Abstract
Anti-EGFR terapi er vanligvis brukes til å behandle kolorektal kreft (CRC), selv om bare en undergruppe av pasienter har nytte av behandlingen. Mens
KRAS
mutasjon spår non-respons, positiv prediktiv markører er ikke i klinisk praksis. Vi har tidligere vist at immunhistokjemi (IHC) -Guidede
EGFR
genkopitallet (GCN) analyse kan identifisere CRC pasienter drar nytte av anti-EGFR behandling. Her testet vi den prediktive verdien av en slik analyse i chemorefractory metastatisk CRC, belyst
EGFR
GCN heterogenitet innenfor svulster, og evaluert sammenhengen mellom
EGFR
GCN,
KRAS
status og anti-EGFR-antistoff respons i CRC-cellelinjer. Den chemorefractory pasient kohort besto av 54
KRAS
villtype (WT) metastatisk CRC pasienter.
EGFR
GCN status ble analysert ved sølv
in situ
hybridisering ved hjelp av en cut-off verdi på 4,0
EGFR
genkopier /celle.
KRAS
-WT og
KRAS
mutant CRC cellelinjer med ulik
EGFR
GCN ble brukt i
in vitro
studier. De chemorefractory CRC svulster med
EGFR
GCN økning (≥4.0) svarte bedre til anti-EGFR terapi enn
EGFR
GCN ( 4,0) svulster (klinisk nytte,
P
= 0,0004; PFS, HR = 0,23, 95% KI 0,12 til 0,46).
EGFR
GCN telles ved hjelp av EGFR IHC veiledning var betydelig høyere enn verdien fra tilfeldig utvalgte områder verifisere intratumoral
EGFR
GCN heterogenitet. I CRC cellelinjer,
EGFR
GCN korrelert med EGFR uttrykk. Beste anti-EGFR respons ble sett med
KRAS
-WT,
EGFR
GCN = 4 celler og fattigste respons med
KRAS
-WT,
EGFR
GCN = 2 celler. Anti-EGFR respons var assosiert med AKT og ERK1 /2 fosforylering, som ble effektivt hemmet bare i celler med
KRAS
-WT og økt
EGFR
GCN. I konklusjonen, IHC-guidet
EGFR
GCN er en lovende prediktor for anti-EGFR behandlingseffekten hos chemorefractory CRC
Citation. Ålgars A, Avoranta T, Österlund P, Lintunen M, Sundström J , Jokilehto T, et al. (2014) Hete
EGFR
genkopitallet Økning er vanlig i tykktarmskreft og Definerer Response til Anti-EGFR terapi. PLoS ONE 9 (6): e99590. doi: 10,1371 /journal.pone.0099590
Redaktør: Anthony W.I. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 19 januar 2014; Godkjent: 15 mai 2014; Publisert: 18 juni 2014
Copyright: © 2014 Ålgars et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Den finske Medical Foundation, Den finske Cancer Foundation, The National Graduate School of Clinical Investigations, Turku universitetssykehus EVO stipend, The Academy of Finland, og Kreftforeningen i Sør-Vest-Finland. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. AA, ML, JS, RR og OC er oppfinnere i et patent knyttet til dette arbeid: US 20110217296 A1 Fremgangsmåte for utvelgelse av pasienter for behandling med en EGFR-inhibitor. Alle gjenværende forfattere har erklært ingen interessekonflikter. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) signale vanligvis aktivert i tykk- og endetarmskreft (CRC). EGFR-målrettet mot monoklonale antistoffer (mAb) er blitt et standardbehandling, særlig i chemorefractory fase av metastatisk sykdom [1].
KRAS,
en signalmolekyl nedstrøms EGFR, er mutert hos omtrent 40% av CRC [1] og disse aktiverende mutasjoner formidle anti-EGFR behandling motstand [2]. I
KRAS
villtype (WT) svulster, er objektiv respons oppnås i hver tredje pasient som indikerer at andre faktorer bidrar til legemidlets effekt [3]. Dermed er det stort behov for nye prediktive markører.
EGFR
genkopitallet (GCN) økningen har vært knyttet til anti-EGFR behandlingsrespons. De fleste studier har vist en sammenheng mellom GCN nivå og klinisk nytte, progresjonsfri overlevelse (PFS), og i noen tilfeller, med total overlevelse (OS) [4] – [6]. Men
EGFR
GCN er foreløpig ikke benyttet i klinisk sammenheng på grunn av tekniske hindringer og stor variasjon mellom de scoring systemer [7]. Vi har nylig rapportert en roman algoritme, noe som kan forbedre prediktiv verdi på
EGFR
GCN. Vi først viste at
EGFR
GCN som analyseres av sølv
in situ
hybridisering (SISH) positivt korrelert med immunhistokjemi (IHC), når evalueringen ble utført fra tumor områder av høyeste fargeintensitet [ ,,,0],8]. Vi videre vist at økt
EGFR
GCN, ved hjelp av cut-off verdi (≥4.0), positivt korrelert med respons på anti-EGFR terapi i alle tre parametere analysert: klinisk nytte, PFS og OS.
EGFR
GCN var uavhengig av
KRAS
status, og når de to analysene ble kombinert, spådde de behandlingsrespons bedre enn både test alene. Den midlere
EGFR
GCN, som analysert ved hjelp av denne metoden var 5,5, og kopinummer økning ≥4.0 ble observert i 64% av tumorene. Den GCN Økningen ble vanligvis forbundet med kromosom 7 polysomy, mens høyt nivå forsterkning ble sjelden sett.
En årsak til variasjonen i publiserte
EGFR
GCN resultater kan være svulst heterogenitet, som ikke har vært adressert i tidligere studier. Det er noen bevis for at EGFR kan heterogent uttrykk innenfor enkelte kolorektal tumorer, både på gen- og proteinnivå [5]. Heterogenitet kan komplisere analysen av EGFR-protein ekspresjon og kopiantall endringer og føre til dårlig reproduserbarhet test [7], [9]. Dette kan være spesielt aktuelt i FISH basert analyse, hvor GCN telling ikke kan være korrelert med histologi [7]. Hvis
EGFR
heterogenitet spiller en biologisk rolle, da en algoritme, hvor protein uttrykk (IHC) guider
EGFR
GCN evaluering, kan du forbedre prediktiv verdi.
Målet med denne studien var å teste den nye
EGFR
GCN metode i en uavhengig pasient kohort og for å vurdere effekten av
EGFR
GCN status med utfallet i en kombinert chemorefractory pasient kohort. I begge pasient kohorter en
EGFR
økning (≥4.0) ble vist å assosiere med en forbedret klinisk utfall, inkludert klinisk nytte, PFS og OS. Sekundære mål var å belyse
EGFR
GCN heterogenitet innenfor svulster og for å teste, om CRC cellelinjer med ulike
EGFR
GCN, reagerer forskjellig på EGFR mAbs. I henhold til våre resultater,
EGFR
GCN er heterogen i CRC og de oppnådde med IHC veiledning fra selekterte tumorområder verdier er høyere enn de som er oppnådd ved tilfeldig valg. Viktigere bare
EGFR
GCN regnet med EGFR IHC veiledning var i stand til å forutsi respons på anti-EGFR behandling. Vår
in vitro
studier støtter våre kliniske funn, siden den beste responsen på anti-EGFR behandling ble sett i
KRAS
WT,
EGFR
GCN = 4,0 celler og fattigste svar i
KRAS
WT,
EGFR
GCN = 2 celler.
Materialer og metoder
Pasienter
den opprinnelige Turku universitetssykehus oppdagelsen kohorten har blitt rapportert [8]. Valideringen kohorten besto av 31
KRAS
-WT pasienter behandlet med EGFR mAb’er i andre til sjette linje ved Helsingfors universitetssykehus for metastatisk CRC mellom juni 2008 og juli 2010. Utvalgskriteriene for denne studien var: (I ) vev var tilgjengelig fra den primære svulsten ved diagnose før start av behandling, (II) svulsten var
KRAS
-WT, (III) pasienter fikk andre- til sjettebehandling med cetuximab eller panitumumab med eller uten kjemoterapi, og (IV) pasientene hadde ingen annen malignitet i sin historie. Den histologi av hver validering kohort saken ble vurdert på nytt av en ekspert i GI-patologi (AR).
Den kombinerte gruppen av chemorefractory pasienter inkluderte 54 pasienter, 25 fra den opprinnelige Turku kohort og 29 fra Helsinki validering sett. Den chemorefractory pasienten kohorten inkluderte pasienter behandlet med anti-EGFR mAbs i tredje linje eller mer, enten som eneste behandling eller i kombinasjon med irinotecan +/- et fluorpyrimidin. Viktige egenskaper ved alle tre kohorter er beskrevet i Tabell 1.
Responsen på anti-EGFR behandlingen ble evaluert ved computertomografi (CT) eller magnetisk resonans imaging (MRI) i henhold til de Response evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST versjon 1.1) [10]. Klinisk nytte ble ansett for delvis respons (PR) eller minst 3 måneder med stabil sykdom (SD). Progresjonsfri overlevelse (PFS) ble beregnet fra starten av anti-EGFR behandling inntil sykdomsprogresjon. Total overlevelse (OS) ble beregnet fra starten av anti-EGFR terapi til død uansett årsak.
Etikk erklæringen
Studien ble gjennomført i samsvar med Helsinkideklarasjonen. De kliniske data ble hentet og histologiske prøver samlet inn og analysert med tilslutning av National Authority for Medico-Legal Affairs samt Institutional Review Board av Hospital District of Egentliga Finland og livssyns Review Board ved Helsinki University Hospital. Skriftlig eller muntlig informert samtykke ble ikke oppnådd på grunn av det faktum at en stor del av pasientene inkludert i denne retrospektive studien hadde dødd av sykdommen. Behovet for informert samtykke fra deltakerne ble frafalt av National Authority for Medico-Legal Affairs.
IHC og SISH Prosedyrer
KRAS
mutasjonsanalyse ble utført med DxS KRAS mutasjon kit (DxS Ltd, Manchester, UK). Detaljerte metoder for EGFR IHC og
EGFR
GCN har blitt beskrevet [8]. I korte trekk ble tre mikrometer seksjoner først farget med EGFR (klone 5B7) mAb (Ventana Medical Systems /Roche Diagnostics, Tucson AZ, USA). Stainings ble utført med BenchMark XT (Ventana /Roche) ved hjelp av
ultra
VIEW Universal DAB Detection Kit (Ventana /Roche).
EGFR
genet ble oppdaget fra etterfølgende fem mikrometer seksjoner med
EGFR
DNA Probe (Ventana /Roche) og
ultra
VIEW SISH Detection Kit (Ventana /Roche). I hver svulst,
EGFR
GCN førti tumorceller ble analysert ved hjelp av et 40x objektiv av to observatører (ML, JS) fra områder med høyest IHC reaktivitet. Etterforskerne ble blindet av klinisk informasjon. For å evaluere den gjennomsnittlige
EGFR
GCN innenfor hver svulst, fem kreft områder ble tilfeldig valgt. Fra hvert av disse områdene,
EGFR
GCN av 20 tilfeldig utvalgte kreftceller ble telt av to observatører (TA, JS). Resultatene ble rapportert som gjennomsnitt og utvalg innenfor hvert område.
cellelinjer, Western blotting og cytotoksisitetsassayer
C2BBe1, SK-CO-1 og NCI-H747 cellelinjer ble kjøpt fra ATCC (Manassas, VA, USA) og CW-2 cellelinje fra Riken Bioresource sentrum (Tsukuba, Japan). NCI-H747 og CW-2-celler ble dyrket i RPMI-1640, SK-CO-1 celler i EMEM og C2BBe1 celler i DMEM supplert med 0,01 mg /ml humant transferrin (Sigma, Saint Louis, MO, USA). Alle media ble supplert med 10% FBS, 2 mM glutamin og 1% penicillin /streptomycin.
For signalveien analyse celler ble dyrket på 6-brønners plater og tillatt å feste i 12 timer i vanlig medium. Så ble de endret til medium med 1% FBS og gitt 0-200 mg /ml cetuximab (Erbitux, Merck Serono) i 24 timer. 25 mg /ml EGF ble gitt til cellene i fem minutter før lysering.
proteinnivåer ble analysert ved Western blotting av cellene lysert i RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P -40, 0,5% deoksykolat, 0,1% SDS, 1 mM ortovanadat, og protease-inhibitor blanding, pH 7,4). Proteiner ble oppløst ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Etter natten inkubasjon i + 4C ° med primær antistoff [anti-EGFR (D38B1, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), fosfor-EGFR (Tyr1173, 53A5, Cell Signaling Technology), ERK2 (K-23, Santa Cruz Biotechnology , Dallas, TX, USA), fosfo ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, D13.14.4E, Cellesignalering signale~~POS=TRUNC Technology), fosfor-AKT (Ser 473), panAKT (C67E7, Cell Signaling Technology)], ble membranene inkubert i 1 time ved romtemperatur med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Dako, Glostrup, Danmark) og de signaler som ble påvist med SuperSignal West Pico kjemiluminescerende substrat (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Anti-α-tubulin mAb (B-1-5-1-2, Sigma) eller HRP-konjugert anti-GAPDH-mAb (mAbcam 9484, Abcam, Cambridge, UK) ble anvendt som en kontroll lasting.
for cellelevedyktighetsanalyser, 5000 celler /brønn ble sådd ut på 96-brønners plater. Etter inkubering over natten i nærvær av 2% FBS, ble cellene eksponert for 0-200 ug /ml cetuximab (erbitux, Merck Serono) eller panitumumabs (Vectibix, Amgen) i 72 timer i medium supplementert med 1% FBS. Hver behandling ble utført i triplikat, og forsøket ble gjentatt fire ganger. Celleviabilitet ble vurdert med CellTiter 96 vandige løsning Cell Proliferation analyse (Promega, Madison, WI, USA). Cellen levedyktighet er gitt som prosent av kontrollcellene.
Statistical Analysis
Statistiske analyser ble utført med guide SAS 9.2 og Enterprise 4.2-programmer (SAS Institute Inc., Cary, NC). Frekvens tabelldata ble analysert med χ2-test eller Fishers eksakte test. Forskjellen i
EGFR
GCN verdier oppnådd ved ulike evalueringsmetoder (variabler normalfordelte) ble beregnet med studentene t-test. Kaplan-Meier og log-rank tester samt Cox regresjonsmodell ble brukt for univariate overlevelsesanalyse. Alle statistiske tester var tosidig.
P
-verdier 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Den statistiske betydning for celle levedyktighet analysene ble beregnet med Microsoft Excel 2011 og Statplus: mac LE (versjon 2009, AnalystSoft Inc.). Betydningen mellom forskjellene i svarene i cellelinjene ble bestemt med to-veis ANOVA etterfulgt av flere t-tester.
Resultater
EGFR
GCN Test Validering med en uavhengig pasient Cohort
For å validere våre tidligere resultater om sammenhengen mellom
EGFR
GCN og anti-EGFR behandlingsrespons, studerte vi en uavhengig pasient kohort behandlet ved Helsinki University Hospital. Metodene for
EGFR
GCN deteksjon og cut-off verdi for GCN økningen var identiske til oppdagelsen studien [8]. I valideringen årsklasse, 18 av 31 (58%) svulster hadde en
EGFR
GCN over cut-off-verdien (≥4.0), sammenlignet med 64% i den opprinnelige funn sett. Fjorten (78%) av høy
EGFR
GCN (≥4.0)
KRAS-
WT pasientene viste klinisk nytte [partiell respons (PR) + stabil sykdom (SD)] fra anti-EGFR terapi, mens bare fire (31%) av lav
EGFR
GCN ( 4,0) dratt nytte av behandling (Chi-kvadrat test,
P
= 0,009). En forhøyet
EGFR
GCN forbundet betydelig med bedret overlevelse. Median PFS tiden av
EGFR
GCN≥4.0 var 25 uker sammenlignet med bare 11 uker
EGFR
GCN 4,0 pasienter (log-rank test,
P
= 0.002, Cox test,
P
= 0,003, HR = 0,28, 95% KI 0,12 til 0,65; Figur 1a). Videre
EGFR
GCN≥4.0 forbundet betydelig med forbedret OS (median 12,1 versus 8,2 måneder, log-rank test,
P
= 0,004; Cox test,
P
= 0,006, HR = 0,32, 95% KI 0,14 til 0,72;. Figur 1b)
progresjonsfri overlevelse (a) og total overlevelse (b) av test validering kohorten i henhold til
EGFR
genkopitallet. Progresjonsfri overlevelse (c) og total overlevelse (d) av den kombinerte chemorefractory pasient kohort.
Sammenheng mellom
EGFR
GCN og behandlingsrespons i Chemorefractory Pasienter
Vi har kombinert den chemorefractory
KRAS
WT pasienter fra begge gruppene (
n
= 54) for videre statistiske analyser. Åtti prosent (28 av 35) av pasientene med høy
EGFR
GCN (≥4.0) oppnådde klinisk nytte. I motsetning til den kliniske nytterate var bare 32% (6 av 19) for pasienter med lav
EGFR
GCN ( 4,0) (Chi-Square test,
P
= 0,0004).
Vi analyseres separat de 31 chemorefractory pasienter behandlet med cetuximab (57%) og 21 med panitumumab (39%). To pasienter ble behandlet med både anti-EGFR antistoffer sekvensielt og derfor ekskludert fra analysen. Den kliniske nytterate hos pasienter behandlet med cetuximab +/- kjemoterapi med et høyt
EGFR
GCN i sine primære svulster var 86% (18/21) sammenlignet med 20% (2/10) i gruppe pasienter med en
EGFR
GCN 4,0 (Fishers Exact test,
P
= 0,0007). I pasientgruppen behandlet med panitumumab +/- kjemoterapi klinisk nytte var 67% (8/12) hos pasienter med høy
EGFR
GCN og 44% (4/9) i de med lav
EGFR
GCN. Resultatene er presentert mer i detalj i tabell S1.
Økt
EGFR
GCN Associates med forbedret PFS og OS i Chemorefractory Disease
Median PFS av chemorefractory pasienten kohorten var betydelig lengre i
EGFR
GCN≥4.0 pasienter enn i
EGFR
GCN 4,0 pasienter; . 29.5
vs
10,8 uker (log-rank test,
P
0,0001, Cox test,
P
0,0001, HR = 0,23, 95% KI 0,12 -0,46). Median OS for pasienter med
EGFR
GCN≥4.0 svulster var 12,5 måneder sammenlignet med 7,2 måneder for de med
EGFR
GCN under cut-off-verdien (log-rank test,
P
= 0,0002; Cox test,
P
= 0,0003, HR = 0,32, 95% KI 0,17 til 0,59). Kaplan-Meier-overlevelseskurver er vist i figur 1 c-d.
PFS holdt seg lengre i pasienter med en høy
EGFR
GCN uavhengig av hvilken anti-EGFR-mAb ble anvendt. Hos pasienter behandlet med cetuximab +/- kjemoterapi median OS tiden var statistisk signifikant lenger i kohort av pasienter med en
EGFR
GCN≥4.0 sammenlignet med de med en
EGFR
GCN under 4,0 (12,5
vs
4,6 måneder;. log-rank test
P
= 0,0006; Cox test
P
= 0,001, HR 0,25, 95% KI 0,10 til 0,58 ), mens ingen statistisk signifikant OS forskjell ble sett hos pasienter behandlet med panitumumab. Resultatene er vist i tabell S1.
overlevelsesdata av den opprinnelige discovery, den uavhengige validation-, og kombinert chemorefractory pasient kohorter er sammenlignet i Figur 2.
De hazard ratio og tillit intervaller på den opprinnelige oppdagelse, validering, og kombinerte chemorefractory pasient kohorter vises. En høy
EGFR
GCN (IHC guidet SISH) er assosiert med en forbedret sykdom utfall i alle tre
KRAS
villtype metastatisk kolorektal kreft pasient kohorter behandlet med anti-EGFR terapi (to uavhengige kohorter og en kombinert kohort av chemorefractory pasienter).
EGFR
GCN heterogenitet innen Svulster
EGFR
GCN ble tilfeldig evaluert, uten IHC veiledning, fra alle 31 validerings kohort svulster. Gjennomsnittlig
EGFR
GCN verdier fra tilfeldig utvalgte områder var betydelig lavere sammenlignet med den metoden der
EGFR
GCN ble evaluert selektivt fra områder med høyest EGFR protein uttrykk (
P
0,0001). Median
EGFR
GCN av disse 31 primære CRC svulster var 4,3 da IHC veiledning ble brukt og 3,3 da ble utført analysen på en tilfeldig måte. Heterogeniteten av
EGFR
GCN innenfor en CRC tumorprøve er vist i figur 3.
EGFR IHC viser uensartet farging med intensiv membranøs reaktivitet i midten (a).
EGFR
SISH fra intensivt fargede området viser gensamlingene (b).
EGFR
SISH fra omkringliggende områder med svak eller negativ EGFR IHC farging viser marginalt forhøyet eller normale genet kopiantall (c-d).
Når tilfeldig valgt
EGFR
GCN verdier ble brukt for å overleve analyser (
EGFR
GCN≥4.0
vs EGFR
GCN 4.0.) ble ikke observert noen statistisk signifikant forskjell mellom de to gruppene (PFS:
P
= 0,07, HR 0,40, 95% KI 0,15 til 1,08; OS:
P
= 0,22, HR = 0,58, 95% KI 0,25 til 1,38). Ingen signifikant forskjell i anti-EGFR behandlingseffekten (klinisk nytte
vs.
Progressiv sykdom) ble notert enten (Fishers Exact test,
P
= 0,19).
EGFR
GCN og Response til Anti-EGFR Abs In vitro
Vi søkte på Sanger Senter kreftcellelinje database (https://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP /cghviewer/CghHome.cgi) for
EGFR
GCN endringer. Et lavt nivå av
EGFR
GCN økning (4-15 kopier /celle), vanligvis på grunn av kromosom 7 polysomy, ble sett i 18 av 39 (46%) cellelinjer. Å korrelere
EGFR
GCN og
KRAS
status med anti-EGFR mAb svar, valgte vi fire linjer for analyse. The CW-2 og C2BBe1 cellelinjer er
KRAS
-WT og har to og fire eksemplarer av
EGFR, etter henholdsvis. NCI-H747 og SK-CO-1 er begge
KRAS
mutant og har mer enn fire eksemplarer (6-7) på
EGFR
.
EGFR
GCN ble bekreftet av SISH (figur 4a).
EGFR
GCN var direkte reflektert i EGFR protein uttrykk som indikert av Western blot analyse (figur 4b). I celle levedyktighet analyser,
KRAS
-WT cellelinje med
EGFR
GCN 4 (C2BBe1) var den mest følsomme for både cetuximab og panitumumabbehandling (figur 4c). Differansen var statistisk signifikant sammenlignet med noen av de andre cellelinjer (t-test,
P
0,001). Interessant,
EGFR
disomic, WT
KRAS
cellelinje (CW-2) var mest motstandsdyktig mot mAb behandling. Cellelinjene med mutert
KRAS Hotell og
EGFR
GCN 4 viste middels følsomhet, spesielt til panitumumabbehandling. Resultatene er dermed i overensstemmelse med våre kliniske data indikerer at både
EGFR
GCN og
KRAS
status definere tumorcelle respons på anti-EGFR mAbs.
(a)
EGFR
GCN SISH analyse av de ulike cellelinjer. (B) En western blot bilde som viser nivåene av EGFR-proteinet i de forskjellige cellelinjer. α-tubulin ble anvendt som en kontroll for lik belastning. Cellelevedyktigheten til de forskjellige cellelinjer ved varierende konsentrasjoner av (c) cetuximab og (d) panitumumabs. Resultatene er gitt som prosent av levedyktige celler sammenlignet med ikke-behandlede celler (gjennomsnitt ± SE for fem forsøk). (E) Western blot som viser EGFR pathway aliserte molekyler i de forskjellige cellelinjer. Cellene ble forbehandlet med de angitte mengder av cetuximab i 24 timer i medium inneholdende 1% FBS og gitt EGF (25 ug /ml) i 5 minutter før lysis. De angitte signalmolekyler ble analysert med western blotting. GAPDH ble brukt som en kontroll for lik belastning.
Vi ytterligere sett på effekten av anti-EGFR-mAb-behandling på intracellulær signalisering i disse cellelinjene. I
KRAS
mutante cellelinjer med mer enn fire
EGFR
genkopier, fosforylering av EGFR var tydelig og effektivt blokkert av anti-EGFR mAb (figur 4e). Anti-EGFR hemming delvis redusert pErk1 /2 nivåer, mens nivået av Pakt ikke ble påvirket. I
KRAS
-WT cellelinjer med 2-4
EGFR
genkopier EGFR fosforylering var under deteksjonsgrensen (ikke vist). Men veien var tydeligvis operativ som indikert av svarene på nedstrøms signalering. I
EGFR
disomic linje CW-2, anti-EGFR mAb behandling redusert pErk1 /2-nivå, men ikke påvirke AKT fosforylering (figur 4e). Bare i
EGFR
polysomic og villtype
KRAS
C2BBe1 celler, en effektiv blokkering av både ERK1 /2 og AKT signalering, ble oppdaget (figur 4e). Disse resultatene dermed tyder på at både
EGFR
GCN og
KRAS
mutasjonsstatus bestemme effekten av anti-EGFR mAb på EGFR nedstrøms signalering og tykktarmskreft celleoverlevelse.
Diskusjoner
i denne studien, viser vi at heterogene
EGFR
GCN økningen er en sterk prediktor for anti-EGFR behandling fordel i metastatisk CRC. Resultatene utvide våre tidligere funn av en enkelt institutt pasient kohort til en uavhengig validering kohort. I tillegg har de demonstrere prediktiv verdi på
EGFR
GCN for anti-EGFR terapi effekt hos chemorefractory CRC pasienter, den viktigste pasientgruppen kvalifisert for denne behandlingen. Resultatene viser videre at intra-tumor
EGFR
GCN heterogenitet er vanlig i CRC. Vi hypotese at denne tidligere gjort rede
EGFR
heterogenitet er en grunn for den rapporterte dårlig samsvar mellom
EGFR
GCN analyse og effekt av anti-EGFR terapi, og foreslå en forbedret metode for prediktiv
EGFR
GCN testing.
pasient~~POS=TRUNC materialet~~POS=HEADCOMP i vår studie inkluderte pasienter behandlet med anti-EGFR terapi både i en tidlig og chemorefractory fase av metastatisk CRC terapi. For å kontrollere for konfunderende effekter av kjemoterapi følsomhet når det kombineres med anti-EGFR mAbs på våre resultater, prediktiv verdi på
EGFR
GCN på anti-EGFR behandlingsrespons ble vurdert separat i undergruppen av pasienter behandlet i en chemorefractory fase (tredje linje eller mer). Resultatene oppnådd i chemorefractory gruppen resultatene var lik resultatene av hele pasienten årsklasse, som støtter vår tolkning at et høyt
EGFR
GCN er faktisk en prediktor for gunstig anti-EGFR behandlingsrespons.
Både cetuximab og panitumumab i chemorefractory pasientgruppen viste bedre PFS i
EGFR
GCN≥4.0 pasienter. Total overlevelse og sykdomskontrollrate ble statistisk forbedret for cetuximab årsklasse, og numerisk, men ikke statistisk i den lille panitumumab kohort. De to terapeutiske Abs er av forskjellig type, panitumumab å være et humant mAb, mens cetuximab er en mus-human chimera.
In vitro
analysen viste identisk cytotoksisitet for de testede CRC linjer, men
in vivo
, andre mekanismer, inkludert antistoffavhengig cytotoksisitet (ADCC) kan være i drift. I denne forbindelse kan cetuximab og panitumumabs være annerledes, og derfor økt
EGFR
GCN kunne bedre indikere følsomhet for cetuximab behandling [11]. Ifølge pre-kliniske og visse kliniske data cytotoksiske behandlinger +/- immunmodulerende midler, inkludert f.eks Gilf (gemcitabin, irinotecan, levofolinic, og 5-fluorouracil), GILFI (gemcitabin, irinotecan, levofolinic syre, fluorouracil, aldesleukin), og GOLFIG (gemcitabin, oksaliplatin, levofolinate, 5-fluorouracil, GM-CSF, Aldesleukin) regimer, har evnen til effektivt å oppregulerer EGFR-ekspresjon på tykktarmskreftceller, og dermed forbedre følsomheten av tykktarmskreftceller til å cetuximab-mediert ADCC [12] – [14]. I vår studie ble panitumumab brukt som eneste behandling oftere enn cetuximab, 42,9
vs
henholdsvis 6,5%, noe som i hvert fall delvis kan forklare forskjellen observert i effektresultatene mellom de to antistoffer. Begge antistoffer, når det ikke gis som eneste behandling, ble kombinert med irinotecan basert kjemoterapiregimer. I vår studie ble oksaliplatin eller enkelt kapecitabin ikke kombineres til anti-EGFR terapi i chemorefractory fase av sykdommen. To pasienter fikk cetuximab og panitumumabs sekvensielt og derfor ekskludert fra denne studien. Derfor er verken kombinasjonen cytotoksisk medikament eller administrering av begge antistoffene sekvensielt, forklarer forskjellen i resultatene som ble oppnådd med de forskjellige anti-EGFR-antistoffer. Alternativt kan vår Resultatet gjenspeiler en forskjell mellom behandlede pasienter. Cetuximab ble mer vanlig i oppdagelsen årsklasse, som definerte test cut-off verdi, og panitumumab i valideringen kohorten med bare chemorefractory pasienter. Som begge kohorter var retrospektiv, kan vi ikke utelukke forskjeller i pasientpopulasjoner, som kan redegjøre for forskjellene i behandlingsresultatene.
Tumor heterogenitet har blitt foreslått å bidra til vanskelighetene i valideringen av onkologi biomarkører [15] . I det foreliggende arbeid, den midlere
EGFR
GCN verdier var signifikant lavere når de analyseres på en tilfeldig måte i forhold til de verdier som oppnås ved å velge de celler som har høyest GCN. Bare den sistnevnte metoden var i stand til å skille mellom pasienter i henhold til deres anti-EGFR behandlingsrespons. Dette støtter det syn at terapeutisk beslutningsprosesser basert på scoring dominerende fenotype kan være misvisende [15]. Selv en liten prosentandel av mutante alleler og genuttrykk profiler kan være avgjørende for behandlingsrespons [16].
EGFR
GCN heterogenitet er en godt etablert fenomen i hjernesvulst [17]. Selv
EGFR
GCN heterogenitet i CRC kan ha blitt identifisert tidligere, har dette funnet er vanligvis sett bort fra, og ikke inngår som en parameter i diagnostiske analyser. I noen henseender, sammenhengen mellom
EGFR
GCN og behandlingsrespons ligner funnene i en annen EGFR familiemedlem,
Her2, etter i magekreft.
Her2
forsterkes eller overuttrykt i 7-34% av mage kreft [18]. I motsetning til i brystkreft, Her2 uttrykk i magekreft viser merket intra-tumor heterogenitet, og derfor diagnostisk test tolkning er forskjellig fra brystkreft [19]. De gjeldende prediktiv diagnostikk for trastuzumab behandling i magekreft er basert på en kombinasjon av Her2 IHC og
Her2
GCN analyse av områder med høyest IHC farging. I biopsier, kan slike områder omfatte bare 5% av tumoren [19]. Selv om det er paralleller, HER2-magekreft algoritmen er forskjellig fra
EGFR
GCN i CRC. I magekreft, er cut-off verdi basert på genet til kromosom ratio ≥2.0, selv om de fleste nyere anbefalinger tyder på at
Her2
GCN 6.0 kan betraktes som positivt. I CRC,
EGFR
GCN økningen er vanligvis et resultat av kromosom 7 polysomy og derfor genet til kromosom forholdet er ikke informativ. På den annen side kromosom 17 er sjelden polyploid i magekreft, noe som indikerer en annen biologisk mekanisme for
EGFR Hotell og
Her2
økning.
Tumor heterogenitet har blitt foreslått å ligge til grunn motstand mot målrettet kreftbehandling [15]. I denne sammenheng funnet at en mindre befolkning på
EGFR
GCN høye celler definerer behandlingsrespons er uventet.
