Abstract
Inte ανβ6 er sterkt uttrykt i en rekke humane kreftformer og ofte korrelerer med pasientens overlevelse. Denne studien undersøker sammenhenger mellom ανβ6 uttrykk og pasient klinisk-patologiske funksjoner i Stage B og Stage C endetarmskreft, inkludert total overlevelse. Uttrykk for ανβ6 ble målt i 362 Stage B eller prøver C endetarmskreft vev på svulsten sentrale regionen, invasiv tumor foran og ved siden av ikke-neoplastisk slimhinnen ved hjelp immunhistokjemi. Fordeling av ανβ6 ble funnet å være signifikant høyere ved invasiv fremre sammenlignet med sentrale områder av tumoren (p 0,001), eller tilstøtende ikke-neoplastisk mucosa (p 0,001), og antyder ανβ6 spiller en rolle ved tumorcelle invasjon. Men inte ανβ6 uttrykk var ikke assosiert med klinisk-patologiske funksjoner eller total overlevelse indikerer det er ikke en uavhengig prognostisk markør skille Stage B eller C endetarmskreft. Tidligere studier har antydet ανβ6 ekspresjonen av ανβ6 er involvert i de tidlige stadier (dvs. etapper A /B) for tumorprogresjon i stedet for de senere trinn (dvs. etapper C /D). Men vår studie viste at i endetarmskreft ανβ6 uttrykk ikke øker mellom Stages B og C, men kan forekomme tidligere, nemlig før eller under Stage B kreft
Citation. Ahn SB, Mohamedali A, Chan C Fletcher J, Kwun SY, Clarke C, et al. (2014) Korrelasjoner mellom Inte ανβ6 Expression og klinisk-patologiske funnene i Stage B og Stage C rektal kreft. PLoS ONE 9 (5): e97248. doi: 10,1371 /journal.pone.0097248
Redaktør: Ju-Seog Lee, University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 11. november 2013, Godkjent: 16 april 2014; Publisert: 12. mai 2014
Copyright: © 2014 Ahn et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av BIOFOCUS Research Centre, Macquarie University og tilskudd fra NHMRC (1010303) og Kreftrådet NSW. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Klassifisering av alvorlighetsgraden av tykk- og endetarmskreft (CRC) er i dag basert på klinisk og histologisk fastsettelse av omfanget av spredning av svulsten. Tumorceller kan være lokalisert inne i tarmveggen (trinn A), som strekker seg forbi muscularis propria (trinn B), eller metastasert til lymfeknuter (trinn C), eller fjerntliggende organer (Trinn D). Fem-års overlevelses CRC statistikk viser en signifikant reduksjon i overlevelse mellom trinn B og C, som tilsvarer forskjellen i lymfeknutemetastase [1]. Selv om klinisk-patologiske oppsetningen er dagens gullstandardteknikk for bestemmelse av prognose, bruk av nye protein biomarkører uttrykkes eller amplifiseres i en fasespesifikk måte under progresjon kan øke nøyaktigheten og påliteligheten av histologiske bestemmelser. En kombinasjon av en lyd CRC oppsetning system og nærværet av protein prognostiske markører er blitt foreslått som en mer effektiv metode for diagnose, prognose og behandling veiledning [2].
En nylig foreslått potensial prognostisk biomarkør er den integrin ανβ6. Dette proteinet er høyt uttrykt i mange typer av kreft og har vært foreslått å være en prognostisk indikator på dårlig overlevelse i CRC, gastrisk adenokarsinom og cervikal plateepitel carcinom [3] – [6]. Integrin ανβ6 er et transmembran reseptor sammensatt av ikke-kovalent koblede αν og β6 underenheter, hvor β6 subenhet partnerne utelukkende med αν og er uttrykt bare i epitelvev [7]. ανβ6 er ofte konsentrert i dårlig differensierte tumorer invadere proksimalt til kreft marginer [8] – [11]. Det har også blitt identifisert som en viktig faktor i
«epitelial til mesenchymale overgang» product: (EMT) som er preget av tap av celle adhesjon, undertrykkelse av E-cadherin og økt cellemotilitet under carcinoma progresjon [12] . Inte ανβ6 er tenkt å operere i en kompleks måte, initiere cellesignalering kaskader mens også i samspill med nøkkel ekstracellulære matriks (ECM) proteiner og aktivere vekstsignaler som latent transformerende vekstfaktor β1 (TGF-P1), en anerkjent induser av EMT [3 ], [1. 3]. Til støtte for denne påstand, antistoff-mediert inhibering av ανβ6-mediert TGF-β1 aktiverings undertrykker EMT [14]. I tillegg har ανβ6 integrin vist seg å spille en viktig rolle i en CRC sfæroide EMT modell mediert gjennom TGF-β1 aktivering og påfølgende migrasjon av celler på interstitiell fibronektin [11].
I motsetning til de fleste andre integriner, ανβ6 signaler gjennom en unik 12-mer C-terminal cytoplasmatiske sekvens som direkte samhandler med ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK2) aktivering av ERK /MAPK sti som ofte svært overuttrykt i CRC metastaser [15]. Den β6 • ERK2 samhandling er også ansvarlig for inte-mediert matriksmetalloprotease 9 (MMP9) sekresjon (gjennom MAPK) som gjør at nedbrytning av ECM, tilrettelegging celle flykte [16], [17]. Oppsummert er ανβ6 en regulator av metastaser og er funnet å være overuttrykt i mange kreft fenotyper. Mens kroppen av bevis implicating ανβ6 i metastase er betydelig, for tiden ingen studier har undersøkt når det blir overuttrykt, eller om det finnes sammenheng mellom ανβ6 og pasient overlevelse i endetarmskreft. I denne studien vi spesielt undersøke immunhistokjemiske ekspresjon av ανβ6 i 362 pasienter med kreft i endetarmen Trinn B eller C i det sentrale område av tumoren, invasive fremre og tilstøtende ikke-neoplastisk mucosa.
Materialer og Metoder
Pasient kohort
Alle pasientene gjennomgikk kirurgisk reseksjon for endetarmskreft i Concord Hospital, en tertiær henvisning sykehus i Sydney, Australia, mellom januar 1988 og desember 2001. Alle resections ble utført av spesialist kolorektal kirurger etter en standardisert teknikk (total anatomisk disseksjon) [18]. Endetarmen ble definert som blant annet rektosigmoid krysset, men unntatt endetarmen. Kliniske data fra pasienter ble inngått en prospektiv database igangsatt i 1971, inkludert informasjon om pasientkarakteristika, komorbiditet, presentasjon, undersøkelser, kirurgiske inngrep, komplikasjoner, adjuvant behandling, patologi og oppfølging [19], [20]. Barnekonvensjonen Prosjektet ved Concord Hospital utføres under godkjenning av South Western Sydney Helse området etiske komité (CH62 /6 /2011-136) med skriftlige samtykke i samsvar med kravene i NSW menneskelig vev Act 1983 og NHMRC National Statement på etisk atferd i human Forskning 2007. studien også godkjent av Macquarie University Menneskelig etiske komité (# 5201100858). Pasienter som fikk neoadjuvant strålebehandling hadde enten korte eller lange kurset behandling med eller uten assosiert kjemoterapi. Utvalg for behandling var basert på kliniske funn og diskusjon i et tverrfaglig møte.
Patologisk undersøkelse av resected prøven
Undersøkelse av resected prøver fulgte en standard protokoll [1]. Tumorstørrelsen ble målt som den største flate dimensjon. Blokker ble tatt for å demonstrere maksimum direkte tumor gjennomtrengning av tarmveggen. Ytterligere blokker ble tatt spesielt for å vise forholdet mellom tumoren og eventuelle vedhengende struktur eller vev [21] samt linjer av reseksjon og den frie serosale overflate [22]. Tumor nivå i rektum ble målt fra analåpningen. Venøs invasjon av svulsten henvist til involvering av tykke eller tynne vegger årer, enten innenfor eller utenfor tarmveggen. Når tvil eksistert med hensyn til om en struktur involvert var en vene, ble et negativt funn registrert. En apikal node ble definert som den mest proksimale av alle noder innenfor 1 cm fra ligeringen av et navngitt beholder på toppen av en vaskulær pedicle. Tumor klasse ble bedømt å ta hensyn til graden av differensiering og anaplasia, arten av tumor margin (dytte eller den infiltrerende) og tilstedeværelsen og innflytelse av vaskulær invasjon [19]. Alle patologiske egenskaper ble analysert i hver prøve og tilstedeværelse eller fravær registrert eksplisitt, med ingen mangler data på en variabel.
Svulster ble iscenesatt etter den australske klinisk-patologisk Staging (ACPS) system [1] for CRC som plass til sub-etapper som er kompatible med andre clinicopathologic iscenesettelse systemer som TNM [23]. Et potensielt kurativ operasjon ble definert som en hvor det var ingen systemiske metastaser ved drift og ingen tumor identifisert histologisk i den proksimale, distale eller omkretslinjer reseksjon histologisk (ACPS stadier A, B, C).
Tissue microarray konstruksjon
microarray (TMA) ble konstruert ved hjelp av en avansert Tissue Arrayer ATA-100 (Chemicon, Temecula, CA, USA). Kjerner (1,5 mm) ble tatt av nøye utvalgte, morfologisk representative områder av de opprinnelige parafinblokker og kledd i ferske mottaker parafinblokker. Kjernene ble tatt fra den sentrale regionen av tumor (for å unngå luminale flater), invasiv fronten av tumoren og histologisk normale slimhinne.
Immunhistokjemi (IHC)
A murint monoklonalt antistoff (MAb) mot full lengde human ανβ6 (klone 6.2A1, IgG1) (Biogen Idec, Cambridge, MA, USA) ble brukt i IHC. Spesifisiteten av anti-ανβ6 monoklonalt antistoff 6.2A1 har blitt rapportert i flere studier [14], [24] – [26]. Alle TMA seksjoner ble utarbeidet og behandlet samtidig med samme batch av primære og sekundære antistoffer og Fargingsreagensmidlene, at behovet for å distribuere en intern standard. IHC ble utført med to forskjellige deteksjonsforsterkersystemer: et avidin-biotin kompleks (ABC) og et polymerbasert IHC deteksjonssystem. For ABC IHC, ble 4 mikrometer parafininnstøpte TMA seksjoner deparaffinised og utvannet, og endogen peroxidase blokkert med 3% H
2o
2 i metanol i 5 min. Antigen gjenfinning ble utført ved anvendelse av pepsin (DAKO, Carpinteria, CA) ved 37 ° C i 10 min. Seksjoner ble inkubert med hesteserum (Vector Laboratories, Burlingame, CA) blokkeringsløsning (15 ul /ml) i TBS-Tween 20 i 20 minutter ved romtemperatur (RT) og deretter inkubert med 0,5 mg /ml anti-ανβ6 MAb ved romtemperatur i 60min . Seksjoner ble inkubert med biotinylert anti-muse-IgG (Vector Laboratories) i 20 min ved RT og inkubert med Elite ABC reagens (Vector Laboratories) i 20 min ved RT. Mellom hver inkubasjon ble TBS vasking utført to ganger. 3,3′-diaminobenzidin substratet i 0,05 M Tris-HCL (pH 7,4) ble påført i 5 min og intensitet forbedret ved å inkubere de delene CuSO
4 i 5 min. Cellekjerner ble kontra med Mayers Hematoxylin (Sigma, St. Louis, MO). Polymerbasert IHC utført på en Bond-Max Autostainer (Leica Micro, Bannockburn, IL), som beskrevet [27], bortsett fra at antigenet henting ble utført med pepsin og 6.2A1 anti-ανβ6 MAb (0,5 ug /ml) brukt som en primær antistoff. Isotype IgG1 (R 0,001); betydelig høyere i frontal sammenlignet med normalt vev (n = 302, p 0,001); og litt høyere i den sentrale sammenlignet med tilsynelatende normal slimhinne (n = 253, p = 0,049) (tabell 2). Intensitetene av ανβ6 uttrykk mellom endetarmskreft Trinn B og C vev viste ingen forskjell i hver mottok en verdi (figur 1). Ikke-spesifikk binding ble undersøkt ved bruk av relevante isotype kontroll MAb og ble vist i alle tilfeller til å være uten betydning.
Det var ingen forskjell i fargemønstre innenfor hver mottok en verdi (0, 1 eller 2 eller 3) mellom endetarmskreft trinn B og C vev. (C): IgG1 negativ kontroll. Skala:. 200 mikrometer
Følg opp detalj
I 110 (30,4%) pasienter som ikke hadde dødd, overlevelsestiden varierte fra 103 måneder til 245 måneder med en median på 171 måneder. I 243 (67,1%) av pasientene som hadde dødd, overlevelsestiden varierte fra 2 dager til 243 måneder med en median på 45 måneder. I 9 (2,5%) av pasientene som ble tapt, oppfølging tiden varierte fra 3 til 178 måneder med en median på 51 måneder.
Uttrykk for ανβ6 og pasienter overlevelse
Kaplan-Meier overlevelses tomter viste at total overlevelse var ikke signifikant relatert til enten sentralt eller frontal ανβ6 uttrykk, enten for Stage B og C kombinert eller separat (figur 2 og tabell 3).
Total overlevelse av 362 endetarmskreftpasienter (kombinert Stage B og C) ble ikke signifikant relatert til sentrale (a) eller frontal (b) ανβ6 uttrykk.
uttrykk for ανβ6 og klinisk-patologiske funksjoner
vurderingen av korrelasjon mellom inte ανβ6 uttrykk og klinisk-patologiske funksjoner indikerte at ανβ6 uttrykk ikke var forbundet med noen klinisk-patologisk funksjon (tabell 3).
klinisk-patologiske trekk ved Stage B og C endetarmskreftpasient
Total overlevelse var signifikant redusert hos pasienter i alderen 75 år eller eldre, de som hadde en Hartmanns operasjon, de med mucinkjertler eller signetring svulster, når en apikal lymfeknute ble involvert, da ≥4 noder var involvert, de med Stage C tumor , i høy grad av tumorer, i nærvær av venøse invasjon, når en tilstøtende organ eller struktur var blitt infiltrert av tumor, og hos pasienter som ikke mottok adjuvant kjemoterapi. Sammenheng mellom klinisk-patologiske funksjoner og total overlevelse i 362 pasienter er presentert i Tabell 4.
Påvisning av ανβ6 hjelp polymerbasert IHC
Polymer-baserte IHC ble utført utelukkende til oppdage ανβ6 savnet av ABC IHC test. Dette var en undersøkende verktøy for å bestemme bare ανβ6 fargeintensitet og ble ikke brukt til å måle pasientens overlevelse. En sammenligning av fordelinger av inte ανβ6 flekker intensiteter av de to IHC teknikker demonstrert at ανβ6 uttrykk ved hjelp av polymer basert IHC skjedde i mer enn 90% av alle pasienters vev i alle vurderinger (tabell 5).
diskusjon
i denne studien, vi viser at fordelingen av integrin ανβ6 ekspresjon var signifikant høyere i invasiv fronten av tumoren i forhold til den sentrale region av tumoren (p 0,001) eller histologisk normale slimhinner (p 0,001) i 362 endetarms kreft Stage B og C. Men klinisk-patologisk funksjoner og total overlevelse ble ikke statistisk assosiert med inte ανβ6 uttrykk. Denne observasjonen i motsetning til tidligere rapporter som tyder på at ανβ6 uttrykk er ofte assosiert med dårlig overlevelse i forskjellige cancere [3], [6], [11], [26], [28]. Men de andre ανβ6 studiene ble utført på svulster i flere stadier (dvs., Stages A til D), mens vår studie fokuserte bare på Stage B og C, og for første gang utelukkende på endetarmskreft prøver.
CRC er en ødeleggende sykdom som protein molekylær biosignatur er langsomt blir utforsket. En forståelse og deteksjon av disse kan bidra til riktig diagnose, prognose og behandling av CRC [2]. Det er velkjent at metastase er den viktigste årsaken til dødelighet og en ledende årsak til svikt i anti-kreft terapi [29]. Det er faktisk fastslått at en fenotypisk histologisk observerbar skiftning fra en ikke-metastatisk (Trinn B) til knutepunktet metastatisk (trinn C) er korrelert med dårlig overlevelse [1]. På et molekylært nivå, er bryteren av kreftceller fra en epitelial til mesenchymale fenotype kombinert med nedbrytning av ECM og andre sentrale biologiske prosesser som fremmer metastasering. Viktige regulatorer som kan modulere disse biologiske prosesser er tap av E-cadherin, aktivering av TGF-β1, økning i proteolytiske systemer, som MMPs, urokinase-plasminogen-aktivator (uPA) og den uPA-reseptoren (uPAR) [13], [30]. Viktigere, integrin ανβ6 er sterkt assosiert med mange av prosessene i disse regulatorene virker på, blant annet MAPK-reaksjonsveien, en av de primære signalveier involvert i transformasjonen, proliferasjon, invasjon og metastasering av CRC [3], [31]. For eksempel aktiverer ανβ6 TGF-β1 ved å frigjøre dette proteinet fra et inaktivt kompleks [3]. Det er ikke overraskende derfor at ανβ6 er overuttrykt primært i prolifererende epitelceller hvor det aktiverer og fremmer «drivere» av metastasering. Våre siste upubliserte arbeider tyder på at ανβ6 samhandler med andre proteiner, som finnes oppregulert i CRC (f.eks uPAR), og dette har nå blitt bekreftet av nærhet ligation analysen og peptid array. Det er ikke kjent om interaksjoner med andre molekyler som kan modulere biologien til ανβ6 gitt at uPAR er en multi-funksjonell celleoverflatereseptor involvert i både ECM degradering og cellulær signalisering [32], så vel som å være et dårlig prognostisk faktor på CRC overlevelse [ ,,,0],33].
Ikke bare gjøre våre resultater rekapitulere tidligere studier som viser ανβ6 uttrykk i prolifererende epitelceller, men de bekrefter at ανβ6 er epitel-begrenset i endetarmskreft. Tidligere studier har vist at ανβ6 uttrykk ble konsentrert på invaderende kanten av eggstokkreft tumor og muntlig plateepitelkarsinom [8], [9], [34]. Våre resultater bekrefter at ανβ6 er også mer høyt uttrykt ved invasiv foran i endetarmskreft enn i sentrale områder av endetarmssvulster og /eller normal slimhinne tyder ανβ6 spiller avgjørende roller i tumorcelle invasjon.
Denne studien fokusert på å kartlegge hvis du er i endetarmskreft uttrykk for ανβ6 kan være en markør av en svulst overgang fra Stage B i Stage C. to IHC fargingsprotokoller ble gjennomført og dataene fra ABC-baserte IHC bekreftet at inte ανβ6 var ikke en uavhengig prognostisk markør i disse to etapper , heller ikke var det korrelert med noen klinisk-patologisk funksjon studert. Dette resultatet var i strid med forventningene fordi ανβ6 tidligere har hatt en positiv sammenheng med pasientens overlevelse i en rekke kreftformer. Nærmere bestemt har ανβ6 blitt identifisert som en prognostisk indikator på dårlig overlevelse i CRC [11], gastrisk adenokarsinom [6], [26] og cervikal plateepitel carcinom [28], hvor CRC og gastrisk karsinom studier var basert på tumor fase I igjennom IV og livmorhals plateepitel karsinom var på pasienter som er identifisert som FIGO stadium IA gjennom IIB (tilsvarer TMN Stage i-II). Fra at CRC studie (n = 488) [11], Kaplan-Meier plott viste at ανβ6 var sterkt assosiert med overlevelse i tidlig stadium svulster (Stage I-II), men ikke for de senere stadium svulster (trinn III-IV). Tilsvarende vil en studie av 300 gastrisk karsinom pasienter [26] avslørte at ανβ6 var en potensiell risiko faktor i både tidlig (fase I-II) og sent trinn (trinn III-IV), med overlevelse mer signifikant forbindelse i tidligere enn senere tidspunkt. En fersk magekreft studie (n = 51) [6] også demonstrert ανβ6 var et dårlig prognostisk faktor, men overlevelse var ikke signifikant assosiert med scenen. Videre cervical studie (n = 85) [28] indikerte ανβ6 er et ugunstig prognostisk faktor hos pasienter mellom FIGO stadium IA2-IB1 og IB2-IIB. Totalt sett er uttrykk for ανβ6 foreslått å være involvert i de tidligere stadier av tumorprogresjon heller enn senere stadier, men våre data har avslører at ανβ6 uttrykket ikke øker mellom endetarmskreft Stages B og C, men kan forekomme tidligere.
i tillegg sammenligning av to alternative farge protokoller (polymerbasert kontra en ABC IHC metode) viste at mer følsomme polymerbasert amplifikasjon fremgangsmåte detektert ανβ6 ekspresjon i nesten alle (mer enn 90%) endetarmskreft Trinn B C vev. Disse dataene støtter også at ανβ6 uttrykket kan skje tidligere enn anticiptaed i CRC progresjon, nemlig før eller under Stage B kreft.
Tidligere studier har funnet ανβ6 uttrykk er lav eller umulig å oppdage i normal voksen epitel, men er sterkt uttrykk under sårtilheling og /eller kreft [3], [8], [34] en mulig forklaring på hvorfor ανβ6 blir utforsket som et interessant mål for kreft bildebehandling og terapi [35]. Her ανβ6 ble observert i nesten alle histologisk normale rektal mukosa mindre enn 1-2 cm fra tumor margin (dvs. ved siden av ikke-neoplastisk slimhinner, noe som tyder på at EMT-tilknyttede endringer som forekommer i det vev). Observasjonen som tilsynelatende tilstøtende ikke-neoplastisk slimhinnen uttrykker andre antigener som er involvert i kreftutvikling (f.eks EMT) støttes av en studie som viser EMT markører (α-glatt muskel aktin brev) og EMT-indusere (MMP2 TGF-β3 ) er mye uttrykt i histologisk normalt vev proksimale til brysttumoravgrensninger (dvs. = 1 cm unna) mens blir bare sparsomt uttrykk i en avstand på 5 cm fra samme tumoravgrensninger [36]. Denne studien tett på linje med våre nåværende observasjoner av ανβ6 blir uttrykt i 1 cm av endetarmskreft marginer, som ανβ6 er også kjent for å være involvert i EMT [14].
I konklusjonen, inte ανβ6 er oftere uttrykt ved invasiv foran endetarmskreft. Mens det sannsynlig spiller en viktig rolle i tumorprogresjon, betyr dette integrin ikke opptre som en uavhengig prognostisk markør i endetarmskreft Trinn B og C. Videre studier er nødvendig for å avgrense proteiner differensielt uttrykt i ulike stadier av endetarmskreft.
takk
forfatterne takker Paul H. Weinreb og Sheila M. Violette, fra Biogen Idec Inc., Cambridge Center, Cambridge, MA 02142, USA for vennlig å gi 6.2A1 antistoff mot inte αvβ6.
