29]. Vi kan derfor forvente at undergruppe av naturlige suppressor tRNAs valgt å være annerledes etter aminoglykosid og negamycin behandlinger.
Som for de andre mutasjon testet, luciferaseekspresjon fra pFopGlow husing mutert TCF /beta-catenin bindingssteder ble ikke signifikant påvirket ved behandling med antibiotika (data ikke vist). Vi sjekket at aktiv APC protein var faktisk ansvarlig for den observerte nedgangen i ildflue luciferase uttrykk, ved hjelp av et siRNA spesifikt rettet mot APC mRNA. Vi først brukt RT-PCR for å kontrollere at siRNA effektivt redusert APC mRNA nivåer (figur 2E). LoVo-celler ble kotransfektert med den pTOPGlow reporter plasmid og siRNA målretting eller ikke rettet mot APC.
Etter behandling G418 (200 ug /ml), APC-målretting siRNA ga en nedgang i luciferase-aktivitet to ganger lavere enn den som ble observert i fravær av siRNA, mens den ikke-spesifikke siRNA hadde ingen virkning på luciferase-hemming (figur 2D). Således ble virkningen på reporteren system detektert spesifikt i nærvær av APC mRNA som indikerer at det er mediert av en aktiv APC protein.
For disse to mutantene, undersøkte vi muligheten for aminoglykosid behandling for å gjenopprette produksjons av full-lengde APC protein. Vi var i stand til å detektere full lengde APC protein i HeLa-celler (APC WT), men dette protein var ikke påvisbart etter medikamentbehandling i enten LoVo-celler (R1114X) eller DLD-1-celler transfektert med L360X cDNA (figur 3). Denne mangelen på deteksjon var sannsynligvis på grunn av begrensninger i teknikken for påvisning av små mengder av en stor (311 kDa) proteinet. Disse funnene antyder at lave nivåer av APC-protein kan være tilstrekkelig til å regulere aktiviteten av TCF /p-catenin transkripsjonen kompleks.
LoVo-celler ble etterlatt ubehandlet eller behandlet med G418 (200 ug /ml) i 72 timer. Western blots ble probet med FE-9 antistoff rettet mot den N-terminale ende av APC. Den forkortede former som svarer til de muterte alleler som er tilstede i LoVo-celler er angitt med piler. Et utdrag fra HeLa-celler (APC WT) ble anvendt som en kontroll; et bånd ble påvist ved 311 kDa.
Konklusjon
I denne studien undersøkte vi muligheten for gjennomlesning-induserende molekyler til å indusere produksjonen av et funksjonelt APC protein i celler som bærer forskjellige nonsense mutasjoner i APC genet. Biologisk aktivitet ble påvist for de to nonsens mutasjoner mest mottakelig for behandling aminoglykosid (R1114X og L360X), og denne aktiviteten var direkte proporsjonal med gjennomlesning nivåene målt med et dobbelt reporter system. Denne studien viser at gjennomlesning indusere som aminoglykosid og negamycin kan reaktivere APC tumorsuppressorgenet i kreftceller. Det gir en rasjonell strategi for å identifisere pasienter som sannsynligvis til å svare og derfor mer sannsynlig har nytte av behandling med gjennomlesning indusere. En fersk studie har gitt proof-of-prinsippet om at re-uttrykk for en full-lengde APC protein etter behandling med gjennomlesning indusere reduserer tumorstørrelse i en xenograft mus [12]. Videre har vi nylig vist at behandling av celler som bærer en nonsense-mutasjon i p53 tumor suppressor-gen fører til re-ekspresjon av full-lengde proteinet i stand til å utløse apoptose i tumorceller i kultur [11]. Alle disse data tyder på at molekyler som induserer stopp-kodon gjennomlesning kan potensielt brukes ikke bare til å behandle genetiske sykdommer, men også å diversifisere den eksisterende arsenal av behandlinger for kreft og som et rasjonelt grunnlag for utvikling av nye personlige behandlingsstrategier.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur
Alle celler ble dyrket i DMEM pluss Glutamax (Invitrogen), supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS, Invitrogen) og 100 U /ml penicillin /streptomycin. Celler ble inkubert i en fuktet atmosfære inneholdende 5,5% CO
2, ved 37 ° C. NIH3T3 (vennlig levert av Marc Sitbon) celler er embryonale mus fibroblaster. LoVo (APC R1114X og del 1 bp 1430, vennlig levert av Françoise Praz, [30]) og DLD-en (APC del 1 bp 1406, vennlig levert av Françoise Praz, [31]) celler er epitelceller avledet fra en human kolorektal adenokarsinom. HeLa (APC WT) celler er epitelceller avledet fra et menneske cervix adenokarsinom (vennlig levert av Fabrice Lejeune).
gjennomlesning kvantifisering i cellekultur
Komplementære oligonukleotider tilsvarende nonsense mutasjoner innebygd i deres naturlige kontekst (sekvensene i tabell 1) ble sammensmeltet og ligert inn i pAC99 dual reporter plasmid, slik som tidligere beskrevet [32]. Denne doble reporter tillater kvantifisering av stopp-kodonet gjennomlesing, gjennom måling av luciferase og beta-galaktosidase (intern kalibrering) aktivitet, slik som tidligere beskrevet [16]. De gjennomlesning nivåer av nonsens mutasjoner ble analysert i nærvær eller fravær av gentamicin. NIH3T3-celler ble elektroporert med 20 ug reporter plasmid og, den påfølgende dag ble cellene vasket og friskt medium, med eller uten gentamicin, amikacin, negamycin eller G418-tilskudd, ble tilsatt. I disse forsøk ble ingen celle-toksisitet observert for doser av antibiotika som brukes. Tjuefire timer senere ble cellene høstet og lysert med trypsin-EDTA (Invitrogen). Beta-galaktosidase og luciferase-aktivitet ble analysert som tidligere beskrevet [32]. Gjennomlesning effektivitet ble estimert ved å beregne forholdet mellom luciferase til beta-galaktosidase-aktivitet ble oppnådd med test konstruere og å normalisere det med hensyn til forholdet oppnådd med en i-ramme-konstruksjon kontroll. For hver konstruksjon ble minst fem uavhengige transfeksjon eksperimenter utført. For gjennomlesning kvantifisering i DLD-1, ble den samme protokoll som brukes, med unntak av at kalsiumfosfatmetoden ble brukt for transfeksjon. For hver konstruksjon ble minst tre uavhengige transfeksjon eksperimenter utført.
Expression plasmidkonstruksjoner
pCMV APC WT ble vennlig levert av Dr. Bert Vogel (Johns Hopkins Oncology Center, Baltimore). Rettet mutagenese ble utført på et fragment av APC-genet for å skape APC L360X nonsense-mutasjon (pCMV APC L360X). Sekvensen av re-innsatte fragmentet ble verifisert.
Western-blot-analyse
LoVo-celler ble behandlet med G418 (200 ug /ml) i 72 timer. Mediet ble byttet ut og nye antibiotika ble tilsatt hver dag. Celler ble behandlet som tidligere beskrevet [11]. Total proteinnivåer ble bestemt ved hjelp av Bradford-reagens (Biorad) og ekstraktene ble denaturert ved inkubering i Laemmli-buffer i 5 minutter ved 90 ° C. Vi underkastet 100 mikrogram av totalt protein for SDS-PAGE i NuPAGE Novex 3/8% Tris /acetat pre-støpte geler (Invitrogen). Proteiner ble overført på nitrocellulosemembraner over natten, som anbefalt av produsenten. Membraner ble mettet ved inkubering i 1 time i TBS supplert med 5% ikke-fett melkepulver, og inkubert med det primære monoklonale antistoff, FE-9 (N-terminal epitop mapping mellom aminosyrerestene 1 og 35 av APC, Calbiochem, 1 /100). Membraner ble vasket tre ganger i TBS supplert med 1% ikke-fett melkepulver og inkubert med sekundært antistoff (pepperrot-peroksidase-konjugert anti-mus IgG (1/2500) eller alkalisk fosfatase-konjugert anti-mus IgG (1/7000) Promega ) i 45 minutter. De ble vasket seks ganger og chemiluminescence ble påvist med ECL Western blotting gjenkjenning reagenser (Amersham, GE Healthcare).
Protein aktivitetsanalyser
Den biologiske aktiviteten av APC ble estimert med pTOPGlow vektor (kindly gitt av Dr. Marc Van de Wetering, Universitetssykehuset Utrecht, Nederland).
DLD-1 celler ble transfektert med pCMV L360X (4 mikrogram), pTOPGlow eller pFOPGlow (10 mikrogram) og pCMVLacZ (2 mikrogram) , ved hjelp av kalsiumfosfatmetoden. Hver DNA-utfellingen ble delt mellom to brønner på en seks-brønns plate. Antibiotika (10 ug /ml til 200 pg /ml G418, 800 pg /ml gentamicin, 2 mg /ml Amikacin; 1 mg /ml negamycin) ble tilsatt umiddelbart etter transfeksjon, med unntak av G418, som ble tilsatt dagen etter. Mediet ble skiftet ut daglig, og nye antibiotika ble tilsatt. Vi har fremstilt proteinekstrakter 48 timer etter transfeksjon, og målte enzymatiske aktiviteter
For LoVo-celler, antibiotika. (G418 ved konsentrasjoner på 50, 100 og 200 ug /ml, 1 mg /ml negamycin) ble tilsatt dagen før transfeksjon og på hver påfølgende dag. LoVo-celler ble transfektert ved kalsiumfosfatmetoden, med TOPGlow eller FOPGlow (10 ug) og pCMVLacZ (2,8 ug) for å normalisere for transfeksjonseffektivitet, celle-levedyktighet og proteinekstraksjon variabilitet. Hver DNA-utfellingen ble delt mellom to brønner på en seks-brønns plate. Tre dager etter transfeksjon, ble proteinekstrakter fremstilt og enzymatiske aktiviteter ble målt.
For hver cellelinje, i det minste tre uavhengige eksperimenter ble utført transfeksjon.
siRNA trans
I LoVo-celler, protein-aktivitet ble bestemt som beskrevet ovenfor. Cellene ble transfektert med siRNA rettet mot mRNA APC (Dharmacon ON-TARGET pluss J-003869-12) eller NS, nontargeting (Dharmacon på målet og styr siRNA # 1), i nærvær av DharmaFECT Duo (Thermo Scientific, 1,3 mikrogram av siRNA per brønn av en seks-brønns plate), 24 timer etter deres første transfeksjon som beskrevet ovenfor. Transfekterte celler ble straks inkubert i medium med eller uten G418 (200 ug /ml) tilskudd. Tre dager etter transfeksjon ble cellene høstet og luciferase og beta-galaktosidase-aktivitet ble analysert som beskrevet ovenfor. Minst fire uavhengige transfeksjon eksperimenter ble utført.
Takk
Vi vil gjerne takke alle medlemmene i laboratoriet og Mounira Amor-Guéret (Institut Curie, CNRS, Orsay) for nyttige diskusjoner. Vi takker også Julie Frugier for teknisk assistanse.
