Abstract
Bakgrunn
Denne studien forsøkte å forstå rollen av myeloide cellegruppene i uninvolved regionale lymfeknuter fra tidlig stadium ikke-småcellet lungekreft pasienter.
metoder
uninvolved regionale lymfeknute seksjoner fra 67 pasienter med stadium i-III resected ikke-småcellet lungekreft ble immunostained å oppdage myeloide klynger, STAT3 aktivitet og okkult metastaser. Anthracosis intensitet, myeloid klynge infiltrasjon forbundet med anthracosis og pSTAT3 nivå ble scoret og korrelert med pasientens overlevelse. Multivariat Cox regresjonsanalyse ble utført med prognostiske variabler. Humane makrofager ble brukt til
in vitro
nikotin behandling.
Resultater
CD68
+ myeloide klynger knyttet til anthracosis og med en immundempende og metastasefremmende fenotype og forhøyet STAT3 samlede aktivitet ble observert i uninvolved lymfeknuter. Hos pasienter med en rykende historie, myeloid klynge poengsum signifikant korrelert med anthracosis intensitet og pSTAT3 nivå (P 0,01). Nikotin aktivert STAT3 i makrofager i langsiktig kultur. CD68
+ myeloide klynger korrelerte og colocalized med okkulte metastaser. Myelogen klynge minutter ble en uavhengig prognostisk faktor (P = 0,049) og ble assosiert med overlevelse etter Kaplan-Maier estimat hos pasienter med en historie med røyking (P = 0,055). Kombinasjonen av myeloid klynge stillingen med enten lymfeknute trinn eller pSTAT3 nivå definert to populasjoner med en signifikant forskjell i overlevelse (p = 0,024 og P = 0,004, respektivt).
Konklusjoner
myeloide klynger legge til rette for en pro-metastatisk mikromiljøet i uninvolved regionale lymfeknuter og forbinder med okkulte metastaser i tidlig stadium ikke-småcellet lungekreft. Myelogen klynge poengsum er en uavhengig prognostisk faktor for overlevelse hos pasienter med en historie med røyking, og kan presentere en ny metode for å informere behandlingsvalg ved adjuvant behandling. Ytterligere valideringsstudier er garantert
Citation. Zhang W, Pal SK, Liu X, Yang C, Allahabadi S, Bhanji S, et al. (2013) myelogen Clusters er assosiert med en Pro-metastatisk Miljø og dårlig prognose i røykerelaterte Early Stage Ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (5): e65121. doi: 10,1371 /journal.pone.0065121
Redaktør: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanita, Italia
mottatt: 14 februar 2013; Godkjent: 22 april 2013; Publisert: May 24, 2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold stipend nummer P30CA033572. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
lungekreft er den hyppigste årsaken til kreftdød i USA. [1] til tross for reduserte røyking priser, er sigarettrøyk fortsatt den viktigste risikofaktoren knyttet til lungekreft. [2] Tobakksrøyk inneholder tusenvis av kjemikalier, ca 70 av disse er kjente kreftfremkallende. [3] anthracosis, som er deponering av svart støv saken, har blitt funnet i lungene og lymfeknuter (LNS) av de med en historie med røyking. [4] eksponering tobakksrøyk induserer mutagenese som fører til utvikling av lungekreft, og fortsatte å røyke fører til økt dødelighet og tilbakefall i tidlig stadium sykdommen. [5] Selv om behandlinger er tilgjengelig for behandling av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), de fleste pasienter utvikler tilbakefall på grunn av sin svært invasiv og metastatisk kapasitet. Nye strategier er nødvendig for tidlig forutsigelse av mikrometa sykdom og invasiv kapasitet av NSCLC.
I svulsten mikromiljøet, immunceller produserer immunsuppressive faktorer, slik som interleukin (IL) -6, IL-10, transformerende vekstfaktor -β og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), som resulterer i ineffektiv anti-tumor immunresponser og fremming av tumor vekst, angiogenese og invasjon. [6], [7], [8], [9], [10] mikromiljø av maligniteter inkludert NSCLC konverterer myeloide celler, som er avgjørende for både medfødte og adaptive immunitet, i immunsuppressive celler som letter immununndragelser. [6], [11], [12], [13] konstitutiv aktivering av signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) i myeloide celler er avgjørende for utvikling av immunsuppresjon i primære tumorer og deres mikromiljø. [7], [9], [14]
viktig~~POS=TRUNC av myeloide celler er blitt beskrevet i pre- kondisjone metastatisk vev for fremtiden såing av metastatiske tumorceller. [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23] i noen tumormodeller , infiltrerende myeloide celler i pre-metastatisk vev danner klynger som er såkalte «pre-metastatiske nisjer.» [16], [19], [20] i en fersk rapport, sfingosin-1-fosfat-reseptor 1 (S1PR1 ) -STAT3 signale aksen i myeloide celler ble vist å være kritisk for myeloid celle kolonisering i pre-metastaser, fremme metastasering. [24] korrelasjonen mellom infiltrasjon av myeloide cellegruppene på pre-metastaser og pasient prognose har ikke tidligere blitt beskrevet . Vi antok at infiltrasjon av myeloide celler og forhøyet STAT3 aktivitet innenfor pre-metastatisk vev fra NSCLC pasienter kunne forutsi pasientens utfall etter kirurgisk reseksjon. Regionale LNS er vanligvis invadert av NSCLC-celler i ferd med metastasering. Vi studerte uninvolved regionale LNS fra pasienter med resectable NSCLC å bestemme sammenhengen mellom myeloide cellegrupper, aktivering av STAT3 og pasient prognose.
Materialer og metoder
Kliniske prøver
pasientprøver ble samlet inn i samsvar med City of Hope Institutional Review board (IRB # 10062) og pasienten skriftlig informert samtykke ble innhentet. Affisert lymfeknute vev ble samlet fra 67 pasienter med en patologisk bekreftet diagnose av NSCLC som gjennomgikk enten mediastinalt lymfeknute prøvetaking eller fullstendig lymphadenectomy og ble funnet å ha patologisk bestemt N0 sykdom eller N1-N3 sykdom. Pasientene hadde minst en lymfeknute karakterisert som uninvolved med tumor, med tilgjengelig parafin-embedded tissue. En uninvolved lymfeknute vevsblokk fra hver kvalifiserte pasient ble innhentet og fire-mikrometer seksjoner ble forberedt for senere analyser. Staging ble bestemt av amerikanske Joint Committee on Cancer Guidelines, 7
th edition. [25] Pasient demografi og kliniske kjennetegn er presentert i Tabell 1. Normal LN seksjoner fra 4 personer uten kreft ble kjøpt fra Abcam, IMGENEX og GeneTex, og alle ble etisk innhentet og undersøkt og diagnostisert av lisensierte patologer.
Immunohistochemistry (IHC)
Seksjoner ble inkubert med antistoffer mot CD68 (ABD Serotec, klone 514H12, 01:50) , pY705-STAT3 (Cell Signaling, klone D3A7, 01:50), CD33 (Leica, klone PWS44, 1:200), CD163 (ABD Serotec, klone EDHu-en, 1:200), IL-6 (Abcam, en :400), IL-10 (ABD Serotec, klone JES3-12G8, 1:100), VEGF-A (Abcam, klone VG-1, 1:200), matriksmetalloproteinase 9 (MMP-9, Cell Signaling, 1: 100), stromal celle-avledet faktor 1 /chemokin (CXC motiv) ligand 12 (SDF-1 /CXCL12, R D, klone 79018, 1:100), B-cellelymfom-extra large (BCL-XL, Cell Signaling , klone 54H6, 1:200) eller pan-cytokeratin (pan-CK, eBioscience, klone AE1 /AE3 [26], [27], 1:1000) over natten ved 4 ° C. ABC elite kit og 3,3′-Diaminobenzidin (Vector Labs) ble brukt i henhold til spesifikasjonene. Bilder ble tatt med Nikon Eclipse TE2000-U mikroskop. Kvantifisering ble utført med Image Pro Plus.
immunfluorescens og konfokalmikroskopi
Etter antigen henting, ble deler blokkert med bilde-iT FX Signal Enhancer (Invitrogen) etterfulgt av 10% geit serum, og inkuberes med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Cellular antistoff fibronektin (CFN) var fra Abcam. Glassene ble deretter probet med enten fluorofor-merket sekundært antistoff eller biotinylert sekundært antistoff, etterfulgt av fluorofor-merket streptavidin. Bilder ble tatt med Zeiss LSM510 oppreist konfokalmikroskop.
Skåring metode og påvisning av okkult metastaser
Lysbilder ble evaluert under mikroskopet av to uavhengige observatører (WZ og CY) uten kjennskap til pasientene «kliniske opplysninger. HE-farget seksjoner ble undersøkt gjennom etter 100x forstørrelse å score anthracosis intensitet på et tall skala fra 1 to3 som følger: 1, liten anthracotic pigment spredt i cellene og dukket skyet; 2, karbon pigment dukket solid, men spredt (ikke gruppert); 3, klynger av mer enn omtrent 50 celler med fast karbon pigment ble observert. Representative bilder er vist i fig. 1. For myeloid klynge infiltrasjon evaluering, ble IHC lysbilder farget for CD68 undersøkt under 40x forstørrelse gjennom hele seksjoner og scoret på et heltall skala fra 1 til 3 som følger: 1, myeloid klynge området var mindre enn 5% av hele vev området ; 2, myeloid klynge området var mellom 5% og 50% av hele LN vev området; 3, myeloid klynge område var større enn 50% av det totale LN vev område (fig. 1). Samlet pSTAT3 nivå ble scoret som prosentandelen av pSTAT3
+ celler i 10 tilfeldige feltene under 100x forstørrelse (Fig. 1). STAT3 aktivitet i myeloide celler assosiert med anthracosis ble scoret på et tall skala fra 1 til 3 av 10 tilfeldige felt under 200x forstørrelse: 1, mindre enn 5% av anthracotic cellene pSTAT3
+; 2, 5% -50% var pSTAT3
+; 3, over 50% var pSTAT3
+ (fig. 1). Ved uenighet om anthracosis intensitet, myeloid klynge infiltrasjon og myeloid celle pSTAT3 nivå, seksjonene ble re-evaluert av de to observatører sammen og en endelig beslutning ble gjort. Ved uenighet om generelle pSTAT3 nivå, ble en middelverdi beregnes som sluttresultatet.
HE farging og IHC farging for CD68 eller pSTAT3 viser representative bilder for scoring av anthracosis intensitet, anthracotic myeloid klynge infiltrasjon, samlet STAT3 aktivitet og anthracotic myeloid celle STAT3 aktivitet. Tallet på øvre venstre hjørne av hvert bilde viser resultatet. (Scale bar, 200 mikrometer)
For prognostisk vurdering, pasienter ble dikotomisert til lave og høye grupper for hver markør: anthracosis intensitet: 1 eller 2 = lavt, 3 = høy; myeloid klynge infiltrasjon forbundet med antrakose: 1 eller 2 = lite; 3 = høy; Generell STAT3 aktivitet: mindre enn eller lik 50% = lav, mer enn 50% = høy; STAT3 aktivitet i myeloide celler assosiert med anthracosis: 1 = lav, 2 eller 3 = høy
Lysbilder farget for pan-CK hjelp IHC ble evaluert for tilstedeværelse av okkult metastaser etter 100 × og 200 × forstørrelse.. Okkulte metastatisk NSCLC cellene er relativt store i størrelse, høy i kjernefysisk-cytoplasma ratio, og viser klart og intensiv ring-lignende cytoplasma mørk brun 3,3′-Diaminobenzidin-farging. [28]
Cellekultur
THP-1 ble erholdt fra American Type Culture Collection og differensiert til makrofager med forbol 12-myristat 13-acetat stimulering. Humane perifere mononukleære blodceller fra friske donorer ble isolert med Histopaque 1077 (Sigma). Monocytter ble beriket med EsaySep CD14
+ utvalg kit (StemCell Technologies) og differensiert i makrofager ved dyrkning i nærvær av 10 ng /ml granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (Peprotech) for 6 dager og hvile for en dag. Makrofager ble behandlet med nikotin (Sigma-Aldrich), med eller uten 1 mM AZD1480 (leveres av Astrazeneca), for den angitte tid.
Western blotting
Like mengder celle lysat-proteiner fremstilt med RIPA buffer ble utsatt for natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgel gel elektroforese og immunoblottet med antistoffer mot pY705-STAT3 (Cell Signaling), total STAT3 (Santa Cruz) og β-aktin (GE Healthcare).
Statistisk analyse
kvantifisert positiv farging områder av IHC ble analysert med Student
t
-test. Parvise korrelasjoner mellom laboratorie biomarkør måling ble vurdert av Spearmans rang korrelasjonskoeffisient. Kaplan-Meier-kurver ble generert for å evaluere forskjeller mellom overlevelseskurver og P-verdier basert på log-rank test ble presentert. Målinger av hver biomarkør var passe med en univariat Cox regresjonsmodell. For å undersøke ytterligere prediksjon makt utover kliniske variabler, ble multivariat Cox regresjonsanalyse også utført for modellvalg blant scenen, nodal scenen, anthracosis intensitet, myeloide klynger knyttet til anthracosis, samlet pSTAT3 nivå, myeloid klynge pSTAT3 nivå og okkult metastasering. En effekt ble ansett for å være statistisk signifikant når den tilsvarende P-verdi 0,05 (*, P 0,05, **, P 0,01; ***, P 0,001). Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av R-programvare.
Resultater
myelogen klynger er fremtredende og generell STAT3 aktivitet er dramatisk forhøyet i uninvolved NSCLC regionale lymfeknuter
Sammenlignet med vanlige LNS fra individer uten kreft, fremstående karbonpigment, dvs. antrakose, ble observert i uninvolved LNS fra NSCLC, som vist i fig. 2A. Immunofluorescent flekker demonstrerte anthracotic cellene CD68
+ myeloide celler (Fig. 2A). Sammenlignet med uninvolved regionale LNS fra prostatakreft, melanom eller brystkreftpasienter (data ikke vist), tilstedeværelse av myeloide celler assosiert med anthracosis var unik i uninvolved NSCLC regionale LNS. Ved IHC farging, fant vi at de myeloide celler forbundet med anthracosis vanligvis dannet klynger, som ikke ble observert i normale LNS (Fig. 2B). Forhøyet samlede STAT3 aktivitet i uninvolved LNS fra NSCLC pasienter ble også påvist ved IHC farging for pY705-STAT3 (Fig 2B.)
(A) HE farging av normale LNS fra personer uten kreft (n = 4;. Venstre to paneler) og uninvolved regionale LNS fra NSCLC pasienter (midten to paneler) viser anthracotic karbon pigment (indikert med piler, Scale bar, 20 mikrometer) i pasient LNS. Immunofluorescent farging for CD68 (høyre panel) demonstrerer anthracotic pigment er innenfor CD68
+ celler (Legg merke til de sorte prikkene er merket med små piler i CD68
+ celler; Scale bar, 20 mikrometer). (B) IHC flekker som viser fremtredende CD68
+ myeloide klynger knyttet til anthracosis og høyt aktivert STAT3 i uninvolved NSCLC regionale LNS (høyre panel) i forhold til normal LNS (n = 4; venstre panel) (Scale bar, 200 mikrometer).
Positive korrelasjoner mellom anthracosis intensitet, myeloid klynge infiltrasjon og pSTAT3 nivå i NSCLC pasienter med en historie med røyking
Hos pasienter med en historie med røyking, anthracosis intensitet, myeloide klynger forbundet med anthracosis, samlet STAT3 aktivitet og anthracotic myeloid celle STAT3 aktivitet var ikke assosiert med sykdomsprogresjon (data ikke vist). Men CD68
+ myeloid klynge infiltrasjon positivt korrelert med anthracosis intensitet og generell pSTAT3 aktivitet (fig. 3A). STAT3 aktivering i anthracotic myeloide klynger også forbundet med antrakose intensitet (Fig. 3A). I motsetning til hos pasienter uten tidligere å røyke, ble anthracosis registreres, men korrelasjoner mellom STAT3 og anthracosis eller myeloide klynger knyttet til anthracosis ble ikke funnet (Fig. 3A). Derfor fokuserte vi vår undersøkelse på seg rollen som myeloide klynger og STAT3 i pasienter med en rykende historie.
(A) Hos pasienter med røyke historie, men ikke i de uten en historie med røyking, myeloid klynge infiltrasjon forbundet med anthracosis korrelerer med anthracosis intensitet og generell STAT3 aktivitet; anthracosis korrelerer med STAT3 aktivitet i myeloide klynger knyttet til anthracosis. Sammenhengen ble bestemt med parametrisk Spearmans rank korrelasjon test. Vist er midler ± SEM, ** P 0,01, *** P 0,001. (B) Nikotin aktiverer STAT3 i humane makrofager. Western blotting viser pSTAT3 og total STAT3 uttrykk i menneskelige THP-1-avledet makrofager og humane primære moncyttavledede makrofager etter nikotin behandling med eller uten AZD1480.
Nikotin aktiverer STAT3 i humane makrofager
Tobakksrøyking er en av de viktigste årsakene til anthracosis innenfor lungevevet. [4], [29] Siden sammenhengen mellom anthracosis intensitet og STAT3 aktivitet ble kun observert i NSCLC pasienter med en historie med røyking, vi vurdert om det vanedannende komponent av tobakksrøyk, nikotin, aktiverer STAT3 i humane makrofager. Som vist på fig. 3B, STAT3 aktivitet ble forhøyet i begge monocyttisk cellelinje THP-1-avledede makrofager og primær monocytt-avledede makrofager etter nikotin behandling i 2 dager, og aktiveringen ble fullstendig opphevet ved en Janus kinase (JAK) inhibitor, AZD1480, som viser aktiverings er via JAK-STAT3 veien.
Pro-kreft og pro-metastatisk fenotype av myeloid klynger
Vi preget fenotypen CD68
+ myeloide klynger knyttet til anthracosis i uninvolved regionale LNS fra NSCLC pasienter med røyking historie med IHC (fig. 4). Siden anthracotic pigment forblir på vevet under farging, fungerer den som en cytoplasmatisk markør for myeloide celler assosiert med anthracosis. Ekspresjonen av CD33 bekreftes disse cellene var fra myeloid linage (data ikke vist). For å undersøke om de myeloide klynger ble M2-polarisert, utførte vi CD163 farging og klynger viste sterk farging. Undersøkelse av myeloid klynge fenotype viste ekspresjon av IL-6 og IL-10, som begge er immunsuppressive faktorer. Ekspresjon av VEGF-A og MMP-9 antydet en rolle i angiogenese og vev-remodellering. VEGF-A er også kjent for å hemme dendrittiske cellemodning. [30] Aktivering av STAT3 opp-regulerer Bcl-xL ekspresjon i myeloide celler, [24] og myeloide klynger viste positiv farging for Bcl-xL. SDF-1 /CXCL12 har en rolle i å rekruttere NSCLC via SDF-1 /CXCL12-CXC kjemokin reseptor typen 4 akse, [31], [32] og IHC-farging viste at SDF-1 er sterkt uttrykt av myeloide klynger. Alle disse molekyler er STAT3 nedstrøms-regulerte gener. [7] I tillegg har IL-6, IL-10 og VEGF-A er STAT3 aktivatorer. [7] Statistisk analyse viste en signifikant forskjell i ekspresjonen av disse molekylene mellom myeloide klynger forbundet med anthracosis og andre områder i LN.
IHC flekker demonstrere uttrykk for CD163, IL-6, IL-10, VEGF-A, MMP-9, SDF-1 og BCL-xL av de myeloide celler assosiert med anthracosis. For hvert protein, ble representative bilder som viser positive og negative flekker områder valgt fra samme lysbilde. Kvantifiseringen ble utført ved å analysere tilfeldige bilder av myeloide klase områder knyttet til anthracosis og andre områder (10 bilder for hver gruppe) fra 10 pasienter. Tosidige Student
t
-test ble brukt for statistisk analyse. Vist er midler ± SEM, *** P 0,001. (Scale bar, 200 mikrometer for 100 × og 400 ×, 25 mikrometer for 1600 ×)
myelogen klynger korrelerer og colocalize med LN okkulte metastaser
nærvær av okkult LN metastaser har vært knyttet til dårlig prognose i en stor kohort av pasienter med resectable NSCLC. [28] Ved å evaluere pan-CK, vi har oppdaget okkulte metastatiske tumorceller i LNS av 8 pasienter av de 49 pasientene med en smoking historie (fig. 5A) . Interessant er at flertallet av pasienter som var positive for okkult LN metastaser (7 av 8) viste økt myeloide klynger forbundet med antrakose i uninvolved LNS (Fig. 5A). På nærvær av okkult LN metastaser var positivt korrelert med myeloide klynger forbundet med antrakose (P = 0,012, r = 0,350) og antrakose intensitet (P = 0,032, r = 0,310). I tillegg ble okkult metastatiske tumorceller vanligvis påvises inne i eller meget nær til klynger av myeloide celler i forbindelse med antrakose (6 av 8 Fig. 5A (a-b)). Double farging for pan-CK og CD68 bekreftet colocalization (Fig. 5B).
(A) IHC flekker viser okkulte metastaser i «uninvolved» LNS (topp to paneler) og metastatiske tumorceller i en involvert LN som den positive kontroll (nederst til venstre panel) (Skala bar, 50 um). Den søylediagram som viser sammenhengen mellom myeloid klynge infiltrering forbundet med antrakose og på nærvær av okkult metastase (OM). P-verdien ble bestemt av parametrisk Spearmans rank korrelasjon test. (B) Confocal bilder som viser colocalization av pan-CK
+ NSCLC celler (piler) og CD68
+ myeloide klynger knyttet til anthracosis. (Skala bar, 50 um) (C) Confocal bilder som viser colocalization av myeloide klynger forbundet med antrakose (piler) og CFN. (Scale bar, 50 mikrometer)
Det er vist at CFN uttrykk i pre-metastatisk vev er forhøyet, og det spiller en viktig rolle i dannelsen av pre-metastatiske myeloide klynger. [16] I Videre regulerer STAT3 uttrykk for CFN i pre-metastatiske myeloide celler. [24] LN seksjoner farget for CFN og CD68 viste at CFN er colocalized med små klynger av myeloide celler assosiert med anthracosis (fig. 5C), som indikerer en mulig rolle CFN i rekrutteringen av myeloide celler og klyngedannelse hos NSCLC regionale uninvolved LNS.
myelogen klynger og generelle pSTAT3 nivå forutsi prognosen for NSCLC pasienter med en historie med røyking
Vi vurderte prognostisk verdi av anthracosis intensitet, CD68
+ myeloid klynge infiltrasjon forbundet med anthracosis og pSTAT3 nivå. I en univariat analyse, anthracotic myeloid klynge poengsum viste en trend mot betydning i prediksjon av total overlevelse (p = 0,061, Hazard ratio (HR) = 2,22, 95% CI [0,96, 5,13]). En Kaplan-Meier overlevelsesestimat med Log-rank test viste også en nær-signifikant forskjell mellom myeloid klynge forbundet med anthracosis-high og -Lav gruppen (P = 0,055, Fig. 6A). Både median overlevelse og 5-års overlevelse er forbedret i lav myelogen klynge gruppe (median overlevelse: 116,1 måneder, 95% KI [86,0, NA] vs. 56,1 måneder, 95% KI [35.1 – NA]; 5-års overlevelse: 78,5%, 95% KI [63,3%, 97,3%] vs. 38,0%, 95% KI [20,8%, 69,3%]). Videre samlet pSTAT3 viste en trend mot betydning i prediksjon av total overlevelse (p = 0,093; figur 6B.)
Kaplan-Meier-kurver som viser overlevelse av pasienter gruppert på:. (A) myelogen klynge infiltrasjon forbundet med antrakose, (B) samlet pSTAT3 nivå, (C) en kombinasjon av nodal scene og myeloide klynger forbundet med antrakose, (D) en kombinasjon av myeloide klynger forbundet med antrakose og samlet pSTAT3 nivå (n = 49).
i en multivariat Cox regresjonsanalyse for modellvalg ,, nodal scenen og anthracotic myeloid klynge poengsum var igjen i den endelige modellen (nodal scenen: P = 0,033, HR = 1,75, 95% CI [1,05, 2,94]; anthracotic myeloid klynge poengsum: P = 0,049, HR = 2,34, 95% CI [1,00, 5,43]), som viser at myeloide klynger knyttet til anthracosis i regionale uninvolved LNS gi ytterligere prediksjon makt til pasient total overlevelse utover konvensjonelle clinicopathological variabler. Derfor har vi kombinert nodal scenen og myeloide klynger knyttet til anthracosis å bedre total overlevelse prediksjon. Til tross for en begrenset utvalgsstørrelse, viste pasienter med negative LNS og lave myeloide klynger betydelig forbedret overlevelse sammenlignet med de med positive LNS og høye myeloide klynger (P = 0,024, median overlevelse: 113,0 måneder vs. 44,0 måneder, fem-års overlevelse: 83,1% vs. 15,0%, fig. 6C). Kombinasjonen av anthracotic myeloid klynge score og generell pSTAT3 nivå også definert to populasjoner av pasienter med signifikant forskjellig prognose (P = 0,0041, Fig. 6D). Disse dataene antyder at myeloide klynger knyttet til anthracosis i uninvolved LNS er uavhengige prediktorer for dårlig prognose i røyking NSCLC.
Diskusjon
Utvikling av metastatisk sykdom etter kirurgisk reseksjon av NSCLC krever mangefasetterte interaksjoner tilrettelagt av svulsten og stromale celler i mikromiljøet ved metastatisk nettstedet, inkludert immunceller. Infiltrasjon av CD68
+ myeloide cellegrupper i forbindelse med anthracosis var fremtredende i godartet LN fra NSCLC pasienter og aktivering av STAT3 ble hevet, i samsvar med tidligere rapporter i flere kreftformer. [14], [24] Pre-metastatisk nisje-formasjonen har vært tilskrives en rekke mediatorer, inkludert VEGF, MMP-9, STAT3 og SDF-1 /CXCL12. [16], [20], [21], [24] Fenotypisk avgrensning av de myeloide klynger sett i affisert LN viste ekspresjon av IL -6, IL-10 og VEGF-A som inhibitorer av antitumor immunforsvar, VEGF-A og MMP-9 som pro-angiogene faktorer og SDF-1 som en kjemoattraktant for å sirkulerende NSCLC-celler. De rike myeloide klynger knyttet til anthracosis i uninvolved LNS kan bidra til immunsuppressive miljøet og spiller en pro-kreft og pro-metastatisk rolle. Uttrykk for anti-apoptotisk genet BCL-XL er også konsistent med en tidligere rapport om pre-metastatiske myeloide klynger. [24]
I svulsten mikromiljøet, formidler STAT3 multidirectional crosstalk mellom tumor-assosiert myeloide celler og andre stromal celler, inkludert endotelceller. [10] Således, i tillegg til effekten av tumor-utskilt faktorer og røyking, heving av STAT3 aktivitet i pre-metastatisk LNS kan også bidra til tumormetastase og progresjon gjennom infiltrasjon av myeloide celler. Nyere undersøkelser viser at hemming av STAT3, som er konstitutivt aktivert i pre-metastatisk nisjer, kan redusere myeloid celleinfiltrasjon i fremtidige metastaser. [24], [33] STAT3 svekker også antitumor immunitet til rette for kreftfremkallende-indusert lungetumordannelse. [ ,,,0],34] Våre data viser at nikotin var i stand til å aktivere STAT3 i humane makrofager med påfølgende opphevelse av JAK /STAT hemming, noe som tyder på at dannelsen av pre-metastaser og metastaser hos pasienter med røykerelaterte NSCLC kan være følsomme for STAT3 blokade.
Påvisning av okkult metastaser hos pasienter med resected NSCLC gir ytterligere prognostiske kriterier, som kan anvendes for å bestemme hjelpeterapi. [28] Når vi undersøkt okkult metastase i benigne LNS, de fleste ble funnet i de med høye nivåer av myeloide klynger assosiert med anthracosis og de okkulte metastatiske tumorceller colocalized innenfor disse klyngene. Rekruttering av disse myeloide klynger og påfølgende okkult metastaser kan skyldes CFN, som også var til stede i uninvolved LN på stedet av klyngene.
Fordi myeloid celle STAT3 aktivitet ikke bare påvirker immunregulering i forbindelse med svulst , [14], men spiller også en viktig rolle i pre-metastatisk vev, [24] dannelsen av myeloide klynger og aktivering av STAT3 kan påvirke pasientens prognose. Hos pasienter uten spredning til lymfeknuter, de med lave nivåer av myeloide klynger knyttet til anthracosis viste bedret overlevelse. Kombinasjonen av Antrasitt myeloid klynge score og pSTAT3 nivå nærmere angitt prognose utover svulst og LN scenen hos pasienter med resectable NSCLC.
Selv om våre funn er lovende, har denne studien flere begrensninger. Først blir konklusjonene begrenset av lite antall pasienter som danner vår kohort. Fremtidige studier med større pasientnummer vil bli utført for å validere konklusjoner. For det andre, vår forrige publisering viste at STAT3 aktivering i myeloide klynger er avgjørende for deres kolonisering på pre-metastaser til rette metastaser i musemodeller. [24] På samme måte vår nåværende studie viser at myeloid klynge infiltrasjon i uninvolved LNS av NSCLC pasienter korrelerer med okkulte metastaser og prognose. Det er imidlertid viktig å merke seg at korrelasjonen ikke lik årsakssammenheng. Myeloid klynge akkumulering hos NSCLC pre-metastatisk LNS kan oppstå som en sekundær hendelse i løpet metastatisk progresjon. Dermed vil direkte bevis være nødvendig å bevise at CD68
+ myeloide klyngene er ansvarlig for priming NSCLC nodal metastaser.
Til tross for begrensningene, gir vår studie tyder på at STAT3 og myeloid infiltrasjon forbinder med tidlig metastatisk sykdom og kan være viktig i røyking-indusert lungekreft. Korrelasjonen av myeloide klynger knyttet til anthracosis og pSTAT3 med pasienten overlevelse tilbyr tilleggsinformasjon når de vurderer fremtiden terapi. Hemming av trasé som stimulerer pre-metastatisk nisje dannelse kan være mer effektiv enn standard kjemoterapi. Etterforskning i større kohorter for validering og prospektive studier vil ytterligere definere rollen myeloide klynger og STAT3 i tidlig stadium NSCLC. Videre vil undersøkelse av friske vevet og isolering av levedyktige myeloide klynger gi innsikt i de cellulære mekanismene som er involvert.
Takk
Vi vil gjerne takke Brian Armstrong, Ph.D. of Light Mikroskopi Imaging Core, Rebecca Nelson, Ph.D. av Institutt for informasjonsvitenskap og ansatte i patologi Kjerne på City of Hope Comprehensive Cancer Center, for deres hjelp i studien.
