Abstract
ADAM 17 (TNF-α converting enzyme, TACE) er et potensielt mål for kreftbehandling, men de små molekyl hemmere er rapportert hittil er ikke spesifikke for denne ADAM familiemedlem. Dette membranbundne metalloproteinase er ansvarlig for ectodomain Shedding av patologisk betydelige underlag, inkludert TNF-α og EGFR-ligander. Målet med denne studien var å evaluere farmakokinetikken, farmakodynamikk og anti-tumor effekt av den første spesifikke inhibitor, et anti-humant ADAM17 IgG-antistoff, klon D1 (A12). Vi brukte intraperitoneale xenografter av human ovarian cancer cellelinje IGROV1-Luc i Balb /c nakne mus, valgt fordi det ble tidligere rapportert at veksten av disse xenotransplantater hemmes av knock-down av TNF-α.
In vitro
, 200 nM D1 (A12) hemmet utgytelsen av ADAM17 substrater TNF-α, TNFR1-α, TGF-α, amfiregulin (AREG), HB-EGF og IL-6Rα, fra IGROV1-Luc celler (4,7 nM IC
50 for TNF-α Shedding). I IGROV1-Luc xenografter
in vivo
, D1 (A12) IgG viste farmakokinetiske egenskaper som egner seg for effektstudier, med en enkelt i.p. dose på 10 mg /kg D1 (A12) er tilstrekkelig til å opprettholde plasma IgG og ascitesvæske konsentrasjoner over 100 nM til mer enn 7 dager. Plasmahalveringstiden var 8,6 dager. Deretter ble en effektstudie utført, doserings D1 (A12) eller anti-human TNF-α antistoff infliximab ved 10 mg /kg q7d, kvantifisering IGROV1-Luc tumorbyrde ved bioluminescens. D1 (A12) IgG viste en signifikant reduksjon i tumorvekst (p = 0,005), 56% av kontroll over kjøretøyet. Overraskende, D1 (A12) ikke redusere konsentrasjonen av sirkulerende human TNF-α, noe som tyder på at et annet enzym kan kompensere for inhibering av ADAM17
in vivo plakater (men ikke
in vitro
). Men D1 (A12) gjorde viser tydelige farmakodynamiske effekter i mus, med betydelig hemming av Shedding fra svulst ADAM17 substrater TNFR1-α, AREG, og TGF-α (4-15-fold reduksjoner, p 0,0001 for alle tre) . Dermed D1 (A12) har anti-ADAM17 aktivitet
in vivo
hemmer Shedding av EGFR-ligander og har potensial for bruk i EGF ligand avhengige tumorer
Citation. Richards FM, Tape CJ , Jodrell DI, Murphy G (2012) Anti-Tumor Virkninger av en bestemt Anti-ADAM17 antistoff i en Eggstokkreft Modell
In Vivo
. PLoS ONE syv (7): e40597. doi: 10,1371 /journal.pone.0040597
Redaktør: Olivier Gires, Ludwig-Maximilians-universitetet, Tyskland
mottatt: 11 april 2012; Godkjent: 11 juni 2012; Publisert: 11.07.2012
Copyright: © 2012 Richards et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskningen arbeidet i denne studien ble finansiert av Cancer Research UK (www.cancerresearchuk.org), stipend nummer C96 /A8333. Prof. Murphys Chair ble finansiert av en veldedig donasjon til Univerity of Cambridge av Hutchison-Whampoa Ltd Hun er ikke en ansatt i Hutchison Whampoa, og Hutchison Whampoa har ingen kommersielle interesser i noen av forfatternes forskning. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: CJ Tape og G . Murphy er nevnt som oppfinnere på en patentsøknad US61 /438354, som dekker antistoffet anvendt i disse studiene. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Alle forfatterne er ansatt ved Universitetet i Cambridge. Forfatterne hevder at ingen andre konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
TNF-α konvertering enzym (TACE, ADAM17) er et membranbundet metalloproteinase ansvarlig for spalting og ectodomain Shedding av TNF-α, EGFR-ligander og andre patologisk betydelige underlag. Feilregulering av ectodomain Shedding er assosiert med autoimmune og hjerte-karsykdommer, nevrodegenerasjon, infeksjon, betennelse og kreft [1].
ADAM17 har vært innblandet i mange kreftformer. Det er overuttrykt i eggstokk-kreft [2], brystkreft [3], [4], bukspyttkjertel ductal adenokarsinom [5], kolorektalt karsinom [6], gastrisk cancer stamceller [7], GIST [8], ikke-småcellet lungekarsinom [9], og hode- og halskreft [10], [11]. ADAM17 er rapportert å ha en direkte funksjonell rolle i å kontrollere proliferasjon og /eller migrering av celler avledet fra mange tumortyper, [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18] , [19], [20], og det har vært implisert i å kontrollere endotelial cellemigrering [21] og patologisk angiogenese [22], [23], som også er relevant for tumorvekst. ADAM17 kan aktiveres ved kjemoterapi, noe som resulterer i vekstfaktor utstøtingen, dermed bidrar til motstand i kolorektal kreft modeller [15], [24]. ADAM17 kan også bidra til resistens mot trastuzumab (Herceptin
TM) i brystkreft [25]. Dermed gjør ADAM17 et attraktivt mål for utvikling av inhibitorer, noe som ville ha bredspektret terapeutisk potensiale ved behandling av pasienter med kreft.
Små molekylære inhibitorer av ADAM17 er blitt utviklet, men ingen har likevel vist seg fullstendig spesifisitet for ADAM17 . For eksempel, INCB3619 og INCB7839 hemme ADAM10, ADAM17 og matriksmetalloproteinaser MMP2, MMP12 og MMP15 [9], [26], [27], [28]. De to ADAM17 hemmere som har kommet lengst i utviklingen [29] er DPC 333 (BMS-561392) [30] og TMI-005 (apratastat) [31]. Disse både vise litt hemmende aktivitet mot andre MMP og ikke komme lenger enn til fase II studie på grunn av toksisitet eller mangel på effekt. Bredspektret MMP-hemmere (marimastat, prinomastat, tanomastat), som også hemmer Adams, har ikke kommet lenger enn kliniske fase III-studier på grunn av manglende effekt og betydelig toksisitet [32], [33], [34], [35], tyder på at spesifisiteten er viktig ved utvikling av metalloproteinase inhibitorer.
Et spesifikt humant ADAM17 inhiberende antistoff, D1 (A12), har nylig blitt utviklet, noe som hemmer proteolyse av ADAM17 substrater (TNF-α, AREG, etc., ) i kreftceller
in vitro product: [36]. Målet med de rapporterte her studiene var å vurdere hensiktsmessigheten av D1 (A12) antistoff for terapeutisk bruk, ved å undersøke dets farmakokinetikk, farmakodynamikk og anti-tumor effekt hos mus. Vi valgte å bruke IGROV1-Luc modell av eggstokkreft, som har blitt rapportert å være TNF-α- avhengig [37].
Høye nivåer av uttrykk av TNF-α har blitt observert i ovarialcancer [38 ], [39], [40], spesielt i høy grad serøs typen [41], og et anti-TNF-α antistoff, infliximab (Remicade
TM), er blitt undersøkt for sin effektivitet mot ovariekreft [42 ]. Den IGROV1-Luc modellen er en menneskelig svulst xenograft modell av intraperitoneal spres ovarialcancer. IGROV1-Luc-celler utskiller TNF-α og knockdown av TNF-α ekspresjon ved transfeksjon av IGROV1-Luc-celler med anti-TNF-α shRNA ble rapportert tidligere for å hemme tumorvekst [37]. Inhibering av ADAM17 av D1 (A12) antistoff var ventet å inhibere TNF-α sekresjon og derved hemme veksten av IGROV1-Luc tumorer
in vivo
. For sammenligning ble en gruppe mus som ble behandlet med infliximab, noe som var forventet å direkte redusere funksjonell human TNF-α, også fører til hemming av vekst av IGROV1-Luc tumorer.
Materialer og Metoder
antistoffer og kjemikalier
Isolering og rensing av humant anti-ADAM17 antistoff D1 (A12) er blitt beskrevet tidligere [36]. I korte trekk ble D1 (A12) IgG uttrykt ved transfeksjon av HEK293-celler og kondisjonert medium ble oppsamlet. Antistoffet ble renset fra mediet ved kromatografi på 2 protein L kolonner (Pierce) etterfulgt av 2 Melon Gel søyler (Pierce) og AKTA FPLC, og deretter dialysert i sterilt fosfatbuffret saltvann (PBS), pH 7,4 og filtersterilisert. Infliximab (Remicade
TM, Janssen Biotech Inc.), en slags gave fra professor Peter Taylor (Kennedy Institute of Rheumatology), ble oppløst i sterilt saltvann. Tak humant plasma IgG (R D Systems DuoSet kits: human TNF-α (TNFSF1A, katt nr DY210.), human løselig TNFR1-α (TNFRSF1A, katt nr DY225.), human TGF-α (katt nr DY239.), human AREG (kat nr. DY262), humant IL-6Rα (kat. Nei DY227) og human HB-EGF (DY259). Den DY210 kit ble bekreftet å være spesifikt for humant TNF-α ved å teste mus rekombinant TNF-α med dette settet, var det ingen kryss-reaktivitet.
Hvor tumor homogenater ble anvendt rå nM konsentrasjoner i homogenat løsning var omregnet til nmol pr mg vev, og deretter ved hjelp av den antagelse at vevet tetthet 1 g /ml, den molare konsentrasjon i vev ble beregnet.
Immunhistokjemi
Immunhistokjemi ble utført på formalinfiksert, parafin-innleiret deler av tumor og lever etter antigen gjenfinning av enzymkutting (proteinase k) ved 37 ° C i 10 minutter. Den humane IgG hvormed musene var blitt dosert (D1 (A12) eller infliximab) ble detektert ved binding av en biotin-SP-konjugert AffiniPure F (ab «) 2-fragment esel anti-humant IgG (H + L) (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.), etterfulgt av farging med DAB + kromogen. Lysbilder ble skannet med en ScanScopeXT (Aperios Technologies, Inc.) på 20X forstørrelse og skannede bilder ble vist ved hjelp av Spectrum v10 programvare (Aperios Technologies Inc). Ingen bildemanipulering ble utført.
Resultater
Effekt av D1 (A12) antistoff i IGROV1-Luc celler
in vitro
IGROV1-Luc tumorceller
in vitro
utskilt TNF-α, TNFR1-α, TGF-α, AREG, HB-EGF og IL-6Rα, alle kjente substrater for avgivelse aktiviteten av ADAM17, i dyrkningsmediet, selv når ustimulerte (figur 1A). Når de ble stimulert med PMA konsentrasjonene av disse proteiner utskilles i mediet økes minst 5 ganger (bortsett fra IL-6R α, 2,7 gangers økning). Dette PMA-stimulert vekst ble inhibert ved tilsetning av 200 nM D1 (A12) IgG (figur 1A). Inhiberingen av TNF-α utstøtingen av D1 (A12) var doseavhengig, med en IC
50 IGROV i cellene i 4,7 nM (figur 1B). D1 (A12) var en mer potent inhibitor av TNF-α avgivelse enn N-TIMP-3 (IC
50 av 72 nM), en naturlig-metalloproteinase-inhibitor som tidligere vist å hemme ADAM17 [43]. D1 (A12) IgG også hemmet konstitutiv utstøtingen av TNF-α i mediet over en lengre periode (figur 1C). D1 (A12) inhiberte ikke proliferasjonen av IGROV1-Luc-celler
in vitro
i nærvær av normal vekstmedium (data ikke vist), som er i overensstemmelse med effekten av TNF-α shRNA på IGROV1-Luc celler som tidligere rapportert [37].
(A) D1 (A12) IgG hemmer PMA-indusert utgytelsen av ADAM17 substrater til IGROV1-Luc cellekulturmedium. Medium ble samlet 90 minutter etter tilsetting av PMA (100 ng /ml), D1 (A12) IgG (200 nM) eller løsningsmiddelkontroll. Proteinene ble kvantifisert ved hjelp av ELISA. (B) Doseavhengig inhibering av TNF-a α shedding av en time forbehandling med D1 (A12), N-TIMP-3 eller kontroll humant plasma IgG før PMA stimulering. (C) D1 (A12) IgG hemmer konstituerende utgytelsen av TNF-α fra IGROV1-Luc celler i kulturmediet. Medium ble samlet etter 48 timers inkubering med og uten IgG ved 200 nM. Feilsøylene viser standardavviket.
IGROV1-Luc Tumor vekst
in vivo
De IGROV1-Luc cellene vokste og spres intraperitonealt i hårløse mus (Figur 2A ), som tidligere rapportert [37], med individuelle tumormasser som viser et histologisk utseende i overensstemmelse med human høy grad serøs eggstokk-adenokarsinom (M. Jimenez-Linan, personlig kommunikasjon). De største forekomster av svulsten var i bukspyttkjertelen, omentum og mesentery av alle mus. Ved endepunktet rundt dag 32-35, hadde tumorbærende mus utviklet peritoneal eksudat (ascites væske). Human TNF-α, TNFR1-α, TGF-α, amfiregulin (AREG), og HB-EGF (ADAM17 substrater) ble detektert i sirkulasjon av IGROV1-Luc tumor-bærende mus, med høy konsentrasjon i ascites fluid og lavere konsentrasjoner i plasma (som vist på bærerkontrollgruppene effekt studien, vist senere).
(A) Eksempel på veksten av IGROV1-Luc intraperitoneal tumor, målt ved bioluminescens, fra 11 til 29 dager etter injeksjon av cellene. (B og C) Farmakokinetikk av D1 (A12) i nakne mus etter en enkelt dose på 10 mg /kg i.p. N = 2 eller flere mus per tidspunkt. Feilstolper representerer standardfeil av middelverdien (B) Plasmakonsentrasjonene i ikke-tumorbærende mus. (C) Plasma og ascitesvæske konsentrasjoner i IGROV1-Luc tumorbærende mus. (D) D1 (A12) IgG i mus plasma: kapasitet for binding til ADAM17 og FcγR1. Plasma ble oppsamlet ved de indikerte tidspunkter etter dosering musene med en enkelt dose på 10 mg /kg D1 (A12). Bindingsaktivitet
in vitro
ble sammenlignet med bindingskapasitet av D1A12 stamløsning. Feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet.
farmakokinetikk D1 (A12) IgG
farmakokinetikk (PK) av D1 (A12) antistoff ble undersøkt ved hjelp av en enkelt 10 mg /kg dose ip, i ikke-tumorbærende mus (figur 2B). Farmakokinetiske parametre ble beregnet for ikke-tumorbærende mus bruker WinNonlin noncompartmental analyseprogram: plasma C
max = 523 +/- 58 nm, T
maks 2 dager, halveringstid 8,6 dager. Mer begrenset antall prøver ble så utført i mus som bærer IGROV1-Luc tumorer (figur 2C), hvori D1 (A12) IgG viste lignende kinetikken til den ikke-tumorbærende mus. Etter en 10 mg /kg dose i.p. C
max var 425 +/- 51 nM i plasma og 391 +/- 19 nM i ascitesvæsken, lavere enn plasma C
max i mus uten tumor. Disse data var tilstrekkelige til å forutsi den sirkulerende D1 (A12) konsentrasjoner på over 100 nM kan opprettholdes ved dosering 10 mg /kg en gang hver 7. dag. 100 nM D1 (A12) er tilstrekkelig konsentrasjon til å forårsake maksimal inhibering av ADAM17 funksjon i IGROV1 cellekultur (figur 1B).
deteksjon av D1 (A12) antistoff ved hjelp av ELISA betyr ikke nødvendigvis at antistoffet hadde beholdt dets aktivitet, som det kunne være delvis denaturert, slik at bindingsaktiviteten av plasmaet D1 (A12) antistoff ble bestemt (figur 2D og fig S1). D1 (A12) antistoff fra plasmaet hos mus ved alle tidspunkter fra 1 til 9 dager beholdt evnen til å binde ADAM17 (100% på dag 9, sammenlignet med den D1 (A12) stamløsning). I motsetning til dette, evne til D1 (A12) for å binde seg til human FcγR1 redusert med tiden, med bindingen etter 9 dager i mus bare 32% av bindingen av D1 (A12) stamløsning.
effektivitetsstudier og farmakodynamikken
Etter å ha fastslått at D1 (A12) antistoff har egnede farmakokinetiske egenskaper, testet vi effekten av ukentlig dosering i IGROV1-Luc-xenografter med 10 mg /kg D1 (A12) (n = 11), i sammenligning med 10 mg /kg infliximab (n = 8) og PBS bærer (n = 12). Før første dose på dag 4 etter celleinjeksjon var det ingen signifikant forskjell i tumorbelastning mellom gruppene: Gjennomsnittlig Radiance (x 10
6 p /s /cm
2 /Sr) 2,71 +/- 1,35 , 2,92 +/- 1,23 og 2,65 +/- 0,91 for kjøretøy, infliximab og D1 (A12) grupper, henholdsvis. Tumor størrelse ved endepunktet på dag 32 er presentert i figur 3. D1 (A12) gruppe hadde en betydelig mindre tumorbyrde (Gjennomsnittlig Radiance x 10
6 p /s /cm
2 /Sr) på dag 32 på 23,3 +/- 9,1 sammenlignet med bærergruppen (41,8 +/- 17,2, p = 0,005). Gjennomsnittlig tumorbyrde i D1 (A12) gruppe på endepunktet var 56% av bilen kontroll. I motsetning til dette var det ingen hemning av tumorvekst i mus behandlet med infliximab i forhold til kjøretøyet, med tumorbelastning på 39,1 +/- 11,6 i infliximab gruppen (p = 0.68).
Vekst av IGROV1-Luc i.p. xenotransplantater i mus doseres ukentlig med kjøretøyet, 10 mg /kg infliximab eller 10 mg /kg D1 (A12), målt ved bioluminescens. Gjennomsnitt og standardavvik på dag 32 tumorbyrden er vist, uttrykt som Gjennomsnittlig Radiance. N = 12 for kjøretøy, n = 8 for infliximab og N = 11 for D1 (A12).
For å bekrefte at terapeutiske konsentrasjoner av antistoff hadde blitt oppnådd, konsentrasjonen av D1 (A12) og infliximab ble bestemt i plasma og ascites fluid (figur 4A), og i tumor homogenater (figur 4B). Som forventet ble det ikke humant IgG påvist i noen av prøvene fra den bærer-behandlede gruppe. D1 (A12) og infliximab var til stede i høye konsentrasjoner i plasma og ascites fluid i den aktuelle behandlingsgruppen, og begge antistoffer var detekterbare i tumor både fra pankreas og omentum. Konsentrasjonen av D1 (A12) var høyere i tumor enn infliximab, men infliximab var høyere i plasma og ascitesvæsken enn D1 (A12).
Prøver ble tatt ved endepunkt (dag 33), 20 timer etter den siste antistoff dose. (A) Konsentrasjonen i plasma og ascitesvæske. Horisontale stenger representerer gjennomsnittet og standardavvik. (B) Konsentrasjoner i homogenates av vev fra svulsten i bukspyttkjertelen og omentum. (C) Immunhistokjemi for å påvise humant IgG i IGROV1-Luc tumor og lever. Topp: mus-ID 901, behandlet med D1 (A12), med en pil som angir posisjonen av et blodkar; midten: mus ID 903, behandlet med infliksimab; bottom: mus-ID 902, behandlet med bærer. Bilder ble tatt på 20X forstørrelse.
For å undersøke fordelingen av D1 (A12) og infliximab i svulstvev, ble anti-human IgG immunhistokjemi utført på parafinsnitt fra svulstene (figur 4C). De to terapeutiske antistoffer var påvisbare like sterk IHC flekker i leveren, og begge var også påvises i svulstvev, men fordelingen ut til å være begrenset til blodårene.
For å avgjøre om enten antistoff hadde farmakodynamiske effekter vi analyserte konsentrasjoner i plasma og ascitesvæske av produktene av ADAM17 sheddase aktivitet, dvs. oppløselig humant TNF-α, oppløselig TNFR1-α, TGF-α og amfiregulin (AREG) (figur 5). Alle fire av proteinene analysert viste signifikant høyere konsentrasjoner i ascites væske enn i plasma. Som forventet, var det en signifikant reduksjon i sTNF-α i ascitesvæsken fra infliximab-behandlede mus sammenlignet med bærer (3,7 gangers reduksjon, s 0,0001). Overraskende, var det ingen signifikant reduksjon i sTNF-α i D1 (A12) -behandlet mus (P = 0,06). Imidlertid D1 (A12) gjorde viser tydelige farmakodynamiske effekter ved i betydelig grad å redusere ascitesvæske konsentrasjoner av løselig TNFR1-α (4,4 gangers reduksjon, P 0,0001), AREG (5,4 gangers reduksjon, P 0,0001) og TGF-α ( 15-fold reduksjon, P 0,0001). D1 (A12) også reduseres i betydelig grad plasmakonsentrasjonen av oppløselige TNFR1-α (P 0,0001), AREG (P = 0,012) og TGF-a (P = 0,005)
konsentrasjoner av de spaltede produkter av ADAM17. substrater i plasma og ascites fluid ved endepunktet (dag 33), målt ved ELISA. Horisontale stenger representerer gjennomsnittet og standardavvik. Stjerner viser gruppene signifikant forskjellige (P 0,05). Fra PBS-kontrollgruppen på samme fluidtype
diskusjon
Vi har undersøkt den biologiske aktivitet av D1 (A12), et monoklonalt antistoff som er spesifikt for humant ADAM17, som hemmer ADAM17 funksjon av flere domener inhibering av ectodomain. Vi har vist at antistoff (ved nanomolare konsentrasjoner) hemmer Shedding av ADAM17 underlag, inkludert TNF-α og AREG i IGROV1-Luc celler
in vitro
.
PK egenskapene til D1 (A12 ) IgG i mus ble funnet å være egnet for effektivitetsstudier. Plasmahalveringstiden er i overensstemmelse med publiserte verdier for halveringstiden for humane IgG-antistoffer i mus plasma [46]. Plasmaet og ascites C
max er lavere i den tumorbærende mus enn i plasma C
max i mus uten tumor. Dette er imidlertid ikke overraskende gitt større kroppens totale væskevolum i de tumorbærende mus på grunn av ascitesvæske rommet. Plasma og ascites fluid konsentrasjoner av D1 (A12) IgG var svært like innenfor hver enkelt mus, fra både PK og effektivitetsstudier, noe som tyder på at antistoffet er i stand til å stabilisere seg mellom disse to kammere etter enten IP eller IV dosering. Vi har vist at D1 (A12) antistoff er strukturelt stabilt i mus sirkulasjon, har beholdt evnen til å binde til humant ADAM17 opp til 9 dager etter dosering. Imidlertid er evnen til D1 (A12) for å binde seg til human FcγR1 redusert med tiden i mus plasma, slik at kun 32% av bindingsaktiviteten holdt seg etter 9 dager i mus. Den reduserte FcγR1 Bindingskapasiteten kan skyldes løselige Fc-reseptorene som er tilstede i museserum. For eksempel binder mus FcRN humant IgG1 med høy affinitet [47] og er ansvarlig for det lange
in vivo
halveringstid av antistoffer [48].
PK egenskaper og stabilitet av D1 (A12) IgG i muse sirkulasjon indikerte at ukentlig dosering bør holde konsentrasjoner høye nok til å være biologisk aktive
in vivo
, så effektstudier ble utført i IGROV1-Luc modell. D1 (A12) antistoff viste antitumoreffekter, med tumorbelastning ved slutten av studien ca. 56% av kjøretøyet kontrollgruppen. Dette var en beskjeden anti-tumor effekt, og noen mulige forklaringer på dette er omtalt nedenfor.
Tumor homogenates hadde konsentrasjoner av D1 (A12) IgG over mobilnettet IC
50, men analyse av IHC viste begrensede gjennomtrengning utover tumorblodkarene. Lignende begrenset gjennomtrengning er blitt observert i xenografttumorer for høyaffinitets anti-HER2-antistoff trastuzumab [49], som er ikke desto mindre et effektivt medikament
in vivo
. Fordeling av monoklonale antistoffer til tumorvevet har vist seg å være begrenset av gjennomtrengning gjennom kapillære vegger og også av andre faktorer, når antistoffet har krysset karveggen [50]. Penetrasjon av D1 (A12) kan være bedre i tumorer med mer permeable fartøy enn de i IGROV1 svulster. Men visste begrenset svulst penetrasjon av D1 (A12) IgG i IGROV1-Luc svulster ikke hindre antistoff forårsaker klare farmakodynamiske effekter (Shedding av ADAM17 underlag, se nedenfor). Interessant, D1 (A12) konsentrasjonen var høyere i tumor enn infliximab, men lavere i plasma og ascitesvæsken enn infliximab, kanskje som følge av plasseringen av målet for hvert antistoff (ADAM17 på tumorcelleplasmamembranen versus sirkulerende TNF-α som er til stede i høye konsentrasjoner i plasma og ascites).
for å avgjøre om antistoffene ble trykket sine mål og har farmakodynamiske effekter, ble ELISA-analyser av ADAM17 underlag utført på plasma og ascites væskeprøver på slutten av effekt studere. mus vehikkelbehandlede viste mye høyere konsentrasjoner av løselige TNF-α, TNFR1-α, AREG og TGF-α i ascitesvæske enn i plasma, noe som tyder på at disse proteinene ikke fritt likevekt mellom plasma og ascites kamre, i motsetning til den doserte IgG som gjorde likevekt mellom avdelingene.
Sammenligning av D1 (A12) behandlede gruppen med bilens kontroller viste at D1 (A12) fant signifikant hemmer Shedding av ADAM17 underlag, ligander EGFR TGF-α og AREG, og TNFR1-α. Men D1 (A12) ikke signifikant hemmer TNF-α Shedding
in vivo
, som var overraskende fordi TNF-α Shedding ble hemmet av D1 (A12) i IGROV1-Luc celler
in vitro
. Mangelen på inhibering av TNF-α shedding
in vivo
kan forklare den relativt beskjedne antitumoreffekt av antistoffet, fordi TNF-α ble antatt å være en nøkkelkomponent av tumorvekst i denne modellen, basert på shRNA arbeidet med Kulbe,
et
al product: [37], men infliksimab data forundrer denne hypotesen (se nedenfor).
ADAM17 har vært betraktet som nøkkelen enzym som er ansvarlig for Shedding av TNF-α, men våre resultater med (A12) antistoff D1 tyder på at et annet enzym kan kompensere når ADAM17 aktivitet hemmes i IGROV1-Luc celler dyrket
in vivo plakater (men ikke
in vitro
). Dette kan være ADAM10: ADAM10 har vist TNF-α sheddase aktivitet i ADAM17-manglende murine fibroblaster [51], og har vært implisert i TNF-α produksjon i mantle celle lymfom [52]. Også Hikita et al [53] har vist at mens ADAM17 er faktisk den store TNF-α sheddase i makrofager, er ADAM10 også en TNF-α sheddase i adenovirus-transformerte humane embryo nyre 293a fremstilte celler, NIH3T3-mus embryo fibroblaster og murine endotelceller. Også når uttrykt, kan ADAM19 være i stand til å bidra til TNF-α Shedding [54]. Disse dataene antyder at for hemming av TNF-α Shedding fra svulster
in vivo
, kan kreves hemming av både ADAM17, ADAM10 og ADAM19. I
in vivo
studier kreftceller ville ha vært utsatt for D1 (A12) i 28 dager, og hvis de kompensatoriske mekanismer var treg til å utvikle seg, dette kan forklare hvorfor denne kompensasjonen ikke ble observert i
in vitro
analyser som ble utført i løpet av 48 timer eller mindre. En annen mulig forklaring på den manglende hemming av TNF-α Shedding
in vivo
er at Shedding i trans ha oppstått, hvor murine ADAM17 på vertsceller, som ikke ville bli regulert av D1 (A12), kunne kløyve TNF-α på tilstøtende humane tumorceller. Så vidt vi vet trans-Shedding ikke har blitt rapportert for ADAM17, men det har for ADAM10 spalting av Efrin A5 [55].
