Abstract
Uttrykket av protein fosfatase 32 (PP32, ANP32A) er lav i dårlig differensierte bukspyttkjertel kreft og er knyttet til nivåene av Hur (ELAV1), en prediktiv markør for gemcitabin respons. I kreft i bukspyttkjertelen celler, eksogene overekspresjon av pp32 hemmet cellevekst, støtter sin lange anerkjent rolle som en tumor suppressor i bukspyttkjertelkreft. I kjemoterapeutiske følsomhetsscreeninganalyser, celler som overuttrykker pp32 ble selektivt bestandig overfor nukleosid-analogene gemcitabin og cytarabin (Ara-C), men ble sensibilisert overfor 5-fluorouracil; omvendt, tie pp32 i kreft i bukspyttkjertelen celler forbedret gemcitabin følsomhet. De cytoplasmatiske nivåene av pp32 øket etter kreftceller blir behandlet med visse stressfaktorer, inkludert gemcitabin. pp32 overekspresjon redusert foreningen av Hur med mRNA som koder for gemcitabin-metaboliserende enzymet deoksycytidinkinase (dCK), forårsaker en betydelig reduksjon i DCK protein nivåer. Tilsvarende skyldes ektopisk pp32 uttrykk en reduksjon i Hur binding av mRNA som koder tumor-fremme proteiner (f.eks VEGF og Hur), mens støydempere pp32 dramatisk forbedret bindingen av disse mRNA mål. Lav pp32 atom uttrykk korrelert med høy grad av svulster og tilstedeværelsen av lymfeknutemetastaser, i forhold til pasientenes svulster med høy atom pp32 uttrykk. Selv pp32 uttrykk nivåer ikke forbedre prediktiv kraft cytoplasma Hur status, atom pp32 nivåer og cytoplasmatiske Hur nivåer forbundet betydelig i pasientprøver. Derfor gir vi roman bevis på at tumor suppressor funksjon pp32 kan tilskrives dens evne til å forstyrre Hur binding til målet mRNA som koder viktige proteiner for kreft celle overlevelse og legemidlets effekt
Citation. Williams TK, Costantino CL , Bildzukewicz NA, Richards NG, Rittenhouse DW, Einstein L, et al. (2010) pp32 (ANP32A) Expression Hemmer bukspyttkjertelkreft cellevekst og induserer gemcitabin Motstand ved Forstyrre Hur Binding til mRNA. PLoS ONE 5 (11): e15455. doi: 10,1371 /journal.pone.0015455
Redaktør: Janine Santos, medisinske og odontologiske av New Jersey, USA
mottatt: 26. juli 2010. Godkjent: 26 september 2010; Publisert: 29.11.2010
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
Finansiering:. JRB ble støttet av en Career Development Award fra PanCAN, den amerikanske foreningen for kreftforskning; midler fra American Cancer Society (# IRG-08-060-01), og fondet for en kur, Newtown, PA. MG ble støttet av National Institute on Aging-utført Research Program, National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
bukspyttkjertelen adenokarsinom (PDA) er en aggressiv kreft med en dårlig prognose, selv etter kirurgisk reseksjon [1], [2]. Mens 5-fluorouracil (5-FU) og gemcitabin (GEM) med eller uten strålebehandling utgjør standard behandling i adjuvant behandling, de gir liten forbedring i langtidsoverlevelse [3], [4], [5]. Derfor er en bedre forståelse av ervervet og
de novo
kjemoterapeutiske resistensmekanismer er nødvendig for oss å forbedre dagens behandlingsstrategier. Selv om mye har blitt lært om de molekylære endringer som er involvert i prosessen med bukspyttkjertelen tumorigenesis, har det vært liten suksess i vår forståelse av hvorfor kreft i bukspyttkjertelen celler er resistent mot kjemoterapi [6], [7].
pp32 ( ANP32A) har et unikt mønster av ekspresjon i mange humane cancere [8], [9], [10], [11]. pp32 fungerer som en tumor suppressor protein [12], som vist ved dets evne til å inhibere
K-ras
-formidlet malign transformasjon [13], [14]. Vi viste tidligere at pp32 uttrykk korrelerer med differensiering status for PDA, med normale uttrykk nivåer oppdaget i godt differensierte svulster, men redusert til fraværende uttrykk nivåer i dårlig differensierte svulster [14]. Disse funnene er viktig fordi dårlig differensierte former for PDA er både vanlig og aggressiv, men lite er forstått om de spesifikke molekylære egenskapene til denne formen for PDA [15]. I en tidligere studie, innføring av pp32 inn i en dårlig differensiert pankreas-cellelinje som skyldes cellesyklus-stans og inhiberte cellevekst [14].
pp32 har vist seg å være en bindingspartner av flere viktige proteiner [14], [16], [17], [18], [19]. Tidligere arbeid har vist at pp32 er involvert i: 1) for stabilisering av visse mRNA-er som bærer AU-rik elementer (Ares) i de 5 «og 3» utranslaterte regioner (UTR) via interaksjonen av pp32 med RNA-bindende protein Hur (ELAVL1) [18]; 2) modifikasjon av histon-acetylering gjennom dens rolle i den hemmer av acetyl transferase kompleks (betegnet INHAT) [17]; og 3) modulering av cellesyklusen gjennom dets interaksjon med fosforylerte formen av Rb [18], [19], [20], [21].
Nylig har vi også oppdaget at en bindingspartner av pp32, Hur [18], [22], er sentral i GEM effekt mot kreft i bukspyttkjertelen celler [23]. Vi viste at Hur kan assosiere med deoksycytidinkinase (dCK) mRNA og dermed regulere dCK protein uttrykk [23]. Denne foreningen er forbedret når kreft i bukspyttkjertelen celler blir utsatt for GEM. Ved GEM eksponering, DCK nivåene øker for å forbrenne GEM (en nukleosid analog) fra en prodrug til dets aktive metabolitter. Følgelig pasienter behandlet med GEM som resected svulster uttrykt forhøyede cytoplasmatiske Hur nivåer hadde en 7 ganger økning i overlevelse sammenlignet med pasienter med resected svulster som uttrykker lav cytoplasma Hur [23]. Denne tidligere arbeid gir rammene for å utforske Hur og beslektede proteiner (pp32) i sammenheng med kjemoterapeutiske effekt [24].
Den eksakte rolle pp32 som en tumor suppressor gen og i sin rolle i Hur post-transcriptional regulering av målet mRNA er i stor grad ukjent. Tidligere pp32 co-immunopresipitert med Hur i cellekultur modeller, og det ble vist at pp32 er RNA anerkjennelse motivene var avgjørende for dette samspillet [18]. Videre har forskjellige etterforskere hevdet at pp32 er strengt kjernekraft eller cytoplasma. Brennan
et al.
Først beskrevet pp32 som et protein som kan shuttle mellom kjernen og cytoplasma sammen med Hur [18]. Basert på dette arbeidet, søkte vi å utforske funksjonelle koblinger mellom pp32 og Hur i forhold til kreft i bukspyttkjertelen celle overlevelse (dvs. kreft celle vekst og GEM effekt).
Metoder
Etablering av isogen pp32 -overexpressing og kontrollcellelinjer
MiaPaCa2-celler ble transfektert ved bruk av Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA). Full-lengde pp32 cDNA ble subklonet inn i plasmid pc3.1 Zeo (Invitrogen), som besitter en Zeocin ™ resistens-genet for seleksjon som tidligere beskrevet [14], [23].
For hver prøve ble 5 uL av KONTROLLER Antigen Standard Origene overekspresjon lysat (1 ug /1UL) ble plassert med 5 ul 2x SDS prøvebuffer (OriGene Rockville, Maryland). Overekspresjon av pp32, Hur, eller tom vektor ble drevet av en pCMV6-Entry Vector plasmid som har lagt en C-terminal Myc /DDK tag til hvert gen (OriGene). Prøvene ble fremstilt og deretter lastet på en NuPage 10% Bis-Tris gel og separeres ved 200 volt i 60 minutter. Proteiner ble så overført til en PDVF-membran ved 30 volt i 90 minutter. Membranen ble blokkert i 1 time. Membranene ble undersøkt med primære antistoffer (tymidylatsyntase, DCK, pp32, Hur og alpha-tubulin, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) over natten. Konsentrasjonene for primær antistoff var som følger: Hur 1:1000, dCK 1:500, TS og alpha tubulin 1:200. Probet antistoffer ble deretter vasket med TBST oppløsning og sekundært antistoff ble påført med Santa Cruz geite-anti-muse-IgG-HRP-antistoff i en konsentrasjon på 1:10,000. Membraner ble deretter vasket og utviklet ved hjelp av Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrat deteksjon system (Millipore, Billerica, MA).
Transient transfeksjon av pp32 ekspresjonsvektor og siRNA for ribonucleoprotein immunoprecipitation binding (RNP-IP) analyser.
Transient transfeksjon ble utført som beskrevet ovenfor. siRNA knockdown ble utført ved anvendelse av en pp32 utformet liten interfererende siRNA (Dharmacon, Thermoscientific) ved bruk av oligofectamine (Invitrogen) som tidligere beskrevet [9], [23]. I korte, bukspyttkjertelkreft cellelinjer PL5 og MiaPaca2 celler ble sådd ut i 60% samløpet og transfektert i Oligofectamine og OptiMem (Invitrogen) med pp32 siRNA og en negativ kontroll scramble sekvens (Dharmacon). Celler ble samlet etter 48 timer for immunoblot, følsomhetsanalyser, og RNP-IP-analyser.
Isolering av RNA og genomisk DNA påvisning av plasmider
For å bekrefte overekspresjon og reduksjon av pp32 mRNA i cellen linjer, ble semikvantitativ RT-PCR utført. MiaPaCa2 pp32-transfektert (Mia.pp32) og tom vektor (Mia.EV) celler ble trypsinert og samlet som tidligere beskrevet [25] og vår generert gjøre novo hjelp av tidligere genererte og kjøpte foreldrebukspyttkjertelkreft cellelinje (ATCC, Manassas, VA ). Genomisk DNA ble isolert fra Mia.pp32 og Mia.EV cellelinjer og plasmid integrering ble bekreftet ved å utføre PCR med et fremre primer er spesifikk for T7-sekvensen av plasmidet, og en revers primer spesifikk for pp32: FWD 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3 « , REV 5»-CAGGTTCTCGTTTTCGCTTC-3 «.
Total RNA ble isolert ved anvendelse av RNeasy RNA isolering kit (Qiagen) og deretter behandlet med Turbo-DNA
fri plakater (Ambion, Austin, TX) til eliminere spormengder av gDNA [25].
ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP) og sanntids kvantitativ PCR (qPCR).
Celler ble sådd ut i 65% konfluens og behandles som angitt. Immunoutfelling ble utført ved anvendelse av enten anti-Hur eller anti-IgG-kontrollantistoffer som tidligere beskrevet (MBL International, Woburn, MA) [23], [26]. RT-PCR ble deretter utført, etter at massen normalisering av RNA prøver, for å danne cDNA. Optisk tetthet av cDNA ble målt og RT-kvantitativ PCR (qPCR) ble utført på en ABI 7500-instrument; 75 ng av cDNA-templat ble anvendt pr reaksjon for å bestemme den relative overflod av dCK, VEGF, og Hur mRNA; Prøvene ble normalisert til GAPDH mRNA nivåer.
SDS-PAGE /Western Blotting
Mia.pp32 og Mia.EV celler ble trypsinert og hel-cellelysater ble oppnådd ved hjelp av RIPA lysebuffer. Protein kvantifisering ble utført ved anvendelse av en Bradford-analyse (Bio-Rad, Hercules, CA). Eksempel konsentrasjoner ble utlignet ved hjelp av RIPA. Prøvene ble deretter blandet 01:01 med 2X Laemmli buffer og separert ved hjelp av en 10% Bis-Tris polyacrylimide gel i 1x MOPS buffer og proteiner ble overført og utslettet med angitt antistoffer som tidligere beskrevet ovenfor [13].
immunofluorescence
Mia.pp32 og Mia.EV celler ble sådd ut på kammer lysbilder og behandlet med de indikerte narkotika. Etter behandling ble cellene vasket i PBS, inkubert med den angitte antistoff, og bearbeidet som tidligere beskrevet [23]. Cellekjerner ble farget med DAPI og kammermusikk lysbilder ble montert for analyse med en Zeiss LSM-510 Confocal Laser mikroskop.
cytoplasmatiske Ekstrakter
MiaPaCa2 celler ble sådd ut i 60% samløpet. Seks timer etter behandling med en mikrometer gemcitabin (Eli Lilly) eller ingen behandling, ble cytoplasmatiske ekstrakter fremstilt som beskrevet [23], [26], og immunoblot analyse utført [23] med primære antistoffer som anerkjente Hur (3A2, 1:1000, Santa Cruz), hnRNP eller pp32 (1:500) [13].
Vekst analysen
Ved å bruke samme transfeksjon protokollen skissert ovenfor, MiaPaCa2 foreldre celler ble transfektert med like mengder pp32-koding og tom vektor pcDNA i T-75 kolber. Mediet ble endret og Zeocin ™ utvalg ble utført som beskrevet ovenfor. Ved slutten av to-ukers periode, mediet ble aspirert og kolber ble farget med krystallfiolett oppløsning i 20 minutter, etterfulgt av grundig vask og celler ble tellet som beskrevet i figuren forklaringen.
medikamentsensitivitet Assays
følsomhetsanalyser ble utført ved anvendelse av PicoGreen ™ (Invitrogen), et fluorescerende fargestoff som selektivt binder dobbelttrådet DNA. Intensiteten av fluorescent signal korrelerer med antallet levedyktige celler. I korte trekk, ble 2000-cellene sådd ut pr brønn i en 96-brønners plate og behandlet 24 timer senere [23]. Kjemoterapeutika ble kjøpt fra Sigma hvis ikke annet er nevnt.
RNA bindingsanalyser
For ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP) analyse, MiaPaca2 celler ble sådd ut i en 65% konfluens, behandlet 24 timer senere med 1fiM gemcitabin i 3 timer og IP utføres med enten anti-Hur eller IgG kontroll antistoffer som beskrevet [23], [26]. Etter RNA isolering, ble dCK mRNA nivåer målt ved hjelp av PCR-analyse ved hjelp av primere TCTCTGAATGGCAAGCTCAA og CTATGCAGGAGCCAGCTTTC [23].
Immunohistochemistry og pasientprøver
Formalin fiksert, parafininnstøpte blokker ble behandlet som beskrevet [ ,,,0],23] ved hjelp av varme antigen gjenfinning og avidin-biotin kompleks gjenkjenning. Farging ble utført på 37 resected PDA prøver fra Thomas Jefferson Universitetet patologi arkiver etter Thomas Jefferson universitetssykehus Institutional Review Board (IRB). Vi har overholdt alle etiske hensyn her. Alle pasientprøver som ble brukt var under Thomas Jefferson universitetssykehus Institutional Review Board (IRB) godkjent protokoll. Derfor er denne studien ble utført med 100% pasienten samtykke. Ingen nye cellelinjer generert direkte fra humant vev ble anvendt for denne studien. Samtykke ble skrevet. IRB godkjennelse tittel er «Collection, Banking, og evaluering av vev, blod, bukspyttkjertelen juice og galle fra pasienter med bukspyttkjertel og relaterte karsinom som gjennomgår kirurgisk reseksjon.» I henhold til US Department of Health and Human Services (IRB godkjent). Størstedelen av pasientene fikk GEM alene, eller i kombinasjon med Xeloda eller strålebehandling. Antistoffer som gjenkjenner pp32 [14] eller hur [23] ble brukt tidligere [23]. Cellular lokalisering (atom versus cytoplasma) og fargeintensitet (sterk versus svak) ble scoret. Basert på prosentandelen av fargede celler ( 50% versus 5-50%) uttrykket ble scoret som diffuse eller fokale, henholdsvis. Overlevelseskurver ble generert ved hjelp GraphPad Prism (versjon 4.0) og p-verdiene beregnes ved hjelp av en log-rank (Mantel-Cox) test.
Resultater
Karakterisering av pp32 overekspresjon cellelinjer
Plasmid integrering i MiaPaCa2-celler ble bekreftet ved PCR-amplifisering av genomisk DNA (data ikke vist). Figur 1 viser bekreftelse av pp32 protein overekspresjon i Mia.pp32 cellelinjen i forhold til Mia.EV. Lik protein lasting ble bekreftet ved farging membranen ved hjelp av Fast Grønn (figur 1A). Den sterke kjerne nærvær av pp32 i Mia.pp32 celler ble oppdaget av immunfluorescens (figur 1B). Periodisk immunoblot-analyse ble utført for å validere fortsatt overekspresjon av pp32 protein i Mia.pp32-celler (figur 1).
(A) Immunoblot-analyse av protein lysatet fra Mia.pp32 celler og kontroller. Mia.pp32 celler uttrykker økt pp32 nivåer enn Mia.EV celler. (B) immunfluorescens med Mia.pp32 og Mia.EV celler (
toppen
). Immunfluorescens ble også utført med merking av Hur, pp32, og DAPI under en høyere forstørrelse (
nederst
). Cellene ble så analysert ved hjelp av laser konfokal mikroskopi. (C) Mia.pp32 celler har redusert vekstpotensial i forhold til Mia.EV celler. (
Venstre
) Celler ble like belagt og samlet på dag 3 og 5 og telles. Fem ganger færre Mia.pp32 celler ble telt ved 5 dag sammenlignet med Mia.EV celler. (
Høyre
) MiaPaCa2 celler ble transfektert med like mengder pp32 og tom vektor pcDNA 3.1 (Zeo). Kolbene ble behandlet på samme måte i løpet av en to-ukers periode, og deretter farget med krystallfiolett for å kvantifisere antallet levedyktige celler (se metoder). Hver flaske er representativ for 3 kolber.
kreft i bukspyttkjertelen celler har redusert vekstpotensial i forhold til å kontrollere celler.
Mange forsøk på å generere Hs766T og PL5 celler overekspresjon pp32 var mislykket, mens tom vektor plasmid generert kolonier rutinemessig (upubliserte data, se Methods) [14]. Lignende resultater ble beskrevet i tidligere studier [8], [14].
Mia.pp32 cellene rutinemessig kreves mindre hyppig enn aging Mia.EV celler. Vekst analyser (figur 1C,
forlot
) utført som beskrevet (se Metoder) viste at ved dag 5, var det fem ganger færre Mia.pp32 celler enn Mia.EV celler. Legg merke til den typiske logartihmic veksten av Mia.EV forhold til avstumpet, lineær vekst på Mia.pp32. Vi observerte ikke signifikant celledød i begge cellelinje i sub-konfluent tilstand, støtter den konklusjon at redusert cellevekst, i stedet for apoptose, utgjorde den dramatiske forskjell i celletall som tidligere beskrevet [14].
Vi tilført de pp32 og tomme vektor plasmider i like mengder foreldre MiaPaCa2 celler. En dramatisk reduksjon i vekst i MiaPaCa2 celler transfektert med pp32 ble detektert sammenlignet med celler transfektert med tom vektor. Vi bemerket markert redusert farging i den pp32-transfekterte kolbe (figur 1C,
høyre
), noe som viser redusert vekstpotensialet av disse cellene sammenlignet med kontrollen. Sammen utgjør disse eksperimentene utelukket muligheten for at pp32 redusert celleproliferasjon grunnet «posisjon-effekten vekslande» som følge av tilfeldige integrering av et gen inn i en uønsket region i genomet.
Drug følsomhetsanalyser avslørt Mia.pp32 celler for å være motstandsdyktig mot nukleoside analoger
Når stabilt transfekterte Mia.pp32 og Mia.EV cellelinjer ble etablert, ble cellene behandlet med forskjellige kjemoterapeutiske midler fra forskjellige legemiddelklasser (tabell 1). For de fleste medikamenter som etoposid, cisplatin, oksaliplatin (figur 2A), cyklofosfamid og paclitaxel (figur 2B, se tabell 1 for narkotika klasse beskrivelser) bare ubetydelige endringer i kjemosensitivitet ble sett mellom Mia.pp32 og Mia.EV celler (tabell 1 og Figur 2A og B). En ekstra sub-linjen i pp32 transfekterte celler (Mia.pp32-2) ble inkludert som en eksperimentell kontroll, og forskjeller ble funnet mellom alle pp32 overekspresjon cellelinjer og de tomme vektorkontrollcellene, og dermed utelukker en gjenstand av kloning (figur 2 ). Både Mia.pp32 linjer og Mia.EV proliferert i samme takt, som antydet med ubetydelige forskjeller ble observert i celle surivival prosenter mellom cellelinjene ved ekstremt lave doser og konsentrasjonen av hvert medikament testet (figurene 2A-C).
overlevelse av Mia.pp32 og Mia.EV linjer ble målt ved hjelp av PicoGreen assay etter 5-7 dagers inkubering med de angitte medikamentdoser. (A) Legemidler som forårsaker ingen pp32 avhengig følsomhet; (B), medikamenter som viser beskjedne forskjeller i følsomhet; (C) medikamenter som pp32 konferert forbedret motstand. Grafer representerer enkeltforsøk (SEM); hvert forsøk er representativ for tre individuelle eksperimenter. Mia.pp32 linjer er angitt som ▴▪ og de tomme vektorkontrollcellene er angitt som ♦.
Det var en beskjeden økning i følsomheten Mia.pp32 linjer til protein kinase C hemmer staurosporin (STS) sammenlignet med Mia.EV (figur 2B,
høyre
). Mia.pp32 celler var to ganger mer følsomme for 5-FU i forhold til Mia.EV celler (figur 2C,
forlot
). Men den mest dramatiske endringen ble notert med narkotika fra samme klasse som utnytter dCK for cellenes stoffskifte: GEM og cytarabin (Ara-C) (tabell 1 og figur 2C,
midtre og høyre
). Mia.pp32 celler viste en ti ganger resistens til GEM forhold til Mia.EV, og en to-fold motstand mot ARA-C (tabell 1 og representative data, figur 2C,
senter
).
siRNA knockdown av endogen pp32 uttrykk sensitizes celler til gemcitabin
bukspyttkjertelkreft cellelinje PL5, med rikelig pp32 uttrykk, ble transient transfektert med enten pp32 siRNA eller en kontroll kryptert sekvens. Knockdown av pp32 uttrykket (figur 3A) som er ytet celler tilnærmet tre ganger mer følsomme overfor GEM sammenlignet med kontrollceller (figur 3B). pp32 knockdown ikke påvirke cellenes levedyktighet etter etoposid (negativ kontroll) behandling (figur 3C). Vi observerte ikke noen endringer i cellevekstparametre eller cellulær fenotype i pp32 siRNA cellene.
(A) immunoblotanalyse av pp32 overflod i lysatene fra PL5 cellene 48 timer etter transfeksjon. I celler transfektert som beskrevet i (A), ble sensitiviteten til GEM (B) eller etoposid (C) testet ved PicoGreen celleoverlevelsesanalyse.
Overekspresjon og reduksjon av pp32 forstyrrer VEGF, Hur, og dCK mRNA transkripsjon binding til Hur og reduserer dCK protein uttrykk
Tidligere har vi vist at dCK mRNA binder seg til Hur og dermed forbedrer dCK protein oversettelse [23]. Vi manipulert pp32 uttrykk nivåer (figur 4A) i isogene kreftceller og deretter kvantitativt vurdert sammenslutning av kjente Hur mRNA rettet DCK [23], vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) [27], og Hur [28] mRNA med HUR av ribonucleoprotein immunoutfelling (RNP-IP) analyse som beskrevet tidligere [23]. Etter en kort GEM behandling, ble sammenhengen mellom Hur og dCK mRNA påvist i MiaPaCa2 celler (figur 4B). Men en betydelig reduksjon i dCK, VEGF, og Hur mRNA ble påvist i Hur antistoff-immunopresipitert-RNA fra celler som overuttrykker pp32 (fig S1 og figur 4A og B); mens i de pp32 siRNA-transfekterte celler vesentlig, konsekvent forbedring (mer enn 4 ganger) i dCK, VEGF, og Hur mRNAer bundet til Hur (figur 4A og B). Brett endringer ble bestemt ved å sammenligne Hur antistoff-immunopresipitert-RNA fra transfekterte celler tømme-vektor transfekterte celler med normale, endogene pp32 uttrykk nivåer. For spesifisitet, vi evaluert og fant ikke noen binding av GAPDH og pp32 mRNA (Figur 4B og data ikke vist). Figur S1 viser den dramatiske effekten av stabil overekspresjon av pp32 (Mia.pp32 celler) har på dCK mRNA binding til Hur.
(A) pp32 mRNA nivåer normalisert til GAPDH mRNA nivåer i tom-vektor transfektert celler, pp32 siRNA transfekterte celler, og pp32 plasmidet transfektert celler. Tallet angir ganger endring av pp32 mRNA uttrykk av merket generert cellelinjer i forhold til tomme vektorkontrollceller. (B) Hur binding til VEGF og dCK mRNA ble oppdaget av RNP-IP-analyse i MiaPaCa2 celler transfektert med pp32 siRNA, pp32 plasmid, eller tom vektor kontroll (A). mRNA nivåer i Hur og IgG IP prøvene ble først normalisert til GAPDH mRNA nivåer i samme IP-reaksjoner, og deretter plottet som relative fold berikelse i VEGF, dCK og Hur mRNA i Hur IP vs IgG IP. Dataene viser den midlere fra 3 uavhengige datapunkter. To uavhengige eksperimenter ble utført for å bekrefte resultatene. Tallene angir fold endringer i forhold til IgG kontroll. (C) Western blot-analyse av pp32 og DCK uttrykk nivåer i proteinlysatene fra Mia.pp32 og Mia.EV celler. (D) Tre baner representerer lysatene fra HEK293T celler generert som enten venstre til høyre: overuttrykker Hur, tom vektor, eller pp32 merket med myc /DCK. Western blot analyse inkludert antistoffer som gjenkjenner pp32, Hur, DCK, alfa-tubulin, og tymidylatsyntase (TS) proteiner.
I tillegg fant vi at DCK proteinnivået ble redusert i Mia.pp32 celler i forhold til kontrollceller (Figur 4C). Til slutt, vi utnyttet en annen cellekultur modell for å validere disse funnene. Protein lysates fra menneske HEK293T celler (se metoder) som overuttrykt Hur, pp32 og en kontroll vektor. Validering av Hur og pp32 overekspresjon ble bekreftet av immunoblotting (figur 4D). Som forventet, vi har oppdaget forbedret dCK protein uttrykk i Hur overekspresjon lysatene [23] sammenlignet med kontroll og redusert dCK protein uttrykk i pp32 overekspresjon lysatene sammenlignet med kontroll (figur 4D). Alpha-tubulin og tymidylatsyntase ble brukt til å vise lik protein lasting. Disse data bekrefter at dCK er oppregulert i en innstilling når Hur er overuttrykt og nedregulert i en innstilling når pp32 er overexpressed. Samlet utgjør disse dataene indikerer at pp32 kan påvirke både dCK mRNA binding til Hur og dCK protein uttrykk (figur 4).
STS og GEM forbedret cytoplasma pp32 overflod
Vi har bekreftet tidligere rapporter [29 ] at STS kan øke cytoplasmatiske nivåene av både Hur og pp32 i kreftceller (figur 5A). Tilsvarende GEM behandling økt pp32 cytoplasma overflod, men i mindre grad enn Hur (figur 5A). Økningen i pp32 og Hur cytoplasmiske nivåer etter GEM behandling ble bestemt ved Western blot-analyse (figur 5B). Ingen endring i pp32 og Hur uttrykk ble oppdaget i hel-cellelysater fra GEM-behandlede celler (figur 5B), i samråd med våre tidligere resultater [23]. Overvåking av nivåene av hnRNP (C1 /C2) bekreftet renheten av de cytoplasmiske lysatene (figur 5B).
(A) Immunofluoresence som viser øket Hur og pp32 cytoplasmisk ekspresjon i celler behandlet med STS (1 pM i 3 h ) og GEM (1 pM i 3 timer), som indikert med hvite piler. (B) immunoblotanalyse av Hur og pp32 nivåer i cytoplasma og hel-cellelysater fremstilt fra celler som ble behandlet som beskrevet i (figur 5).
Nuclear pp32 intensitet er en biomarkør for dårlig prognose i PDA, men ikke øke prediktiv verdi av Hur for GEM behandling
Vi separat oppdaget både sterk og svak kjernekraft og cytoplasma uttrykk for både Hur og pp32 i PDA-prøvene [14], [23] (tabell 2 og figur 6A, Hur,
venstre panel Hotell og pp32,
høyre panel
). For alle pasienter som behandles med GEM (n = 31) [23], gjorde pp32 atom intensitet ikke korrelerer signifikant med GEM respons i forhold til total overlevelse (figur 6B). pp32 atom uttrykk nivåer i kombinasjon med Hur cytoplasma status (Tall 6C og D) ikke forbedre prediktiv verdi av Hur alene som en markør for GEM respons (p = 0,0009, data nå vist [23]). Vi fant en beskjeden sammenheng mellom pp32 og Hur subcellulære lokalisering uttrykk nivåer (Tabell 3). Tabell 2 beskriver sammenhengen mellom lav atom pp32 nivåer og mer aggressive svulster (høyere klasse, p = 0,0002, og positivt for lymfeknutemetastaser, p = 0,0069, se tabell 2). Dette bevis støtter våre tidligere funn, i en separat klinisk datasett, som viser at lav pp32 ekspresjon korrelerte med dårlig differensiert PDA [14], [15].
(A) overflod og subcellulær lokalisering av HUR (
forlot
) og lav til fraværende atom pp32 uttrykk (
høyre
) i prøver fra bukspyttkjertelen kreftpasienter ble vurdert ved immunhistokjemi; forstørrelse, 200x. Prøvene er representative for kohorten analysert i B-D. (B) Sammenheng mellom pp32 atom uttrykk og respons på GEM behandling (p = 0,3, log rank test). (C) Sammenheng mellom høye atom pp32-uttrykke tumorprøver stratifisert i høy eller lav Hur status i forhold til GEM respons (p = 0,88, log rank test). (D) korrelasjon mellom høye cytoplasmatiske Hur-uttrykker tumorprøver stratifisert i høy og lav pp32 atom uttrykk korrelert med GEM respons (p = 0,25, log rank test).
Diskusjoner
Tallrike forskere har uavhengig karakterisert pp32 som en tumor suppressor protein i forskjellige eksperimentelle modeller [8], [9], [12], [13], [30], [31]. Tidlige studier viste at pp32, gjennom et bestemt domene består av omtrent 25 aminosyrer, handlet som en tumor suppressor ved å hemme K-ras, en mutant p53, c-Jun, E1A, E6 og E7 [12], [13]. Vi fant en sterk korrelasjon mellom både høyverdig svulster og lymfeknutemetastase med svak pp32 atom uttrykk (tabell 2), støtter våre tidligere funn om at pp32 fungerer som en tumor suppressor protein i PDA [14]. Våre resultater tyder på at pp32 ekspresjonsnivåer direkte forstyrre eller lette hur evne til å støtte kreftcellelevedyktigheten og proliferasjon ved å forstyrre stabilisering av mRNA-transkripter koder for proteiner som er nødvendige for tumorcelleoverlevelse, som dCK, VEGF, eller Hur (figur 7). Vi postulerer at tilstedeværelsen av pp32 kan forstyrre Hur rolle i å støtte tumorigenese og kreftcelleoverlevelse, mens fravær av pp32 letter tumorigenesis. Vårt arbeid støtter og utvider over et tiår med forskning som har vist at pp32 fungerer som en tumor suppressor genet i flere modeller og kreft systemer [8], [9], [11], [12], [13], [30] [31], [32] (figur 7).
på venstre side viser et scenario der pp32 er redusert eller fraværende (tumorigenesis) og Hur er tilgjengelig for å assosiere og stabilisere mRNA som støtter kreftcelle overlevelse og levedyktighet. På høyre side er et scenario der pp32 er til stede (tumor undertrykkelse) og Hur kan ikke binde seg til mRNA viktige for kreft celle overlevelse. Merk: GEM er mer sannsynlig å bli metabolisert fra sin promedikamentformen til aktive metabolitter av dCK i scenariet til venstre
Modulation av pp32 uttrykk gjennom overekspresjon eller lyddemping endret følsomheten av kreftceller til. de nukleosidanaloger GEM og ARA-C (figur 2C og 3). Videre, forbedret eller redusert pp32 uttrykk nivåer direkte endret samspillet av Hur med dCK mRNA (Tall 4) og betydelig senket dCK protein uttrykk (Tall 4C og D). Disse dataene indikerer at pp32 spiller en rolle i Hur post-transcriptional regulering av dCK. Vi bekreftet tidligere rapporter at cytoplasmatiske pp32 nivåer kan øke i nærvær av spesifikke stressfaktorer [22], [33]. Kanskje ulike stressfaktorer transportere forskjellige pp32 genet familiemedlemmer i forbindelse med Hur. For eksempel, Fries B
et al.
Vist at
april
og ikke pp32 fungerer som en ligand og kan hjelpe Hur i sin transcriptional regulering av CD83 [33]. Medlemmer av pp32 protein familien (f.eks APRIL, pp32r1, pp32) trolig gi ytterligere regulatoriske mekanismer for Hur og dets mål mRNA [31].
Selv om våre data gir sterke bevis for at pp32 modulerer Hur funksjon, vår kliniske data viser at, før behandling, endogen pp32 uttrykk og subcellulære lokalisering endrer ikke Hur prediktiv verdi av GEM respons (figur 6). Videre, mens en sammenheng ble funnet mellom pp32 og Hur subcellulære lokalisering i vevsprøver (tabell 3), ser det ut til at hver protein ikke helt regulere subcellulære lokalisering av andre
in vivo
.
