Abstract
cyanogenic diglucoside amygdalin, avledet fra Rosaceae kjerner, er ansatt av mange pasienter som et alternativ kreftbehandling. Men om amygdalin faktisk virker som et anti-tumormiddel er ikke klart. Metastase blokkerende egenskaper av amygdalin om blærekreft cellelinjer ble derfor undersøkt. Amygdalin (10 mg /ml) ble påført på UMUC-3, TCCSUP eller RT112 blærekreftceller i 24 timer eller i 2 uker. Tumor celle adhesjon til vaskulært endotel eller til immobilisert kollagen samt tumorcellemigrering ble undersøkt. Effekter av medikamentbehandling på integrininhibitorer α og p subtyper, på integrin-bundet kinase (ILK) og total og aktivert fokal adhesjonskinase (FAK) ble også bestemt. Inte knock-down ble utført for å evaluere inte innflytelse på migrasjon og vedheft. En 24 t eller to ukers amygdalin søknad tydelig redusert svulst celle adhesjon og migrasjon av UMUC-3 og RT112 celler. TCCSUP vedheft ble også redusert, men migrasjon ble hevet etter amygdalin. Integrin subtype ekspresjon ble betydelig, spesielt endret av Amygdalin avhengig av cellelinjen. ILK var moderat, og aktivert FAK sterkt, tapt i alle tumorcellelinjer i nærvær av amygdalin. Slå ned av β1 integrin forårsaket en signifikant reduksjon i både adhesjon og migrasjon av UMUC-3-celler, men en signifikant økning i TCCSUP adhesjon. Slå ned av β4 inte forårsaket en betydelig reduksjon i migrasjon av RT112 celler. Siden de forskjellige virkninger av amygdalin på de forskjellige cellelinjer ble gjenspeilet av β1 eller ß4 slå ned, er det postulert at amygdalinet påvirker adhesjonen og migrasjonen egenskaper av blærekreftceller ved å modulere β1 eller β4 inte uttrykk. Den amygdalin induserte økningen i TCCSUP vandrende adferd indikerer at eventuelle anti-tumor fordeler fra amygdalin (sett med de to andre cellelinjer) kan avhenge av kreftcelletype
Citation. Makarević J, Rutz J, Juengel E , Kaulfuss S, Tsaur jeg, Nelson K, et al. (2014) Amygdalin Påvirker blærekreft celle adhesjon og invasjon
In Vitro
. PLoS ONE 9 (10): e110244. doi: 10,1371 /journal.pone.0110244
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 23 juni 2014; Godkjent: 14 september 2014; Publisert: 15 oktober 2014
Copyright: © 2014 Makarević et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av «Brigitta und Norbert Muth Stiftung» og «Freunde und Förderer der Goethe-Universität Frankfurt» (finansiering mottatt av RAB). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
bruk av komplementær og alternativ medisin (CAM) har økt jevnt de siste tiårene. CAM inkluderer ikke-konvensjonell terapi som homeopati, vitamin terapi, phytomedicine og tradisjonell kinesisk medisin, akupunktur og yoga [1]. Forbruket av naturlige produkter er mest bred spredning. Opp til 80% av kreftpasienter i USA [2], og mer enn 50% av kreftpasienter i Europa bruker CAM sammen med eller i stedet for konvensjonell terapi [3]. Misnøye med konvensjonell behandling og reduksjon av kjemoterapeutiske bivirkninger er de mest vanlig gitt grunner for bruk av CAM [4], [5].
I motsetning til den utstrakte bruk av naturlige forbindelser, informasjon om deres terapeutiske effektivitet er sparsom. Avviket mellom bruk og saklig Fordelen er spesielt tydelig med cyanogenic diglucoside amygdalin (D-Mandelonitrilet-β-gentiobioside), til stede i kjerner av frukt fra Rosaceae arter som Prunus persica (fersken), Prunus armeniaca (aprikos) og Prunus Amygdalus Amara (bitter mandel). Amygdalin ble først isolert i 1873. Siden 1920-tallet har amygdalin er muntlig brukt til å behandle kreftpasienter i USA. På 1950-tallet ble en intravenøs form av amygdalin syntetisert og patentert som laetrile [6]. Selv laetrile er kjemisk forskjellig fra amygdalin, er begrepene brukes om hverandre, noe som gjør tolkning av kliniske data vanskelig. Denne rapporten utelukkende refererer til «amygdalin».
Amygdalin var en av de mest populære, ikke-konvensjonelle, anti-kreft behandlinger i 1970 og etter 1978, hadde 70.000 amerikanske kreftpasienter brukes amygdalin [7]. Likevel, evidensbasert forskning på amygdalin var og er sparsom og sin fordel kontroversielt. Talsmenn vurdere amygdalin en naturlig kreft kur, mens motstandere advarer om at amygdalin er ineffektiv og selv giftig. Randomiserte kliniske studier og oppfølgingsstudier har aldri blitt gjennomført. En klinisk studie sponset av National Cancer Institute for 30 år siden avdekket ikke tegn til tumor regresjon [8], mens en retrospektiv analyse av 67 kreftpasienter tar amygdalin rapportert 2 komplett og 4 partielle responser [9]. Ambivalens har også gitt seg utslag i kasuistikker, der amygdalin var ineffektive i fem og effektiv i fire saker [6].
Denne studien er designet for å vurdere om amygdalin endrer metastatisk tumor celle progresjon in vitro siden invasjonen og metastasering er kritiske trinn i ondartet svulst progresjon og den viktigste årsaken til behandlingssvikt. Derfor forstyrrer tumorcelle invasjon kaskade kan være et nyskapende alternativ for å motvirke metastatisk tumor spredning. Anvendelse av et panel av blærecancercellelinjer, ble effekten av amygdalin for å blokkere tumormassen og tumor endotelial interaksjon evaluert. I tillegg til evnen til amygdalin hindre motile spredning ble vurdert. En kohort av adhesjonsmolekyler er involvert i den komplekse prosessen med tumorcelle formidling. Siden adhesjonsreseptorer av integrin α og β familie er nært involvert i tumorcellebinding og transendothelial penetrasjon, disse var gjenstand for undersøkelse. Den membranøs integrin-reseptor-ekspresjonsprofilen, så vel som den intracellulære proteininnholdet i hver subtype, ble sammenlignet i amygdalin behandlede og ikke-behandlede celler. siRNA slå ned studier ble også utført for å undersøke disse parametrene endret av amygdalin, som kan ha klinisk relevans. In vitro data som presenteres her peke på betydelig vedheft og invasjon blokkerer effekten av amygdalin, sannsynligvis forårsaket ved å endre β1 eller β4 inte uttrykk.
Materialer og metoder
Cell kultur
RT112, UMUC-3 (ATCC /LGC Promochem GmbH, Wesel, Tyskland) og TCCSUP (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) blære karsinom-celler ble dyrket og subdyrket i RPMI 1640, 10% føtalt kalveserum (FCS), 20 mM HEPES-buffer , 1% Glutamax og 1% penicillin /streptomycin (alle: Gibco /Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland). Subkulturer fra passasjer 7-24 ble valgt for eksperimentell bruk. Humane endotelceller (HUVEC) ble isolert fra den humane navlestrengs vener og høstet ved enzymatisk behandling med dispase (Gibco /Invitrogen). HUVEC ble dyrket i medium 199 (M199; Biozol, Munchen, Tyskland), supplert med 10% FCS, 10% sammenslått humant serum, 20 ug /ml endotelial cellevekstfaktor (Boehringer, Mannheim, Tyskland), 0,1% heparin, 100 ng /ml gentamycin og 20 mM HEPES-buffer (pH 7,4). Subkulturer fra passasjer 2-6 ble valgt for eksperimentell bruk. HUVEC ble brukt i studien. Den institusjonelle etikk komité av Goethe-universitetssykehus, Frankfurt, Tyskland, godkjent etterforskningen og fravikes behovet for samtykke, siden HUVEC ble brukt anonymt for in vitro prøver med ingen kobling til pasientdata.
Amygdalin behandling
Amygdalin fra aprikoskjerner (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) ble friskt oppløst i tumorcellekulturmedium og deretter tilsatt til tumorceller i en konsentrasjon på 10 mg /ml i enten 24 timer eller i 2 uker [10 ] for å evaluere akutt versus kronisk behandling. Kontrollene mottok tumorcellekulturmedium alene. I alle forsøkene ble behandlet tumorcellekulturer i forhold til de ikke-behandlede seg. For å utelukke toksiske effekter av amygdalin, ble celleviabilitet bestemt av trypanblått (Gibco /Invitrogen).
Tumor celle adhesjon
For å analysere svulst celle adhesjon, HUVEC ble overført til seks-brønns multiplates ( Sarstedt, Nürnbrecht, Tyskland) i fullstendig HUVEC-medium. Ved konfluent, RT112, UMUC-3 eller TCCSUP celler ble løsnet fra kulturflasker ved accutase behandling (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland) og 0,5 x 10
6-celler ble deretter tilsatt til HUVEC monolaget for 30, 60 eller 120 min. Deretter ble ikke-heftende tumorceller ble vasket av ved hjelp varmet (37 ° C) Medium 199. De gjenværende celler ble fiksert med 1% glutaraldehyd. Hefttumorceller ble telt i fem ulike felt av en definert størrelse (5 × 0,25 mm
2) med en fasekontrastmikroskop, og gjennomsnittlig mobilnettet vedheft ble beregnet.
Vedlegg til immobilisert kollagen
6-brønns plater ble belagt med kollagen G (ekstrahert fra kalveskinn, bestående av 90% kollagen type i og 10% kollagen type III, Biochrom, Berlin, Tyskland, fortynnet til 400 ug /ml i PBS) over natten. Plast retter serveres som bakgrunn kontroll. Platene ble vasket med 1% BSA (bovint serumalbumin) i PBS for å blokkere ikke-spesifikk celle-adhesjon. 0,5 x 10
6 tumorceller ble deretter tilsatt til hver brønn og satt hen i 60 min inkubering. Deretter ble ikke-heftende tumorceller vasket av, ble de gjenværende adherente celler fiksert med 1% glutaraldehyd og tellet mikroskopisk. Gjennomsnittlig cellulære heft rate, definert av heftende celler
belagt godt – heftende celler
bakgrunn, ble beregnet fra fem forskjellige observasjonsfelt
Måling av svulst celle migrasjon
Serum utløst. kjemotaktisk bevegelse ble undersøkt ved hjelp av seks-brønns Transwell kamre (Greiner, Frickenhausen, Tyskland) med 8- mikrometer porer. 0,5 x 10
6 RT112, UMUC-3 eller TCCSUP celler /ml ble plassert i det øvre kammer i serumfritt medium, enten uten Amygdalin (terminert «amygdalin A») eller som inneholder amygdalin (terminert «amygdalin B») . Serumfritt medium i det øvre kammer og 10% serum i det nedre kammer forsynt serum gradient som er nødvendig for tumorcellemigrering i denne modellen. Etter 20 timers inkubering ble den øvre overflate av Transwell membranen forsiktig tørket med en bomullspinne for å fjerne celler som ikke hadde migrert. Celler som hadde flyttet mot serum gradienten til den nedre overflate av membranen ble farget med hematoksylin og tellet mikroskopisk. Den midlere migrasjonshastigheten ble beregnet fra fem forskjellige observasjonsfelt.
Inte overflateekspresjon
Tumorceller ble vasket i blokkeringsløsning (PBS, 0,5% BSA) og deretter inkubert i 60 minutter ved 4 C med fykoerytrin (PE) -konjugert monoklonale antistoffer rettet mot disse integrinundertyper: anti-a1 (IgG1; klon SR84), anti-a2 (IgG2a; klon 12F1-H6), anti-a3 (IgG1; klon C3II.1), anti-α4 (IgG1, klone 9F10), anti-α5 (IgG1, klone IIA1), anti-α6 (IgG2a; klone GoH3), anti-β1 (IgG1, klone MAR4), anti-β3 (IgG1, klone VI-PL2 ) eller anti-β4 (IgG2a, klone 439-9B, alle: BD Pharmingen, Heidelberg, Tyskland). Inte uttrykk for tumorceller ble deretter målt ved hjelp av et FACScan (BD Biosciences, Heidelberg, FL-2H (log) kanal histogram analyse; 1 x 10
4 celler /scan) og uttrykt som gjennomsnittlig fluorescens enheter. En mus IgG1-PE (MOPC-21) eller IgG2a-PE (G155-178, alle: BD Biosciences). Ble brukt som en isotypekontrollantistoff
Western blotting
For å undersøke inte innhold, tumorcellelysatene ble påført på en 7% polyakrylamid-gel og underkastet elektroforese i 90 minutter ved 100 V. proteinet ble deretter overført til nitrocellulosemembraner. Etter blokkering med ikke-fettholdig tørrmelk i 1 time, ble membranene inkubert over natten med de monoklonale antistoffene som er nevnt ovenfor. I tillegg ble integrin relatert signalering undersøkt ved hjelp av anti-integrin-bundet kinase (ILK, klon 3, fortynning 1:1000), anti-fokal adhesjonskinase (FAK, klon 77, fortynning 1:1000) og anti-fosfo-spesifikke FAK (pY397, klon 18, fortynning 1:1000) antistoffer (alle: BD Biosciences). HRP-konjugert geit-anti-mus IgG (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA; fortynning 1:5.000) tjente som det sekundære antistoff. Membranene ble inkubert med kort ECL deteksjonsreagensen (ECL ™, Amersham /GE Healthcare, München, Tyskland) for å visualisere proteinene og deretter analysert ved den Fusion FX7 systemet (Peqlab, Erlangen, Tyskland). β-aktin (1:1.000, Sigma, Taufenkirchen, Tyskland). fungert som den interne kontrollen
Gimp 2.8 programmet ble brukt til å utføre pikseltetthet analyse av proteinbåndene. Forholdet mellom protein intensitet /β-actin intensitet ble beregnet og uttrykt i prosent, er relatert til kontrollene er angitt som 100%.
siRNA slå ned studier
Tumorceller (3 x 10
5/6-brønn) ble transfektert med små interfererende RNA (siRNA) rettet mot integrin β1 (2 mikrometer, målsekvens: AAAAGTCTTGGAACAGATCTG, HS_ITGB1_5, Qiagen, Hilden) eller inte β4 (2 mikrometer, målsekvens: GTGGATGAGTTCCGGAATAAA; Hs_ITGB4_5 , Qiagen) med en siRNA /transfeksjon reagens (HiPerFect transfeksjon reagens; Qiagen) forhold på 01:06. Ikke-behandlede celler og celler behandlet med 5 nM kontroll siRNA (All stars negativ kontroll siRNA; Qiagen) fungerte som kontroller. Deretter ble tumor celle adhesjon til immobilisert kollagen samt tumorcellemigrering analysert som angitt ovenfor.
statistikker og
Alle forsøk ble utført 3-6 ganger. Statistisk signifikans ble bestemt ved Wilcoxon-Mann-Whitney-U-test. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant på ap verdi mindre enn 0,05.
Resultater
Amygdalin reduserer tumor endotelet og tumor matrise samhandling
Amygdalin betydelig redusert feste av alle tre blærekreft celle linjer til HUVEC når sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 1). Celleadhesjon av TCCSUP og RT112 ble sterkere endret av amygdalin enn den for UMUC-3-celler. Ingen forskjell mellom kortsiktig (24 h) og langsiktig (2 uker) amygdalin behandling var tydelig. Bindingskapasiteten av UMUC-3, TCCSUP og RT112 celler til immobilisert kollagen var også signifikant nedregulert, sammenlignet med kontroller (fig. 2). Utvidelse av behandlingsperioden fra 24 timer til 2 uker ikke ytterligere å øke sperrepotensialet for amygdalin. Ingen tegn på toksisitet på grunn av amygdalin ble gjenkjent av trypan blå eksklusjon test.
Tumorceller ble behandlet med 10 mg /ml amygdalin for enten 24 timer eller i 2 uker. Kontrollene mottok cellekulturmedium alene. 0,5 x 10
6 tumorceller /brønn ble tilsatt til HUVEC-monolag i 0,5, 1 og 2 timer. Bety adherente tumorceller fra fem områder ble beregnet og er vist som prosentandel av den 100% kontroll (prikket linje). En representant for seks eksperimenter er vist. * Angir signifikante forskjeller med kontroller.
Tumorceller ble behandlet med 10 mg /ml amygdalin for enten 24 timer eller i 2 uker. Celler som ikke var behandlet med amygdalin tjente som kontroller. 0,5 x 10
6 celler /brønn ble tilsatt til immobilisert kollagen i 60 minutter. Gjennomsnittlig antall adherente tumorceller fra fem felt ble beregnet. En representant for seks eksperimenter er vist. * Indikerer signifikant forskjell til kontrollene.
Amygdalin endrer vandringsmønstrene av tumorceller
utsette kreftceller for å amygdalin i 24 timer ikke endre sin vandrende aktivitet (fig. 3) . Imidlertid, etter en 2 ukers periode forbehandling antall UMUC-3 og RT112 celler under den Transwell kammeret membranen ble redusert, sammenlignet med de ubehandlede kontrollceller. Den inhiberende effekt in UMUC-3-celler var mer uttalt når amygdalin forble i cellekulturmediet i løpet av 20 timers inkubasjon vandrende ( «amygdalin B»), sammenlignet med amygdalin fritt medium ( «amygdalin A»). Denne forskjellen i 20 timer vandrende inkubasjon med eller uten amygdalin ble ikke påvist i de RT112 celler, hvor migreringen ble blokkert i en lignende grad. I motsetning til RT112 og UMUC-3-celler, en massiv økning i TCCSUP cellemigrasjon etter 2 uker amygdalin forbehandling ble notert.
Tumorceller behandlet med amygdalin i 24 timer eller i 2 uker ble sådd ut i det øvre kammer med en chemo-tiltrekningsmiddel i den nedre brønnen. Celler ble tillatt å gå i 20 timer, enten i amygdalin fritt medium (amygdalin-A) eller i amygdalin-inneholdende medium (amygdalin-B). Celler migrerer til den nedre membranoverflaten ble telt. Kontroller ble satt til 100%. En representant for seks eksperimenter er vist. * = Signifikant forskjell til kontrollene. # = Signifikant forskjell mellom amygdalin-A og amygdalin-B.
Amygdalin virker på inte α og β overflate uttrykk
inte subtyper α2, α3, α5, α6, β1 og β3 ble sterkt uttrykt på UMUC-3-celler, α4 var meget moderat uttrykt og α1 og β4 ble ikke uttrykt (fig. 4, til venstre). Amygdalin forhøyet α3 men redusert α5, α6, β1 og β3, uavhengig av eksponeringstiden. Ingen amygdalin indusert endring ble notert i α4 inte. Den α2 reseptoren ble nedregulert etter 24 timer, men oppregulert etter 2 uker amygdalin eksponering (fig. 4, til høyre). TCCSUP celler tydelig uttrykte α2, α3, α5, α6, β1 og p 4 inte medlemmer (fig. 5, til venstre). Den β3 typen var moderat til stede på celleoverflaten. Både a1 og a4-undertyper var ikke detekterbare. Amygdalin førte til en betydelig økning i integrin α5, α6, β1 og β4 på TCCSUP, hvorved 2 uker anvendelse induserte sterkere virkning enn den 24 timers inkubasjon (fig. 5, høyre). De a2 og P3 subtyper ble forsterket etter 2 uker, men ikke etter 24 timer. α3 ble ikke endret ved amygdalin. RT112 celler ble preget av en høy α2, α3, α6, β1 og β3 uttrykk nivå (fig. 6, til venstre). Inte α5 var moderat uttrykk, og β3 ble bare litt forhøyet løpet bakgrunn. Inte α1 og α4 ble ikke uttrykt på RT112 celler. Den inte α3, α6, β3 og β4 ble alle undertrykt av amygdalin (fig. 6, til høyre). Virkningene på α3 og β3 var ikke avhengig av hvorvidt amygdalin hadde vært i bruk i 24 timer eller 2 uker, mens α6 og β4 ble redusert i større grad etter 2 uker, sammenlignet med 24 timer. α2 utpreget økt etter 2 uker, men ikke etter 24 timer, og α5 og β1 forble uendret etter amygdalin.
Det venstre panelet viser inte uttrykk som histogram tomter med en stiplet linje indikerer bakgrunn fluorescens og en heltrukken linje angir spesifikk fluorescens i ubehandlede celler. Høyre panel viser inte subtype uttrykk etter 24 timer og 2 uker amygdalin eksponering, sammenlignet med kontroller satt til 100%. N.C. = Ikke beregnet. * Indikerer signifikant forskjell til kontrollene.
Det venstre panelet viser inte uttrykk som histogram tomter med en stiplet linje indikerer bakgrunn fluorescens og en heltrukken linje angir spesifikk fluorescens. Høyre panel viser inte subtype uttrykk etter 24 timer og 2 uker amygdalin eksponering, sammenlignet med kontroller satt til 100%. N.C. = Ikke beregnet. * Indikerer signifikant forskjell til kontrollene.
Det venstre panelet viser inte uttrykk som histogram tomter med en stiplet linje indikerer bakgrunn fluorescens og en heltrukken linje angir spesifikk fluorescens. Høyre panel viser inte subtype uttrykk etter 24 timer og 2 uker amygdalin eksponering, sammenlignet med kontroller satt til 100%. N.C. = Ikke beregnet. * Angir signifikante forskjeller med kontroller.
Modifikasjoner av integrin proteiner ved amygdalin
forandringer av integrin proteininnholdet indusert av amygdalin er vist i figur 7 (til venstre) og kvantifisering uttrykkes prosentvise forskjell mellom kontroll-tumorceller og tumorceller behandlet med amygdalin (høyre). I UMUC-3 celler, α6 og β3 ble undertrykt av både 24 timer og 2 uker amygdalin søknad, mens α2 og β1 var oppregulert. En amygdalin induserte økningen i α5 var tydelig, men denne effekten ble begrenset til 2 ukers amygdalin søknad. α3 integrin ble noe forbedret sammenlignet med kontroller etter 24 timer, men ikke etter 2 uker. Den integriner α1, α4 og β4 var ikke detekterbare ved western blotting. Den inte relatert signale proteiner ilk og pFAK ble redusert etter 2 uker amygdalin søknad. Lignende tiltak ble utøvd på TCCSUP celler, siden α2, α5 og β1 økt og β3 redusert etter amygdalin (2 uker 24 h). I motsetning til UMUC-3, ble α6 forbedret etter 24 timer, men redusert etter 2 uker. β4, ikke uttrykt i UMUC-3, ble nedregulert ved amygdalin (2 uker 24 timer). Den to ukers amygdalin søknad førte til et tap av pFAK og litt redusert ILK. Evaluering av RT112 avslørte økt α2 inte forårsaket av 24 timer eller to ukers amygdalin behandling. α6 og p 4 inte ble nedregulert med to ukers 24 timer. Det var også en liten økning av α3 etter 24 timer, men ikke etter 2 uker, et fenomen også sett i UMUC-3-celler. I motsetning til UMUC-3 og TCCSUP, den α5 subtype i RT112 var bare moderat påvises i kontrollcellene og ble ytterligere svekket etter behandling. Amygdalin i tillegg påvirket inte relatert signalering i RT112, dokumentert av redusert FAK og pFAK.
Controls forble ubehandlet. p-aktin fungerte som den interne kontrollen. Figuren viser en representant fra tre separate forsøk. n.d. indikerer «ikke oppdages». Kvantifisering av inte subtype uttrykk er avbildet til høyre. Pikseltetthet er gitt i prosent i forhold til kontrollene ikke er behandlet med amygdalin. * Angir betydelig økning både etter 24 timer og 2 uker amygdalin behandling, #indicates signifikant reduksjon både etter 24 timer og 2 uker amygdalin behandling, sammenlignet med kontroller.
β1 og β4 grin knockdown
Amygdalin tydelig endret inte uttrykk profilen til alle tre blære kreft cellelinjer. For å undersøke hvorvidt integrin modifikasjoner er relevante for metastatisk progresjon, slå ned studiene ble utført med p-integrin medlemmer tjener som representanter. Siden β1 (men ikke β3 og β4) ble sterkt uttrykt på styre UMUC-3 og TCCSUP og betydelig redusert ved amygdalin, ble β1 slått ned i disse celler og adhesjonsegenskaper og migreringsforsøk gjentatt (fig. 8). Den β1 integrin ble også sterkt uttrykt på RT112 men ikke modifisert ved amygdalin, i motsetning til ß4, som oppfylte begge kriterier, dvs. høy første uttrykk og betydelig modulering av amygdalin. Derfor ble β4 slått ned i RT112 cellelinje før underkastelse til adhesjon og migrasjon analysen (fig. 8, nederst til høyre). Tap av β1 ble ledsaget av en signifikant reduksjon i UMUC-3-binding (fig. 8) og migrasjon (fig. 9). På den annen side ble TCCSUP binding til kollagen utvidet (fig. 8), mens TCCSUP migrering ikke ble påvirket av β1 slå ned (fig. 9). Nedregulering av β4 inte i RT112 celler endret ikke vedheft egenskaper (fig. 8), men massivt blokkert migrasjon (fig. 9).
Kreftceller ble transfektert med integrin β1 eller p 4 siRNA. Ikke-behandlede celler (kontroll) og celler behandlet med egge siRNA (siRNA kontroll) fungerte som kontroller. Effekt av reseptor knockdown ble evaluert ved western-blotting (nederst til høyre). En representant for seks eksperimenter er vist. * Indikerer signifikant forskjell på kontrollene.
Kreftceller ble transfektert med integrin β1 eller p 4 siRNA eller egge siRNA (siRNA kontroll). Controls forble ubehandlet (kontroll). Verdier er vist som migrerte celler per 0,25 mm
2. En representant for seks eksperimenter er vist. * Angir signifikant forskjell til den ubehandlede kontroll. Sett inn hentet fra figur 8.
Diskusjoner
Siden svulst celle interaksjon med blodåreendotelets er nødvendig for tumorceller til å forlate blodet for etablering på sekundære områder, forstyrre denne prosessen er avgjørende for å hindre metastase. Denne rapporten viser at amygdalin vesentlig hemmer festing av blære kreft celler til endotelceller. Siden Amygdalin reduserer antall tumorceller, kan færre celler kontinuerlig under det endoteliale lag for å etablere kontakt med matriksproteiner å metastasere. Det neste trinn i metastaser omfatter kollagenmatriksen. Interaksjon av tumorceller med kollagen ikke bare må skje for å unnslippe den primære tumor, men også for å tillate invasiv spre seg i målorganet, når tumorcellene har gjennomløpt den endoteliale blodbarrieren [11]. I nærvær av amygdalin, tumorcellene som ble brukt i denne undersøkelsen mistet sin evne til å binde til immobilisert kollagen. Derfor kan amygdalin forsinke metastatisk progresjon ved å forhindre mekaniske kontakter av sirkulerende tumorceller i karveggen og den sub-endotel-matrise. Tumor spredning, men er ikke begrenset til binding. Cellene må også koble fra matrix proteiner til å invadere vev. Amygdalin påvirket migrasjon kapasitet av alle blærekreftcellelinjer etter 2 uker, men ikke etter 24 timer, noe som indikerer at langvarig behandling kan være nødvendig å endre svulst cellemotilitet.
Amygdalin handling på forskjellige tumorcelle linjene var ikke identiske. Migrasjon av UMUC-3 og RT112 ble blokkert, mens antall trekkende TCCSUP celler økt med amygdalin. Dette betyr at selv om Amygdalin minsker feste hastighet i alle kreftcellelinjer, er det en risiko for at kronisk amygdalin eksponering til noen få gjenværende celler av en spesiell svulst subtype som TCCSUP kan resultere i økt aktivitet lokomotiv. Enten på grunn av en ervervet eller iboende resistens, eller på grunn av utviklingen av uønskede tilbakekoplingssløyfer er fortsatt uklart, men dette indikerer at ikke alle pasienter med blærekreft kan tjene like godt fra amygdalin. I tråd med dette spekulasjon, har det nylig blitt vist at resistensutvikling er ledsaget av en funksjonsbryter av integrin-reseptorer, kjøring tumorcellene til høy motilitet [12].
Chen et al. nylig spekulert i at kreftceller med høy overføringshastighet, er mye mer sannsynlig å metastasere enn de med lav overføringshastighet, [13]. Dette kunne imidlertid ikke bli bekreftet ved en undersøkelse i hvilken antallet migrere tumorceller og avstanden og hastigheten på migrasjonen ikke korrelerer med den maligne potensial av tumorceller [14]. Snarere retning av cellemotilitet indikerte malignitetspotensiale av kreftceller [14]. For å få ytterligere forståelse, har dyrestudier nettopp blitt iverksatt for å utforske in vivo tumorprogresjon i henhold amygdalin behandling.
Rollen griner i forming celle-celle og celle-matrise obligasjoner som er nødvendige for adhesjon, ekstravasasjon og migrasjon har vært anbrudd [15], [16], der β1 inte subenheten ble vist seg å spille en sentral rolle i blærekreft cellelinje T24. Imidlertid er ikke alle blærekreftcellelinjer preget av den samme inte mønster. I den foreliggende undersøkelse amygdalin modifisert adhesjon og migrasjon og endres integrin ekspresjonsprofiler forskjellig i forskjellige cellelinjer. Inte β4 ble ikke uttrykt på UMUC-3, men på RT112 og TCCSUP, mens β3 var bare marginalt påviselig på RT112 men sterkt synlig i UMUC-3 og TCCSUP celler. En undersøkelse involverer påvirkning av valproinsyre på blæren celle adhesjon til kollagen [17], har også vist modifikasjon av integrin ekspresjonsprofilen avhengig av cellelinjen som anvendes. Andre forskere har rapportert ulike integrin underfamilier i UMUC, T24, J82, RT-4, 253J og Hu456 celler [18], [19]. Hver cellelinje kan derfor ha en karakteristisk reseptor satt og medikamentbehandling kan påvirke integrinunderfamilier på en annen måte.
Undersøkelser av prostatakreftceller har vist at den første integrin profilen til en spesiell svulst klone kan bestemme dens molekyl reaksjon medikamentbehandling [20]. Faktisk, amygdalin påvirket integrin sammensetningen av de evaluerte blæretumorceller på en annen måte. I UMUC-3 celler β1 og β3 overflate uttrykk ble svekket av amygdalin, men forbedret i TCCSUP celler. I RT112 celler β4 stedet for β1 ble endret av amygdalin. Intracellulært og membranintegrin-nivåer ble også på en annen måte påvirket av amygdalin i UMUC-3 og TCCSUP celler. I UMUC-3-celler intracellulær β1 integrin ble forhøyet og overflate-ekspresjon ble redusert, noe som indikerer at amygdalin induserer translokasjon av β1 integrin vekk fra overflaten membranen. I TCCSUP celler ß1 integrin-ekspresjon ble øket både intracellulært og på overflatemembranen. Amygdalin induserte en reduksjon i intracellulært β3 integrin i begge UMUC-3 og TCCSUP celler. Surface uttrykk, var imidlertid ikke det samme, med UMUC-3 celler viser en amygdalin indusert reduksjon i β3 grin og TCCSUP celler viser en økning. Den største translokasjon i TCCSUP celler fra cytoplasma til overflatemembranen synes derfor å være rettet mot β3 integrin.
Fjerning av visse integrin-subtyper fra celleoverflaten er ikke den eneste mekanisme for regulering av kreft celleadhesjon. Integrin handel mellom intracellulære og celleoverflaten har vist seg å være en nødvendig forutsetning for å reseptor fjerning ved bunnen av cellen fremspring. Resirkulering av integrin tilbake til den ledende cellekanten støtter adhesjon [21]. En preklinisk studie på nyrekreftceller har vist at både inte reseptor opp- og nedregulering kan kjøre kreftceller mot malignitet. Derfor terapeutisk intervensjon rettet mot «re-translocating» visse integrin molekyler kan gi en mulighet til å forebygge kreft [22].
Relevansen av inte for adhesjon og migrasjon ble demonstrert av knock-down studier på beta inte med enten høy første overflate uttrykk eller sterk amygdalin indusert endring. Disse kriteriene ble oppfylt for β1 i UMUC-3 og TCCSUP celler og for β4 i RT112 celler. Undertrykkelse av β1 korrelert godt med redusert binding og migrasjon aktivitet av UMUC-tre, som er i samsvar til in vitro-studier med T24 og 5637 celler [23], [24]. Derfor kan tap av β1 være en mekanisme der amygdalin bremser UMUC-tre tumor spredning. TCCSUP celler, men oppførte seg annerledes i henhold β1 blokade. Binding hendelser til kollagen faktisk økte, noe som indikerer at denne reseptoren i disse celler blokkene celle-celle eller celle-matriks-kontakter. Differensialintegrin ledet klebe oppførsel av forskjellige tumorunderlinjer tidligere er blitt observert. Blokkering av α3 subenheten er blitt vist å hemme HCV29 blærekreft cellebinding til matriksproteiner laminin og fibronektin, men har en motsatt virkning på T24 og Hu456 celleadhesjon.
