Abstract
Kronisk betennelse-forfremmet metastaser har vært ansett som en stor utfordring i kreftbehandling. Pro-inflammatoriske cytokin TNFa kan indusere kreft invasjon og metastasering assosiert med epitelial-mesenchymale overgang (EMT). Men de underliggende mekanismene er ikke helt klart. I denne studien viste vi at TNFa induserer EMT i menneskelige HCT116 cellene og dermed fremmer tykktarmskreft (CRC) invasjon og metastasering. TNFa-indusert EMT ble karakterisert ved å anskaffe mesenchymale spindellignende morfologi og øke ekspresjonen av N-cadherin og fibronektin med en ledsagende reduksjon av E-cadherin og Zona occludin-en (ZO-1). TNFa behandling også økt uttrykk av transkripsjonsfaktor Snail, men ikke Slug, ZEB1 og Twist. Overekspresjon av snegle induserte en overgang fra E-cadherin til N-cadherin ekspresjon i HCT116-celler, som er karakteristisk for EMT. Motsatt, knockdown of Snail betydelig svekket TNFa-indusert EMT i HCT116 cellene, noe som tyder på at sneglen spiller en avgjørende rolle i TNFa-indusert EMT. Interessant, eksponering for TNFa økt raskt Snail protein uttrykk og Snail kjernefysiske lokalisering, men ikke mRNA nivå oppregulering. Til slutt viste vi at TNFa forhøyet Snail stabilitet ved å aktivere AKT sti og senere undertrykke GSK-3β aktivitet og redusere sammenslutning av Snail med GSK-3β. Knockdown av GSK-3β ytterligere bekreftet våre funn. Samlet utgjør disse resultatene viste at AKT /GSK-3β-mediert stabilisering av Snail er nødvendig for TNFa-indusert EMT i CRC celler. Vår studie gir en bedre forståelse av betennelse-indusert CRC metastase
Citation. Wang H, Wang H-S, Zhou B-H, Li C-L, Zhang F, Wang X-F, et al. (2013) Epitelial-Mesenchymale Transition (EMT) indusert av TNF-α Krever AKT /GSK-3β-mediert Stabilisering av Snail i tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (2): e56664. doi: 10,1371 /journal.pone.0056664
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 13 august 2012; Godkjent: 14 januar 2013; Publisert: 19 februar 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av National Basic Research Program of China (973 Program, nr 2011CB935800), og Natural Science Foundation National of China (nr 30873032 og nr 81071712). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kronisk betennelse har blitt identifisert til å være nært forbundet med tumorigenesis [1], [2]. Økende bevis har vist at den inflammatoriske svulsten mikromiljøet spiller en avgjørende rolle i tumorutvikling og metastase [3]. Svulstens mikromiljø er i stor grad orkestrert av betennelsesceller, som letter ekstracellulære matrise sammenbrudd, angiogenese, og vev remodeling, og dermed fremme svulst cellemotilitet [4]. Videre tumorceller selv kan utskille proinflammatoriske cytokiner som bidrar direkte til ondartet progresjon [5]. De komplekse interaksjoner mellom tumor og inflammatoriske celler mediert av inflammatoriske cytokiner er en vesentlig del av svulsten mikromiljøet [6]. Tumornekrosefaktor α (TNF-alfa), et proinflammatorisk cytokin hovedsakelig produsert av makrofager, er en viktig molekyl som regulerer betennelsesprosesser i tumorvekst. Monterings bevis antydet at TNFa medierer mange kritiske prosesser av tumorprogresjon, inkludert onkogen aktivering, DNA-skade, og tumormetastase [7].
Epithelial-mesenchymale overgang (EMT), en essensiell fenotypisk omdannelse under embryonal utvikling, vev remodellering, og sårheling, spiller en uunnværlig rolle i tumorinvasjon og metastase [8] – [10]. EMT er en reversibel prosess som ofte oppstår ved invasiv foran mange metastatiske kreftformer [11]. EMT kan utløses av forskjellige signaler som mottas fra tumor mikromiljøet, for eksempel TGFfi, EGF, WNTs og Notch [12]. I løpet av de prosesser av EMT, epitelceller tap intercellulær adhesjon, erverve fibroblast-lignende egenskaper og øke trekkende og invasive egenskaper [13]. En av de mest veldefinerte funksjoner i EMT er tapet av E-cadherin uttrykk [8]. En gruppe av transkripsjonsfaktorer, inkludert snegle, Slug, ZEB1, Twist, har vært innblandet i kontrollen av EMT [14]. Snail, en sink-finger transkripsjonsfaktor først identifisert i Drosophila, har blitt bevist som en viktig EMT regulator [15]. Undersøkelser viste at sneglen undertrykker E-cadherin transkripsjon ved binding til E-box området i formidler av E-cadherin [16] – [18]. Rollene som Snail i EMT regulering er rapportert i mange typer kreft som brystkreft, eggstokkreft karsinom, etc. [14], [18], [19]. Stanse av Snail ved stabil RNA interferens induserer komplett mesenchymale til epitel overgang (MET) i MDCK-Snail celler, som assosierer med hemming av invasjonen [20]. I tillegg høy uttrykk for Snail korrelerer også med svulst klasse, tilbakefall, nodal metastaser og dårlige resultater hos pasienter [21] – [25]. Flere inflammatoriske mediatorer slik som TGFp, hypoksi og IL-6 kan oppregulere sneglen og dermed utløse EMT [3]. Disse funnene markere betydningen av mikromiljøet i reguleringen av sneglen og i initiering av EMT.
tykktarmskreft (CRC) er en stor verdensomspennende helseproblem. De fleste dødsfall fra CRC er på grunn av metastaser som er resistente mot konvensjonell terapi. EMT er en svært aktuell problemstilling å CRC metastaser [26]. Imidlertid er rollen til TNFa i EMT av CRC sjelden etterforsket og den underliggende molekylære mekanismen er fortsatt uklart. Her viste vi at TNFa-indusert EMT ved å stabil Snail i HCT116 og Caco-2 celler. Vi viste også at TNFa stabiliserer Snail ved å aktivere AKT sti og dermed hemme GSK-3β aktivitet og redusere sammenslutning av GSK-3β og sneglen.
Materialer og metoder
Kjemikalier og reagenser
NF-kB-inhibitor BAY11-7082, ERK-inhibitor PD98059, p38 MAPK-inhibitor SB-203580, PI3K-inhibitor LY294002, GSK-3β inhibitor litium (LiCl) og proteasominhibitor MG132 ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . Primære antistoffer mot E-cadherin, Zona occludin-en (ZO-1), sneglen, ZEB1, p-GSK-3β (ser9), GSK-3β, p-Akt (Ser473), Akt, og β-catenin ble oppnådd fra Cell Signaling Technology (MA, USA). Primær antistoff mot Histone H2A.X ble hentet fra BioWorld (BioWorld Technology, Minneapolis, Minnesota, USA). Protein A /G-Sepharose og primære antistoffer mot N-cadherin, ubiquitin, β-actin, tubulin-α ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Primær antistoff mot fibronektin ble hentet fra BOOSTER Biological Engineering. Pepperrot (HRP) konjugert sekundært antistoff, Alexa Fluor 488/594 konjugert sekundært antistoff, DAPI og lipofektamin 2000 ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Rekombinant human TNFa protein ble kjøpt fra Peprotech. PrimeScript® RT reagent Kit og SYBR® Premiks Ex Taq ™ var produkter av Takara. E.Z.N.A® HP Total RNA Kit ble kjøpt fra Omega Bio-Tek (Doraville, USA). Smart basseng siRNA mot menneskelige sneglen og GSK-3β var fra RIBOBIO.
Cell Culture
HCT116 og Caco-2 tykktarmskreft cellelinjer ble hentet fra Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina). HCT116-celler ble opprettholdt i McCoy’5a kulturmedium (Gibco BRL) supplert med 10% føtalt bovint serum, og Caco-2-celler ble dyrket i DMEM kulturmedium (Gibco BRL) supplert med 10% føtalt bovint serum under en fuktig 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C i inkubator.
Transwell migrasjon og invasjon analysen
Migrasjon og invasjonen ble utført i Boyden kamre. Av polykarbonatfiltre (8 um porestørrelse, Corning) belagt på forhånd med Matrigel Matrix (BD Biosciences) ble anvendt for invasjon analysen, og ubelagte filtere ble anvendt for migrering analysen. -Celler (1 x 10
5) i 300 ul medium (inneholdende 0,1% FBS) med eller uten 20 ng /ml TNFa ble sådd ut i det øvre kammer. Da 600 ml medium med 10% FBS ble tilsatt til det nedre kammer og tjente som et kjemotaktisk middel. Etter 24 timers inkubering, for migrering, cellene overført og klebet til det nedre kammer ble fiksert i 4% paraformaldehyd i 20 minutter, farget med hematoksylin og tellet under mikroskop oppreist (5 felt per kammer). For invasjon, ble cellene i det øvre kammer fiksert i 4% paraformaldehyd i 20 min. Da matrigel ble mekanisk fjernet fra filteret med en bomullspinne. Cellene fester seg til undersiden av filteret ble farget med hematoksylin og tellet under oppreist mikroskop (5 felt per kammer). Hver migrasjon og invasjon analysen ble gjentatt i tre uavhengige eksperimenter.
Gene Over utfoldelse og RNA interferens
Cellene ble sådd på en seks-brønns plate (2 × 10
5 celler /brønn) og igjen i kulturen før neste dag. De ble så transfektert med 2 ug plasmid-vektor eller 100 pmol oligomer siRNA blandet med lipofektamin 2000 reagens i serum redusert medium i henhold til produsentens instruksjoner. Mediet ble endret for å fullføre kulturmedium i 6 timer senere, og cellene ble inkubert ved 37 ° C i en CO
2 inkubator i ytterligere 24 til 48 timer før høsting.
Kvantitativ Real-Time PCR
Total mRNA av cellene ble ekstrahert etter behandling i den angitte tid. Førstetråds-cDNA-syntese ble generert fra 500 ng av total RNA. Kvantifisering av mål og referanse (GAPDH) gener ble utført i tre eksemplarer på LightCycler® 480 II (Roche, Applied Science). Primerne anvendt i hver reaksjon var som følger: E-cadherin fremover 5′-TACACTGCCCAGGAGCCAGA-3 «og 5′-revers TGGCACCAGTGTCCGGATTA-3′; N-cadherin, fremover 5»-CGAATGGATGAAAGACCCATCC-3 «og 5′-revers GGAGCCACTGCCTTCATAGTCAA-3»; Snail, frem 5’GACCACTATGCCGCGCTCTT-3 «og omvendt 5′-TCGCTGTAGTTAGGCTTCCGATT-3′; ZEB1, fremover 5»-TACAGAACCCAACTTGAACGTCACA-3 «og 5′- omvendt GATTACACCCAGACTGCGTCACA-3′; Twist, fremover 5»-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3 «og 5′-revers TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3′; Slug, fremover 5»-TTCGGACCCACACATTACCT-3 «og 5′-revers GCAGTGAGGGCAAGAAAAAG-3′; GAPDH, forover 5»- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 «og 5′-revers TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3». Etter normalisert til GAPDH-genet, ble ekspresjonsnivåer for hvert mål gen beregnet ved hjelp av sammenlignende terskelsyklusen (CT) -metoden. De Δct verdier ble beregnet i henhold til formelen Δct = ct (genet av interesse) -ct (GAPDH) i korrelasjonsanalyse, og den to-ΔΔct ble beregnet i henhold til formelen ΔΔct = Δct (kontrollgruppe) -Δct (eksperimentell gruppe) for bestemmelse av relativ. Data er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD) fra tre uavhengige eksperimenter.
Western blotting-analyse
Cellene ble vasket tre ganger med is-kald fosfat-bufferoppløsning (PBS) og deretter lysert i lyseringsbuffer inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,5% Na-deoksykolat, 5 ug /ml aprotinin, 5 ug /ml leupeptin, og 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid. Lysater ble fjernet ved sentrifugering og denaturert ved koking i Laemmli-buffer. Like mengder av proteinprøver ble lastet per brønn og separert på SDS-polyakrylamidgeler, og deretter elektroforetisk overført til PVDF-membraner. Etter blokkering med 5% fettfri melk ved romtemperatur i 2 timer ble membranene inkubert med primære antistoffer (1:1,000 fortynning) ved 4 ° C over natten og deretter inkubert med HRP-konjugerte sekundære antistoffer (1:5,000 fortynning) for to timer ved romtemperatur. Spesifikke immunkompleksene ble påvist ved anvendelse av Western blotting Plus Chemiluminescence reagens (Life Science).
Immunofluorescence
Cellene ble dyrket på kammers objektglass, serum-sultet i 12 timer, deretter eksponert for TNFa for den indikerte tid. Celler ble vasket tre ganger med PBS, fiksert med 4% paraformaldehyd i 20 minutter og permeabilisert med 0,3% Triton X-100 i 10 min. Etter blokkering med geiteserum i 2 timer ved romtemperatur, ble celler inkubert med antistoffer mot E-cadherin, N-cadherin, fibronektin, ZO-1 eller sneglen (1:100 fortynning) ved 4 ° C over natten. Objektglassene ble vasket tre ganger med PBS og inkubert med Alexa Fluor 488 eller Alexa Fluor 594-konjugerte sekundære antistoffer (1:1,000 fortynning) i 1 time ved romtemperatur. Kjerner ble farget med DAPI (10 ug /ml) i 10 minutter. Prøvene ble undersøkt med Confocal Laser Scanning Mikroskopi (Zeiss) for å analysere uttrykk for E-cadherin, N-cadherin, fibronektin, ZO-1 og kjernefysisk translokasjon av sneglen.
Immunpresipitasjon
Cellene var vasket tre ganger med iskald PBS og høstet ved 4 ° C i immunutfelling lyseringsbuffer inneholdende 50 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM Na
3VO
4, 1 mM NaF, 1 mM ditiotreitol, 1 mM 4- (2-aminoetyl) benzensulfonyl fluorid, 1 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin, 1 ug /ml aprotinin. Like mengder protein ble immunopresipitert ved bruk av anti-snegl eller anti-GSK-3β antistoff, og immunkompleksene ble bundet til protein A /G-Sepharose. Kulene ble vasket med lyseringsbuffer og underkastet Western-blotting med anti-ubikvitin, anti-snegl eller anti-GSK-3β antistoff.
Statistical Analysis
Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter med mindre annet er angitt. Data ble analysert ved tosidig uparet t-test mellom to grupper. Enveis ANOVA-analyse av varians ble benyttet for å vurdere forskjellen av midler blant grupper. Disse analysene ble utført ved hjelp av GraphPad Prism programvare versjon 5.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). En P-verdi på 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
TNFa Fremmer Migrasjon og invasjon av HCT116 Cells
Kreftceller med en aggressiv fenotype erverve trekkfugl og invasiv. evner. Dette vil fremme spredning av svulster celler til fjerne organer [8]. Migrasjon og invasjon evner HCT116-celler påvirkes av TNFa ble målt ved hjelp av Transwell migrasjon og invasjon analyser. Som vist i figur 1A og C, TNFa-behandling resulterte i en betydelig økning i cellemigrering og invasjon. Sammenlignet med kontroll, antall migrerte celler og invasive økt ca 4 ganger (migrering) og 20 ganger (invasjon) etter behandling med TNFa (fig. 1B og D).
(A) HCT116-celler ble tillates å migrere Transwell kamre i 24 timer i nærvær eller fravær av TNFa (20 ng /ml). Etter 24 timer ble de migrerte cellene fiksert, farget og fotografert. Forstørrelse, 100 ×. (B) Antallet migrerte celler. Data representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. (C) Etter behandling med eller uten TNFa (20 ng /ml) i 48 timer, ble HCT116-celler som var spredt gjennom matrixgel og inn i undersiden av filteret fiksert, farget, og fotografert. Forstørrelse, 200 ×. (D) Antallet av fremmede celler. Data representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. * P. 0,05 sammenlignet med kontroll
TNFa induserer EMT i HCT116 Cells
økt migrasjon og invasjon evner av kreftceller minner om hendelser på EMT, der den epitel stakere E-cadhein og ZO-1 er nedregulert, mens mesenchymale markører N-cadherin og fibronektin er oppregulert [27]. EMT av HCT116-celler ble observert etter stimulering med 20 ng /ml TNFa i 4 dager. Celler resulterte i en betydelig endring i morfologi, fra brostein morfologi til mesenchymale spindel-lignende og fusiform funksjoner (fig. 2A). Immunofluorescens-analyse viste at dette morfologisk endring ble assosiert med nedregulering av epitel-egenskaper E-cadherin, ZO-1-ekspresjonen og oppregulering av mesenchymale egenskaper fibronektin og N-cadherin ekspresjon (Fig. 2A). Tilsvarende western-blotting-analyse ytterligere bekreftet den økende ekspresjon av fibronektin og N-cadherin, og den minkende ekspresjon av E-cadherin og ZO-1 ved proteinnivåer (Fig. 2B). Videre viste QRT-PCR-analyse som TNFa behandling nedregulert E-cadherin og oppregulert N-cadherin på mRNA nivåer (Fig. 2C). Sammen er disse observasjoner antydet at HCT116-celler hadde gjennomgått en EMT etter behandlet med TNFa.
(A) HCT116-celler behandlet med eller uten TNFa (20 ng /ml) i 4 dager. Celle morfologiske endringer knyttet til EMT er vist i fase kontrast til. Ekspresjon av E-cadherin, ZO-1, fibronektin, N-cadherin ble analysert ved immunofluorescens farging. Kjerner ble visualisert med DAPI farging. Skala barer: 20 mikrometer. (B) HCT116-celler ble behandlet med eller uten TNFa (20 ng /ml) i 4 dager, og ekspresjon av E-cadherin, ZO-1, fibronektin, N-cadherin, sneglen, ZEB1, Twist, Slug ble analysert ved western blotting. p-aktin servere som lasting kontroll. (C) HCT116-celler behandlet med eller uten TNFa (20 ng /ml) i 4 dager. De mRNA nivåer av E-cadherin, N-cadherin, Snail, ZEB1, Twist, ble Slug analysert ved QRT-PCR. * P. 0,05 sammenlignet med kontroll
sneglen er avgjørende for TNFa-mediert EMT
Siden transkripsjon faktorer Snail, ZEB1, Twist og Slug spille viktige roller i regulering av EMT [14] da undersøkte vi om deres uttrykk ble oppregulert i HCT116-celler etter behandling med TNFa. Sammenlignet med ubehandlede celler, TNFa økte signifikant snegle proteinnivået, men ikke mRNA nivå (Fig. 2B og C). Men TNFa behandling endret verken mRNA eller protein nivåer av ZEB1, Twist, Slug (Fig. 2B og C).
Vi overexpressed Snail til å undersøke sine roller i TNFa-indusert EMT av HCT116-celler. -Celler ble transfektert med pcDNA-sneglen og kontroll vektor pcDNA-3,1, respektivt. Expression of Snail og EMT markører ble oppdaget av immunfluorescens og western blotting. Resultatene viste at økt Snail uttrykk indusert EMT-lignende morfologiske endringer og forårsaket en bryter fra E-cadherin til N-cadherin uttrykk i HCT116-celler (fig. 3A og B). Disse funnene viser at ektopisk uttrykk for snegle kan utløse EMT i HCT116 cellene. Basert på disse observasjonene, vurderte vi at sneglen oppregulering kan være avgjørende for TNFa-indusert EMT i HCT116 cellene.
(A) pcDNA-Snail (Snail) eller kontroll vektor pcDNA-3.1 (Vector) ble uttrykt i HCT116-celler i 48 timer. Celle morfologiske endringer knyttet til EMT er vist i fase kontrast til. Ekspresjon av E-cadherin og N-cadherin ble analysert ved immunofluorescens farging. Kjerner ble visualisert med DAPI farging. Skala barer: 20 mikrometer. (B) Ekspresjon av E-cadherin, N-cadherin og sneglen fra HCT116-celler transfektert med pcDNA-snegl eller kontrollvektor ble undersøkt ved Western blotting. p-aktin servere som lasting kontroll. (C) HCT116-celler transfektert med snegle spesifikk Si-RNA (Si-sneglen) eller negativ kontroll Si-RNA (Si-NC) ble stimulert med eller uten TNFa (20 ng /ml) i 48 timer, og de morfologiske endringer ble observert med et fasekontrastmikroskopi. (D) HCT116-celler transfektert med si-snegl eller si-NC ble stimulert med eller uten TNFa (20 ng /ml) i 4 dager, og ekspresjon av E-cadherin og sneglen ble påvist ved western blotting. β-aktin servere som laststyring.
Vi videre utført knockdown-analyser for å verifisere at sneglen er en viktig regulator i TNFa-indusert EMT. HCT116-celler ble transfektert med ikke-målsøkende kontroll si-RNA eller si-sneglen i 24 timer, og deretter behandlet med TNFa i forskjellig tid. Morfologiske forandringer ble observert under et fasekontrastmikroskop. Uttrykk for Snail og E-cadherin ble oppdaget av western blotting. Sammenlignet med kontrollgruppen, ble spindel-lignende morfologiske endringer ikke observert på TNFa-tilsetning i si-sneglen transfekterte celler (Fig. 3C). Stanse av Snail også dempes TNFa-indusert nedregulering av E-cadherin, som ikke ble observert i kontroll si-RNA-transfekterte celler (Fig. 3D). Samlet utgjør disse observasjonene viste at sneglen er avgjørende for TNFa-indusert EMT i HCT116 cellene.
TNFa Regulerer Stabilisering og subcellulære lokalisering av Snail
Vi har tidligere funnet at TNFa økte Snail protein nivå, men ikke mRNA nivå (fig. 2B og C). Dette resultatet antydet at oppregulering av sneglen av TNFa ble opptrer ved post-transkripsjonelle nivå. For å bekrefte dette synet videre, ble HCT116 og Caco-2 celler behandlet med TNFa for 0-8 timer, og sneglen protein og mRNA ble oppdaget av western blotting og QRT-PCR, henholdsvis. Resultatene viste at proteinnivået snegle ble forbedret etter en time av TNFa stimulering og økt tidsavhengig (fig. 4A). Men den mRNA nivået av Snail ikke ha en betydelig endring etter TNFa behandling (Fig. 4B). Disse resultatene antydet at oppregulering av sneglen av TNFa kan være på grunn av proteinstabilisering.
(A-B) HCT116 og Caco-2-celler ble behandlet med TNFa (20 ng /ml) i de tidsrom som er angitt, og protein (A) og mRNA (B) nivåer av sneglen ble undersøkt ved hjelp av henholdsvis western blotting og QRT-PCR; (C) HCT116-celler behandlet med eller uten TNFa (20 ng /ml) i 6 timer. Etter fiksering ble cellulære plassering av sneglen (grønn) undersøkt ved immunfluorescens farging og kjerner ble farvet med DAPI (blå). Skala barer: 20 mikrometer
Siden transkripsjonsfaktorer kan bare tre i kraft når de overfører til kjernen [28], vi har også bestemt atomtrans aktivitet av Snail ved immunfluorescens.. Den nukleære lokalisering av snegle ble vurdert i HCT116-celler stimulert med eller uten TNFa i 8 timer. Som vist på fig. 4C, sammenlignet med kontrollgruppen, TNFa økt betydelig den kjernefysiske translokasjon av sneglen.
TNFa som megler Snail Stabilisering via Aktivering av AKT og Hemming av GSK-3β
For å undersøke de molekylære mekanismene som ligger til grunn TNFa -mediert Snail stabilisering, ble hemmere av NF-kB (BAY11-7082), PI3K /AKT (LY294002), MAPK (PD98059), p38 (SB-203 580) som brukes, siden TNFa kan indusere aktivering av disse banene. HCT116 og Caco-2-celler ble forbehandlet med inhibitorer i 1 time før stimulering TNFa, og deretter ekspresjon av sneglen ble bestemt ved Western blotting. Vi fant at PI3K /AKT-inhibitor (LY294002), men ikke de andre, fullstendig blokkert TNFa-stabilisert sneglen (fig. 5A), hvilket antyder at aktiveringen av PI3K /AKT-reaksjonsveien er ansvarlig for TNFa-mediert sneglen stabilisering.
veien. (A) HCT116-celler ble forbehandlet med SB-203580 (20 uM), PD98059 (20 uM), BAY11-7082 (10 uM), LY294002 (20 pM) i 1 time henholdsvis, fulgt av stimulering med TNFa (20 ng /ml) i 6 timer. Ekspresjon av sneglen ble undersøkt ved western blotting. Caco-2-celler ble forbehandlet med SB-203580 (20 uM), BAY11-7082 (10 uM), LY294002 (20 pM) i 1 time henholdsvis, fulgt av stimulering med TNFa (20 ng /ml) i 6 timer. Ekspresjon av sneglen ble undersøkt ved western blotting. (B) HCT116-celler ble forbehandlet med eller uten LY294002 (20 pM) i 1 time, etterfulgt av stimulering med eller uten TNFa (20 ng /ml) i 6 timer. Ekspresjonen av sneglen og aktivering av AKT og GSK-3β ble undersøkt ved Western blotting. (C) HCT116 og Caco-2-celler ble behandlet med TNFa (20 ng /ml) i tidspunktene angitt. Ekspresjonen av pGSK-3β og GSK-3β ble undersøkt ved Western blotting. (D) Kontroll og GSK-3β si-RNA ble uttrykt i HCT116-celler i 42 timer, fulgt behandlet med eller uten TNFa (20 ng /ml) i ytterligere 6 timer. Uttrykket av sneglen og GSK-3β ble undersøkt ved Western blotting. (E) HCT116-celler behandlet med TNFa (20 ng /ml) eller LiCl (40 mM) i 6 timer. Uttrykket av sneglen, pGSK-3β, GSK-3β, og β-catenin ble analysert ved western blotting. (F) Etter behandlede HCT116-celler med eller uten TNFa (20 ng /ml) i 6 timer, sneglen og β-catenin plassert på membranen og atom ble isolert henholdsvis, og deretter analysert ved western blotting.
sneglen er en i hovedsak regulert av GSK-3β, en kinase som ligger nedstrøms for PI3K /AKT sti [24], [29], [30]. GSK-3β fører en aktiv stat i defosforylert form. For å avgjøre om stabilisering av Snail av TNFa er mediert av regulering av GSK-3β aktivitet, behandlet vi HCT116-celler med LY294002 før TNFa behandling, og deretter uttrykk for p-AKT, p-GSK-3β, og sneglen ble bestemt av western blotting. Vi har funnet at nivåene av p-AKT, p-GSK-3β, og sneglen ble økt etter TNFa-behandling i 6 timer, mens disse effektene ble reversert ved behandling med LY294002 alene eller i kombinasjon med TNFa (fig. 5B). Deretter ble tidsforløp for GSK-3β fosforylering og funnet at ekspresjonen av p-GSK-3β økt i en tidsavhengig måte ved TNFa stimulering i HCT116 og Caco-2-celler (fig. 5C). Disse resultatene indikerte at stabilisering av sneglen av TNFa er på grunn av hemming av GSK-3β aktivitet. For ytterligere å bekrefte funnene våre, vi slått ned uttrykket av GSK-3β i HCT116-celler med bestemte GSK-3β si-RNA (Fig. 5D). Sammenlignet med kontroll, nedregulering av GSK-3β markert forhøyet nivåene av sneglen uttrykket (fig. 5D). Imidlertid TNFa-mediert sneglen stabilisering ikke ble ytterligere forhøyet etter knockdown av GSK-3β (fig. 5D). Tilsvarende, når vi behandlet HCT116-celler med LiCl, en potent GSK-3β inhibitor, i samsvar med TNFa-behandling, er uttrykk for sneglen, p-GSK-3β, og β-catenin (et protein regulert av GSK-3β) ble øket ( fig. 5E). Men oppregulering av β-catenin var ikke så opplagt som sneglen. Det kan være grunn til intracellulære lokaliseringer mellom β-catenin og sneglen er forskjellige. For å bekrefte denne hypotesen, isolert vi Snail og β-catenin fra membranen og kjernefysisk av HCT116 celler behandlet med eller uten TNFa. Resultatene viste at forskjellige til sneglen, eksisterer β-catenin på plasmamembranen, og TNFa øker den nukleære translokasjonen av sneglen og β-catenin, men påvirker ikke membran β-catenin (fig. 5F). Samlet utgjør disse resultatene viste at TNFa oppregulert Snail i HCT116 cellene ved å aktivere AKT signale som fører til fosforylering av GSK-3β og deretter stabil Snail.
TNFa undertrykker Ubiquitylation av Snail ved å hemme Association of Snail og GSK-3β
Fordi protein stabilitet Snail er regulert via ubiquitin-mediert proteasomal nedbrytningsprosesser, spekulerte vi om stabilisering av Snail av TNFa er mediert av undertrykkelse av Snail ubiquitylation. For å teste denne hypotese, ble HCT116-celler behandlet med TNFa eller proteasominhibitor MG132 i 6 timer, og deretter sneglen ble immunopresipitert fra tilsvarende mengde lysater. Den ubiquitinering tilstand av sneglen ble påvist ved western blotting med et anti-ubiquitin-antistoff. Resultatene viste at sammenlignet med MG132, TNFa dramatisk undertrykte ubiquitylation av sneglen, selv om de totale stabiliserte Snail proteiner var parallell (Fig. 6A). Siden GSK-3β er hoved kinase som fosforylerer sneglen og deretter induserer protein degradering av Snail [24], vi neste undersøkt sammenhengen av sneglen og GSK-3β. HCT116-celler behandlet med TNFa eller MG132 i 6 timer, og deretter sneglen ble immunoutfelt fra lysater lik mengde, og den tilhørende GSK-3β ble målt ved Western blotting. Som vist på fig. 6B, foreningen av Snail med GSK-3β ble redusert i celler behandlet med TNFa, sammenlignet med celler behandlet med MG-132. Tilsvarende, når GSK-3β ble immunopresipitert fra HCT116-celler, den tilknyttede sneglen ble markert redusert i celler behandlet med TNFa, sammenlignet med celler behandlet med MG-132 (fig. 6B). Samlet utgjør disse funnene viste at TNFa hemmet foreningen av Snail med GSK-3β og senere undertrykt ubiquitylation av sneglen.
(A) HCT116 cellene ble behandlet med TNFa (20 ng /ml) eller MG132 (10 mikrometer ) i 6 timer. Etter at sneglen ble immunoutfelt fra lysater lik mengde (to nedre paneler), ble ubiquitinering av sneglen undersøkt ved western blotting. (B) HCT116-celler behandlet med TNFa (20 ng /ml) eller MG132 (10 uM) i 6 timer. Snail eller GSK-3β ble immunopresipitert henholdsvis lik mengde lysatene og den tilhørende GSK-3β eller sneglen ble oppdaget av western blotting.
Diskusjoner
En stor utfordring i kreftbehandling er metastase indusert av kronisk betennelse. Imidlertid er de underliggende mekanismer som ikke er fullstendig illustrert. Flere inflammatoriske mediatorer, for eksempel TGFB og IL-6, har vist seg som bidrar til invasjonen og metastasering av kreft [3]. TNFa er et viktig proinflammatorisk cytokin som har et bredt spekter av biologiske aktiviteter, inkludert inflammasjon, apoptose, celleproliferasjon og differensiering [31]. Selv om TNFa har vært ansett som et anticancermiddel, er det for tiden anerkjent at kronisk forhøyet TNFa i vev kan fremme tumorvekst, invasjon og metastase [32]. Det finnes noen rapporter som TNFa ekspresjon økes i serum hos pasienter CRC [33]. TNFa uttrykk er også assosiert med tumor progresjon av kolorektal adenokarsinomer [34]. I tillegg er høy TNFa ekspresjon sterkt assosiert med tumor tilbakefall i CRC pasienter med positiv lymfeknutemetastase [34]. TNFa kan være nyttig som en produsent for tidlig diagnose av CRC. I denne studien undersøkte vi en viktig signal akse som styrer inflammatoriske cytokiner og induserer EMT. Til tross for den viktige rollen av NF-kB i inflammatoriske prosesser, demonstrerte vi at AKT /GSK-3β-formidlet stabilisering av sneglen er nødvendig for TNFa-indusert EMT i CRC-celler. Basert på våre funn, har vi foreslått en modell i hvilken TNFa opp-regulerer sneglen via aktivering av AKT signalisering og derved hemmer GSK-3β aktivitet. TNFa hemmer også foreningen av sneglen og GSK-3β. Og så TNFa stabilisert Snail overføring til kjernen, minsker epitelceller stakere E-cadherin og ZO-1 uttrykk, øker mesenchymale stakere N-cadherin og fibronektin uttrykk, endelig induserer EMT og fremmer tumormetastaser.
EMT har vært ansett som det første trinn av tumorinvasjon og metastase. Nyere studier viser at uttrykket profiler av EMT er korrelert med tumor karakterer og metastasering av bryst-karsinom [35], [36].
