Abstract
Photoimmunotherapy (PIT) er en ny kreftbehandling som kombinerer spesifisiteten av antistoffer for målretting tumorer med toksisitet indusert av fotosensitisere etter eksponering for nær infrarødt (NIR) lys. Vi utførte PIT i en modell av disseminert magekreft peritoneal karsinomatose og overvåkes effekt med
in vivo
GFP fluorescens bildebehandling.
In vitro
og
in vivo
eksperimenter ble utført med en HER2-uttrykkende, GFP-uttrykkende, magekreft cellelinje (N87-GFP). Et konjugat bestående av en fotosensibilisator, IR-700, konjugert til trastuzumab (tra-IR700), etterfulgt av NIR-lys ble brukt til PIT.
In vitro
PIT ble evaluert ved å måle cytotoksisitet med døde flekker og en nedgang i fluorescens GFP.
In vivo
PIT ble evaluert i en disseminert peritoneal karsinomatose modell og en flanke xenograft hjelp tumorvolummålinger og GFP fluorescens intensitet.
In vivo
anti-tumor effekter av PIT ble bekreftet av betydelige reduksjoner i tumorvolumet (på dag 15, p 0,0001 vs kontroll) og GFP fluorescens intensitet (flanke modell: på dag tre, PIT behandlet vs. kontroll p 0,01 og peritoneal disseminert modell: på dag 3 PIT behandlet vs. kontroll, p 0,05). Cytotoksiske effektene
in vitro
ble vist å være avhengig av lysdose og forårsaket nekrotisk cellebrudd fører til GFP frigivelse og en nedgang i fluorescens-intensitet
in vitro.
Således tap av GFP fluorescens servert som en nyttig biomarkør celle nekrose etter PIT
Citation. Sato K, Choyke PL, Kobayashi H (2014) Photoimmunotherapy av magekreft peritoneal karsinomatose i en musemodell. PLoS ONE 9 (11): e113276. doi: 10,1371 /journal.pone.0113276
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, USA
mottatt: 02.07.2014; Godkjent: 21 oktober 2014; Publisert: 17.11.2014
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH egenutført program og JSP Stipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Gastric carcinoma fører til mer enn 740.000 kreftrelaterte dødsfall per år over hele verden, spesielt i Asia [1] – [3]. Flertallet av magekreftpasienter til stede med lokalavansert, residiverende eller metastatisk sykdom utelukker kurativ kirurgi som er mest styrt av ikke-kurativ terapi [1]. Peritoneal karsinomatose og levermetastaser er vanlige livstruende manifestasjoner av avansert stadium magekreft [1], [4]. Peritoneal karsinomatose forekommer også i eggstokkene, appendiceal, tykktarm, bukspyttkjertel og mage kreft. Prognosen er universelt dårlig og lokale behandlinger er alltid mislykket med høye gjentakelse priser og sykelighet forbundet med ascites og tarmobstruksjon. Systemisk terapi er også vanligvis mislykket. Således er nye fremgangsmåter for behandling peritoneal karsinomatose nødvendig.
Photoimmunotherapy (PIT) er et nytt mål-celle spesifikk kreftbehandling som anvender et antistoff fotosensibilisator konjugat (APSC) etterfulgt av nær infrarød (NIR) lys. En APSC består av en kreftcelle-spesifikt monoklonalt antistoff (mAb) og en fotosensibilisator, IR700, som er en silika-ftalocyanin-derivat som er kovalent konjugert til antistoffet. Den APSC binder målmolekylene på cellemembranen og induserer deretter nesten øyeblikkelig cellenekrose etter eksponering for NIR-lys ved 690 nm.
In vitro-studier har vist
PIT å være meget celle-spesifikke, derfor, ikke-uttrykkende celler i umiddelbar nærhet av målceller viser ingen toksiske virkninger [5]. Celler behandlet med PIT gjennomgår hurtig volumøkning som fører til brudd av cellemembranen, ekstrudering av celleinnholdet inn i det ekstracellulære rom, og irreversibel nekrose [6] – [8]. Våre resultater og andre viser at cytotoksisiteten indusert av PIT ikke er helt avhengig av reaktive oksygenarter eller eksistensen av singlet oksygen quenchere [9]. Videre cytotoksisitet indusert av PIT er først og fremst innenfor cellemembranen heller i mitokondriene som oppstår med PDT.
PIT resulterer i rask cellulær nekrose, kan det totale volumet av tumoren ikke forandres på flere dager. Dette er fordi det tar minst flere dager for makrofager å gå inn, bearbeide og la den behandlede tumor. Derfor er nye fremgangsmåter, utover størrelsesmålinger, er nødvendig for å overvåke effekten av PIT. Fluorescens proteiner (FPS) blir ofte brukt for å visualisere cellulære prosesser [10], [11]. Mens de fleste apoptotisk celledød resulterer i konservering av cellemembranen og fastholdelse av FP som gjør fluorescens ufølsom til celledød [12], [13], i PIT, det plutselige brudd av cellemembraner resulterer i ekstrudering av cytoplasmatisk s og derfor en forholdsvis rask utlesning av celledød. En fordel med FPS for
in vivo avbildning
er at de ikke krever ytre injeksjoner av forbindelser (som luciferin i tilfelle av Bioluminescens) og kan overvåkes i sanntid, [14] – [18]. Siden de krever genet transfeksjon, ville de sannsynligvis bare være nyttig i prekliniske studier.
I denne studien undersøkte vi effekten av PIT i en musemodell av disseminert peritoneal magekreft ved hjelp av in vivo GFP fluorescens bildebehandling til overvåke respons.
Materialer og metoder
Reagenser
Vann løselig, silisium-phthalocyanine derivat, IRDye 700DX NHS ester og IRDye 800 CW NHS ester ble hentet fra LI-COR Biovitenskap (Lincoln, NE, USA). Panitumumab, et fullt humanisert IgG
2 mAb rettet mot EGFR, ble kjøpt fra Amgen (Thousand Oaks, California, USA). Trastuzumab, 95% humanisert IgG
1 mAb rettet mot HER2, ble kjøpt fra Genentech (South San Francisco, CA, USA). Alle andre kjemikalier var av reagenskvalitet.
Syntese av IR700-konjugert trastuzumab eller panitumumab, og IR800-konjugert trastuzumab
Bøyning av fargestoffer med mAbs ble utført i henhold til en tidligere rapport [19]. I korte trekk, panitumumab eller trastuzumab (1 mg, 6,8 nmol) ble inkubert med IR700 NHS ester (60,2 mikrogram, 30,8 nmol) eller IRDye 800 CW NHS ester (35,9 mikrogram, 30,8 nmol) i 0,1 mol /L Na
2HPO
4 (pH 8,6) ved romtemperatur i 1 time. Blandingen ble renset med en Sephadex G50-kolonne (PD-10, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt med Coomassie Plus protein assay kit (Thermo Fisher Scientific Inc, Rockford, IL, USA) ved å måle absorpsjon ved 595 nm med spektroskopi (8453 verdisystem, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Konsentrasjonen av IR700 eller IR800 ble målt henholdsvis ved absorpsjon ved 689 nm eller 774 nm med spektroskopi for å bekrefte antall fluoroformolekyler konjugert til hver mAb. Syntesen ble regulert slik at et gjennomsnitt av fire IR700-molekyler og to IR800 molekyler ble bundet til et enkelt antistoff. Vi utførte SDS-PAGE som en kvalitetskontroll for hver konjugat som tidligere rapportert [19]. Vi forkorter IR700 konjugert til trastuzumab som tra-IR700, til panitumumab som pan-IR700 og IR800 konjugert til trastuzumab som tra-IR800.
Cell kultur
N87-GFP celler som stabilt uttrykker GFP ble kjøpt fra anti kreft (San Diego, California, USA). Høy GFP-ekspresjon ble bekreftet i fravær av et seleksjonsmiddel med 10 passasjer. For å evaluere spesifikk celledreping av PIT, ble 3T3-celler som stabilt uttrykker DsRed (3T3 /DsRed) anvendt som en negativ kontroll [5]. Celler ble dyrket i RPMI 1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin (Life Technologies) i vevskulturflasker i en fuktet inkubator ved 37 ° C i en atmosfære av 95 % luft og 5% karbondioksid
fluorescensmikroskopi
for å påvise antigen-spesifikk lokalisering av IR700 konjugater og endring i cellen morfologi etter PIT, ble fluorescens mikroskopi utføres (IX61 eller IX81.; Olympus America, Melville, NY, USA). Ti tusen celler ble sådd på deksel-glassbunn retter og inkubert i 24 timer. Tra-IR700 ble deretter tilsatt til kulturmediet (fenol rød fri) ved 10 ug /ml og inkubert ved 37 ° C i 6 timer. Cellene ble deretter vasket med PBS; Propidiumjodid (PI) (1:2000) eller Cytox Blå (1:500) (Life Technologies) ble lagt til i media 30 min før PIT å oppdage døde celler. Cellene ble deretter eksponert for NIR-lys og serie bilder ble oppnådd. En dag etter PIT, ble cellene vasket og inkubert med nytt medium etter PIT (0,5 J /cm
2) og PI ble igjen tilsatt. For å sikre at den samme regionen ble fotografert merking ble gjort på hver kultur tallerken for å indikere hvor bilde ble kjøpt. Filteret ble satt til å oppdage IR700 fluorescens med en 590-650 nm eksitasjon filter, og en 665-740 nm bånd passere utslipp filter. Analyse av bildene ble utført med ImageJ programvare (https://rsb.info.nih.gov/ij/).
flowcytometrisystemer
fluorescens fra celler etter inkubasjon med pan-IR700 eller tra-IR700 ble målt ved hjelp av et flowcytometer (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og Cellquest programvare (BD Biosciences). -Celler (1 x 10
5) ble inkubert med hver konjugat i 6 timer ved 37 ° C. For å validere den spesifikke binding av konjugert antistoff, ble overskudd av antistoff (50 ug) som brukes til å blokkere 0,5 ug av fargestoff-antistoff-konjugater [8].
In vitro PIT
Ett hundre tusen celler ble sådd på 24 brønners plater og inkubert i 24 timer. Kulturmediet ble erstattet med friskt kulturmedium som inneholdt 10 ug /ml av tra-IR700 og cellene ble inkubert i 6 timer ved 37 ° C. Etter vasking med PBS, ble fenolrød fritt kulturmedium tilsatt. Deretter ble cellene bestrålt med NIR laserlys ved 685-695 nm bølgelengde (BWF5-690-8-600-0.37; B . W TEK INC, Newark, DE, USA). Selve effekttetthet mW /cm
2 ble målt med en optisk kraftmåler (PM 100, Thorlabs, Newton, NJ, USA).
Cvtotoksisitetsmålinq
De cytotoksiske effektene av PIT med tra-IR700 ble bestemt ved flowcytometrisk PI flekker, som oppdager kompromitterte cellemembraner. For flowcytometrisk analyse, ble cellene trypsinert 1 time etter behandling og vasket med PBS. PI ble tilsatt i cellesuspensjonen (slutt 2 ug /ml) og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter, fulgt av strømningscytometri.
Estimering av GFP fluorescensintensitet in vitro
Ett hundre tusen cellene ble sådd på deksel-glassbunn retter og inkubert i 12 timer. Tra-IR700 ble deretter tilsatt til kulturmediet (fenol rød fri) ved 10 ug /ml og inkubert ved 37 ° C i 6 timer. Cellene ble vasket med PBS og erstattes med en ny, fenolrødt fritt kulturmedium og undersiden av dekkglasset ble merket (for å bestemme posisjonen for observasjon). Etter PIT ble cellene på nytt inkubert i 1 dag. En dag etter PIT, ble cellene igjen observert. GFP intensitet ble evaluert med totale piksler med samme terskel i samme felt [20]. Analyse av bildene ble utført med ImageJ programvare (https://rsb.info.nih.gov/ij/).
fluorescens fra behandlede celler ble også målt ved hjelp av et flowcytometer (FACS Calibur).
Animal og tumormodeller
Alle
in vivo
prosedyrer ble utført i samsvar med guide for omsorg og bruk av forsøksdyr Resources (1996), US National Research Council, og godkjent av NIH Animal Care og bruk komité. Seks til åtte uker gamle kvinnelige homozygote atymiske nakne mus ble kjøpt fra Charles River (NCI-Frederick). For å evaluere bare den direkte tumorcelledrepende virkning av
in vivo
PIT, immunkompromitterte nakne mus ble anvendt. I løpet av prosedyrer, ble musene bedøvet med isofluran. Ti millioner N87-GFP-celler ble injisert subkutant i den høyre dorsum av musene. For å bestemme tumorvolum, ble den største langsgående diameter (lengde) og den største transversale diameter (bredde) målt med en ytre caliper. Tumorvolumer basert på kalibermålinger ble beregnet ved den følgende formel; tumorvolumet = lengde × bredde
2 × 0,5. Tumorer nådde ca 100 mm
3 volumdeler ble valgt for studien. For å måle GFP fluorescens etter PIT ble ti millioner N87-GFP celler subkutant injisert i begge dorsi av mus. For disseminert peritoneal kreft musemodell, ble femti millioner N87-GFP celler med PBS (totalt 300 mL) sprøytes inn i bukhulen.
In vivo fluorescens bildebehandling
In vivo
fluorescens bilder ble oppnådd med en Pearl Imager (LI-COR Bioscience) for å påvise IR700 /IR800 fluorescens og Maestro Imager (SFI, Woburn, MA, USA) for GFP. For GFP, ble et båndpassfilter 445 til 490 nm (eksitasjon) og en dyp blå-pass filter spissen 515 nm (emisjon) anvendt. Den fleksibel utslipp filter ble automatisk trappet i trinn på 10 nm 500-600 nm for de grønne filtersett på konstant eksponering (500 millisekunder). De spektrale fluorescens bilder består av autofluorescens spektra og spektra fra GFP (N87-GFP tumor), som ble deretter ublandet, basert på den karakteristiske spektrale mønster av GFP, ved hjelp av Maestro programvare (CRi). Regioner av interesse (Rois) ble manuelt trukket enten på flanken svulst eller over mageregionen som passer til modellen og fluorescens intensitet ble målt [19].
Karakterisering av disseminert peritoneal musemodell
Mus med enten disseminert peritoneal kreft (6 uker etter celle implantasjon) eller flanke svulster (7 dager etter celle implantasjon) ble injisert intravenøst med 100 mikrogram av tra-IR700 og tra-IR800. En dag etter injeksjon, ble seriebilder utført med en Pearl Imager til å oppdage IR700 /IR800 fluorescens, og Maestro for GFP. Hvitt lys bilder av mus ble oppnådd med en iphone5 (Apple Inc., Cupertino, CA, USA).
In vivo PIT
For å evaluere effekten av PIT i flanken modell , N87-GFP tumor-bærende mus ble randomisert inn i 4 grupper på minst 10 dyr per gruppe som følger: (1) ingen behandling (kontroll); (2) bare NIR lyseksponering på 50 J /cm
2 på dag 1 og 100 J /cm
2 på dag 2; (3) 100 ug tra-IR700 i.v., ingen NIR lyseksponering; (4) 100 mikrogram av tra-IR700 intravenøst, ble NIR lys administrert på 50 J /cm
2 på dag 1 etter injeksjon og 100 J /cm
2 på dag 2 etter injeksjon. Disse betingelsene ble påført hver uke i opptil 3 uker. Musene ble overvåket daglig, og fluorescens bilder ble oppnådd som begynner en dag før PIT, og tumorvolum ble målt tre ganger i uken inntil tumoren nådde diameter 2 cm, hvoretter musene ble avlivet med karbondioksid. For fluorescensavbildning, ble mus injisert med 100 ug av tra-IR700 eller bestrålt som følger: (1) NIR-lys ble administrert ved 50 J /cm
2 på dag 1 etter injeksjon og 100 J /cm
2 på dag 2 til høyre tumor (2) ingen NIR-lys ble administrert til venstre svulst som tjente som kontroll. Controls inkludert (1) bare NIR lyseksponering på 50 J /cm
2 på dag 1 og 100 J /cm
2 på dag 2 til høyre svulst; (2) ingen behandling for venstre svulst
For å evaluere disseminert peritoneal kreft, ble musene randomisert inn i 4 grupper på 5 dyr per gruppe for følgende behandlinger:. (1) ingen behandling (kontroll); (2) bare NIR lyseksponering på 50 J /cm
2 på dag 1 og 100 J /cm
2 på dag 2; (3) 100 ug tra-IR700 i.v., ingen NIR lyseksponering; (4) 100 mikrogram av tra-IR700 iv, ble NIR lys administrert på 50 J /cm
2 på dag 1 og 100 J /cm
2 på dag 2 etter injeksjon.
Statistisk analyse
data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra et minimum på fire eksperimenter, med mindre annet er angitt. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av et statistikkprogram (GraphPad Prism, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). For multiple sammenligninger, ble en en-veis analyse av varians (ANOVA) med etter test (Kruskal-Wallis test med post-test) og Tukey test anvendt. Den kumulative sannsynlighet for overlevelse, bestemt heri som tumordiameter ikke å nå 2 cm, ble beregnet i hver gruppe ved anvendelse av Kaplan-Meier-overlevelseskurve analyse, og resultatene ble sammenlignet med den log-rank test og Wilcoxon test. Elevens
t
test ble også brukt til å sammenligne de to
in vitro
studie; p 0,05 ble ansett for å indikere en statistisk signifikant forskjell
Resultater
Bekreftelse på uttrykk profilen til N87-GFP celler som et mål for PIT
Vi undersøkte fluorescens signaler. av pan-IR700 og tra-IR700 bundet til N87-GFP celler ved FACS. Etter seks timers inkubasjon med enten pan-IR700 eller tra-IR700, N87-GFP celler konsekvent viste høyere lysstyrke med tra-IR700 enn pan-IR700 (Fig. 1a). Disse signaler ble nesten fullstendig blokkert ved tilsetning av overskudd av trastuzumab eller panitumumabs, noe som tyder spesifikk binding og bekrefter høyere ekspresjon av HER2 enn EGFR [21]. Disse data antydet at HER2 var å foretrekke mål for PIT i N87-GFP celler på grunn av sin høyere uttrykk.
(A) Uttrykk for HER1 og HER2 i N87-GFP celler ble undersøkt med FACS. HER2 ble overexpressed mer enn HER1. Spesifikk binding ble demonstrert ved antistoffblokkering. (B) N87-GFP-celler ble inkubert med tra-IR700 i 6 timer og observert ved mikroskopi (før og etter bestråling av NIR-lys; 2 J /cm
2). Necrotic celledød ble observert ved eksitasjon med NIR lys (etter 30 min). Bar = 25 mikrometer. PI farging viste membranskade. (N = 4, * p 0,001, sammenlignet med ubehandlet kontroll, Student t-test) ble (C) membranskade indusert ved PIT målt med den døde celletall ved bruk av PI-farging, noe som økte på en måte avhengig av lysdose. (D) N87-GFP celler ble inkubert med tra-IR700 i 6 timer og bestrålt med NIR-lys (0,5 J /cm
2). GFP-fluorescens intensitet gått ned i døde celler, men var uendret i levende celler på en dag etter PIT (*). Bar = 200 mikrometer. Den svarte linje på høyre øvre hjørne var den markør for å bestemme posisjonen for observasjon. (E) minskende GFP-fluorescens intensitet på en dag etter PIT forekom på en måte som er avhengig av lys dose (total piksel av GFP fluorescens i det samme) (n = 12 felt) (** P 0,0001, sammenlignet med ubehandlet kontroll, student t-test). (F) minskende GFP fluorescensintensiteten indusert av PIT, målt ved FACS, bekrefter en NIR-lys doseavhengighet. (N = 4, *** P 0,0001, kontra ubehandlet kontroll, Student t-test)
Mikroskopi av in vitro PIT
Serie fluorescens mikroskopi av N87-GFP celler. ble utført før og etter PIT. Etter eksponering for NIR-lys (2 J /cm
2) cellulær hevelse, bleb dannelse og brudd i lysosomet ble observert, noe som resulterer i ekstrudering av cytoplasma ekstracellulært (Fig. 1B). PI farging viste akutt cytotoksiske membranskade forårsaket av PIT. De fleste av disse celleforandringer ble observert i løpet av 30 min av lyseksponering (Hjelpemiddel Informasjon video S1 og S2). Ingen signifikante endringer ble påvist i EGFR-negative 3T3 celler bestrålt med NIR lys, noe som tyder PIT indusert ingen skade i ikke-målceller (Fig. S1).
Evaluering av in vitro PIT effekt
for å kvantifisere effekten av
in vitro
PIT, utførte vi en cytotoksisitet assay basert på inkorporering av PI, som viste at celledød økte med økende lysdose (fig. 1C). Ingen signifikant cytotoksisitet ble påvist med NIR lyseksponering eller tra-IR700 alene.
Evaluering med GFP fluorescens in vitro etter PIT
En dag etter eksponering for NIR lys på 0,5 J /cm
2, ca. 50% av cellene viste akutt cytotoksisitet (fig. 1C), og GFP fluorescensintensitet ble sterkt redusert i døde celler (farget positivt med PI), mens GFP fluorescens ble bevart i overlevende celler (fig. 1D). Disse studiene tyder på at GFP ble ekstrudert fra cellen etter at membranen sprekker. For å undersøke endringen i GFP fluorescens sammenlignet vi den totale GFP piksler i det samme feltet før og en dag etter PIT (fig. S2). GFP fluorescens ratio redusert direkte med lys dose, mens ingen nedgang ble registrert med NIR lyseksponering eller tra-IR700 alene (Fig. 1E). Disse resultatene ble bekreftet ved FACS-analyse (fig. 1F og fig. S3), og antyder at PIT fører til en reduksjon av GFP fluorescens følgende nekrotisk celledød på en dag etter PIT på en måte som er avhengig av lysdose.
in vivo PIT reduserer tumorvolumet i flanken xenograft modell
Deretter undersøkte vi effekten av PIT
in vivo
på flanken svulst bærende mus (fig. 2A). PIT induserte signifikant reduksjon i tumorvolum (n = 10 i hver gruppe, * p = 0,0456 0,05, Tukey test). Fire mus av ti i PIT gruppe ble fullstendig kurert av behandlingen (Fig. 2B). Overlevelse ble betydelig forlenget i PIT gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (n = 10 i hver gruppe, ** p 0,0001, lang-rank test og Wilcoxon-test) (figur 2C.). Disse dataene antyder at PIT medført betydelig tumorreduksjon og forlenget overlevelse
in vivo
.
(A) PIT regime. (B) PIT fører til N87-GFP flanke tumorreduksjon volum (n = 10 mus i hver behandlingsgruppe; * p = 0,0456 og 0,05, sammenlignet med APSC), Tukey test med ANOVA). Behandling er indikert under grafen. (C) Gjentatt PIT fører til forlenget overlevelse i N87-GFP tumorbærende mus (n = 10 mus i hver behandlingsgruppe, ** P 0,0001), Long-rank test og Wilcoxon test). Komplett tumor drapet ble oppnådd for 4 mus av 10 i PIT gruppen etter re-behandling.
GFP fluorescens bildebehandling etter In vivo PIT i flanken xenograft modell
For å overvåke
in vivo
PIT, real-time GFP bildebehandling ble utført på mus med N87-GFP bilateral flanke tumorer (fig. 3A). GFP fluorescens demonstrerte tumorbelastning og responsen på PIT. GFP fluorescens ble korrelert med IR700 fluorescens, som raskt ble redusert etter PIT (Fig. 3C). Total fluorescens imaging (TFI) av GFP i ubehandlede tumorer (kontroll) og i tumorer som fikk lys bare økt på grunn av tumorvekst. I tumorer behandlet med PIT, TFI av GFP gradvis redusert i den behandlede tumor, mens den motsatte tumor i den samme mus (iv bare, ikke lys) viste økt GFP fluorescens (Fig. 3B).
(A) PIT regime. Fluorescens bilder ble oppnådd ved hvert tidspunkt som angitt. (B)
In vivo GFP
fluorescens sanntid avbildning av bilateral flanke svulst bærende mus som svar på PIT. Svulsten behandlet av PIT viste avtagende GFP fluorescens etter PIT. (C) Kvantitativ analyse av GFP fluorescensintensiteter (total intensitet /tumor) i N87-GFP tumorbærende mus viste signifikant redusert fluorescens mellom kontrollgruppen og den PIT gruppen (n = 5 mus i hver gruppe, (* p = 0,0118 0,05, vs. kontroll) (* p = 0,0016 0,01, kontra NIR lys) (* p = 0,0012 0,01, vs. APSC) (** p = 0,0010 0,01, vs. kontroll) (** p = 0,0003 0,001, kontra NIR lys) (** p = 0,0003 0,001, vs. APSC) (*** p = 0,0049 0,01, vs. kontroll) (*** p = 0,0039 0,01, kontra NIR-lys) (*** p = 0,0012. 0,01, kontra APSC), Tukey test med ANOVA)
Kvantifisering av total GFP fluorescens intensitet viste at det var en signifikant reduksjon etter PIT (n = 5 mus i hver gruppe, * p = 0,0118 0,05, ** p = 0,0010 0,01, *** p = 0,0049 0,01, Tukey test med ANOVA) (fig. 3C) . På grunn av svulst ettervekst, økt GFP forholdet igjen fra dag 4 etter PIT, selv om det var lavere enn andre kontrollgrupper. Sanntids GFP fluorescens bildebehandling og dens kvantifisering aktivert sanntid sammenligning av gruppene og viste en sterk sammenheng mellom høyere GFP fluorescens og tumorprogresjon i hver gruppe.
For å bekrefte denne effekten,
ex vivo
analyse ble utført (fig. 4A). PIT virkning ble bekreftet med en nedgang i fluorescens IR700 (Fig. 4B). Under denne tilstanden, GFP intensiteten av
ex vivo
svulster redusert etter PIT (Fig. 4B). Disse data tyder på at sanntids GFP levende avbildning er konsistent med
ex vivo
imaging.
(A) PIT regime. Fluorescens bilder av
ex vivo
tumorer ble oppnådd ved hvert tidspunkt som angitt. (B)
Ex vivo
fluorescens avbildning av N87-GFP svulst i respons til PIT. Fluorescens endringer blir sett med både GFP og IR700 fluorescens som svar på PIT. (C) Fluorescens bilder ble oppnådd ved hvert tidspunkt som angitt. (D)
In vivo
fluorescens sanntid avbildning av bilateral flanke svulst bærende mus som svar på gjentatte PIT. GFP-fluorescensintensitet av tumoren ble nesten eliminert etter den andre PIT.
Når PIT ble gjentatt ukentlig, GFP fluorescens aktivitet etterhvert forsvant (fig. 4C og D), noe som indikerer fullstendig dreping av tumoren.
Karakterisering av disseminert peritoneal modell med fluorescens bildebehandling
for å bestemme den naturlige historien til disseminert peritoneal modellen, ble serie fluorescens bildebehandling utført. De implanterte tumorer viste høy fluorescens-signal med IR700, IR800, og GFP, som alle samlokalisert med hverandre (IR800 ble anvendt for å unngå tarm autofluorescens) (fig. 5). Disse dataene tyder på at denne modellen av disseminert peritoneal kreft kan overvåkes i levende mus ved hjelp av GFP fluorescens.
In vivo
GFP fluorescens avbildning av en N87-GFP flanke tumor og spres peritoneal modell. Colocalization av tra-IR700 og tra-IR800 ble bekreftet i peritoneal disseminert svulst med fluorescens bildebehandling. Intravenøs injeksjon av midlet kan nå spres svulster i bukhulen. For å unngå auto-fluorescens i tarmen, ble tra-IR800 brukt samt tra-IR700.
GFP fluorescens bildebehandling etter In vivo PIT i disseminert peritoneal modell
Sanntids GFP fluorescensavbildning ble utført på disseminert peritoneal modellen før og etter PIT (fig. 6A). IR700 fluorescens ble redusert etter PIT (fig. S4). GFP TFI økt gradvis i de ikke-PIT grupper på grunn av tumorvekst. I PIT behandlede gruppe, redusert GFP TFI fra 1 dag til 3 dager etter PIT (fig. 6B). Kvantifisering av total GFP fluorescensintensitet viste en signifikant reduksjon etter PIT (n = 5 mus i hver gruppe, * p = 0,0295 0,05, ** p = 0,0355 0,05, Kruskal-Wallis test med post-test) (fig. 6C). På grunn av den tumor re-vekst, økte GFP forholdet igjen fra 4 over PIT, selv om det opprettholdes lavere enn andre grupper, som observert med flanken tumormodell. Dermed PIT forårsaket betydelig målrettet svulst drepende effekt i både flanke og disseminert peritoneal tumormodeller, og dette kan bli overvåket med GFP TFI.
(A) PIT regime. Sanntids avbildning GFP fluorescens ble oppnådd ved hvert tidspunkt indikert. (B)
In vivo
sanntid fluorescens bildebehandling i respons til PIT. (C) Kvantitativ analyse av GFP fluorescensintensiteter viste signifikant reduksjon av dag 3 etter PIT mellom kontrollgruppen og PIT gruppe (n = 5 mus i hver gruppe, (* p = 0,0295 0,05 vs. NIR-lys) (** p = 0,0489 0,05 vs. kontroll) (** p = 0,0355. 0,05 vs. APSC), Kruskal-Wallis test med post-test)
Diskusjoner
Denne studien viser at effekten av PIT kan overvåkes med GFP fluorescens bildebehandling. I motsetning til apoptose [12], [13], hvor GFP og beslektede fluoriserende proteiner blir lysere på grunn av den avtagende cytoplasmiske volum, i løpet av nekrotisk celledød med PIT, membranskade som fører til frigjøring av cytoplasmiske innhold, inkludert GFP. Denne unike egenskap av GFP og relaterte fluorescerende proteiner gjør dem nyttige biomarkører for PIT.
In vivo
GFP fluorescens bildebehandling gjør hele prosessen med tumordannelse, behandling, regresjon, metastaser eller residiv til påvises i det samme dyr uten invasive prosedyrer [10], [11]. Ved anvendelse av celler som uttrykker GFP cytoplasmiske, kan antitumor effekter indusert av PIT lett kan overvåkes på grunn av ekstrudering av GFP fra behandlede celler.
Konseptet med å bruke rettet lys terapi er over tre tiår gammel [22]. På grunn av hydrofobisiteten til tradisjonelle fotodynamisk terapi (PDT) sensibilisatorer, er farmakokinetikken for antistoff konjugert PDT midler sterkt begrenset i sin evne til å levere konjugater til målet. Derfor har PDT sensibilisatorer målrettet med antistoffer bare vært vellykket i modeller hvor konjugatet ble injisert direkte i tumoren eller peritoneum [23]. For å kunne levere et antistoff-konjugat fotosensibilisator (APSC) systemisk, bør det foto være fortrinnsvis hydrofile. Den hydrofile ftalocyanin-baserte fotosensibilisatoren, IR700DX når konjugert til et antistoff blir en APC som kan administreres intravenøst. Denne form for terapi, benevnt PIT, skiller seg fra tradisjonelle PDT ikke bare i hydrofilisiteten til fotosensibilisatoren, men også i dens avhengighet av NIR-lys for å aktivere det fotosensibiliserende middel. NIR lys har bedre vevspenetrasjon enn bølgelengde lys lavere brukes i PDT. Denne nye generasjon av APCer viser tilsvarende intravenøse farmakokinetikken til nakne antistoffer, noe som resulterer i svært målrettet tumor opphopning med minimal ikke-target-binding, og kan brukes i et bredt spektrum av antistoffer, slik at mange potensielle anvendelser i hele kroppen.
tross cytostatika, utfallet for avansert stadium magekreft er fortsatt dårlig. Fordi, de fleste pasienter med peritoneal metastaser stede med lumske symptomer som dårlig appetitt, vekttap, oppblåsthet følelse, smerte eller anemi diagnosen er ofte forsinket og lokale behandlingsformer er ikke lenger mulig [24]. PIT er en lovende metode for behandling av disseminert peritoneal kreft. For å kunne utføre effektiv PIT, må APSC leveres systemisk og lyset skal være selektivt påføres peritoneum. Under disse forhold er det tilstrekkelig levering av APSCs å resultere i reduksjon av spres tumorer etter PIT. Denne prosessen kan overvåkes med sanntids
in vivo
GFP fluorescens-avbildning.
Det er flere begrensninger for denne studien. Det bør bemerkes at ikke alle gastriske cancere uttrykker HER2 og derfor, tra-IR700 kan ikke være ensartet effektive i å spres magekreft. Faktisk kan det være nødvendig å bruke av en cocktail av APSCs for effektivt å dekke mesteparten av ekspresjonsprofiler i en gitt tumor [25].
