Abstract
lungekreft utvikling er ledsaget av felt endringer som kan ha diagnostisk betydning. Vi har tidligere vist betydningen av kromosom aneusomy i lungekreft progresjon. Her har vi testet om genomisk gevinster i seks bestemte loci,
TP63
på 3q28,
EGFR
på 7p12,
MYC
på 8q24, 5p15.2, og centromeric regioner for kromosomer 3 (
CEP3
) og 6 (
CEP6
), kan gi ytterligere verdi i prediksjon av lungekreft. Bronkial biopsiprøver ble innhentet av LIFE bronkoskopi fra 70 pasienter (27 med utbredte lungekreft og 43 individer uten lungekreft). Tjue seks biopsier ble lest som moderat dysplasi, 21 så alvorlig dysplasi og 23 som carcinoma
in situ plakater (CIS). Fire-micron parafinsnitt ble sendt til en 4-target FISH analysen (LAVysion, Abbott Molecular) og reprobed for
TP63 Hotell og CEP 3 sekvenser. Spot tellinger ble oppnådd i 30-50 kjerner per eksemplar for hver sonde. Økt genkopitallet i 4 av de 6 sondene var assosiert med økt risiko for å bli diagnostisert med lungekreft både i ujusterte analyser (odds ratio = 11, p 0,05) og justert for histologi klasse (odds ratio = 17, p 0,05) . De mest informative 4 prober var
TP63
,
MYC
, CEP3 og CEP6. Kombinasjonen av disse 4 sonder tilbudt en sensitivitet på 82% for lungekreft og en spesifisitet på 58%. Disse resultatene indikerer at spesifikke cytogenetiske forandringer til stede i preinvasive lungelesjoner er nært knyttet til diagnostisering av lungekreft, og kan derfor ha verdi i å vurdere risikoen for lungekreft
Citation. Massion PP, Zou Y, Uner H, Kiatsimkul P, Wolf HJ, Baron AE, et al. (2009) Tilbakevendende Genomisk gevinster i preinvasive lesjoner som en biomarkør for risiko for lungekreft. PLoS ONE 4 (6): e5611. doi: 10,1371 /journal.pone.0005611
Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA
mottatt: 21 februar 2009; Godkjent: 17 april 2009; Publisert: 09.06.2009
Copyright: © 2009 Massion et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NCI tilskudd R01 CA102353, U01-CA85070, CA46934, Lung sporer CA90949, CA55769, og CA58187, og Landspitali-universitetssykehus Science Fund fra Island. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tidlig diagnostisering av lungekreft antas å føre til bedret overlevelse. Likevel, er mindre enn 25% av pasientene diagnostisert på klinisk stadium 1 der forventet overlevelse er rundt 70% på 5 år. Dette overlevelsen er mye høyere enn total overlevelse i avansert sykdom, anslått til 15% på 5 år. Tilnærminger til tidlig diagnostisering av lungekreft er fortsatt en stor utfordring. Utbruddet av sykdommen prosessen er ekstremt sakte (måneder til år) og ingen mulighet til å vurdere graden av progresjon av sykdommen prosessen er tilgjengelige.
En rekke av lungekreft screening teknikker har blitt undersøkt for å bestemme deres nytte i tidlig stadium av sykdommen. Disse inkluderer brystet X-ray, sputum cytologi og molekylære biomarkører i ulike biologiske prøver. Ingen av disse tidlige oppdagelse strategiene har blitt funnet å føre til en reduksjon i kreftrelatert dødelighet. Low-dose spiral computertomografi (CT) kan gi et riktig bilde av den anatomiske omfanget av tidlig lungekarsinom [1]. Likevel, selv om tiltalende som en tidlig deteksjon strategi, [2], [3], [4], [5], [6], er resultatene av randomiserte kontrollerte studier ikke kjent. I tillegg vil de fleste preinvasive lesjoner i de sentrale luftveier forbli uoppdaget av brystet CT.
Molekylær deteksjon strategier fra luftveisprøver er utfordrende på grunn av den relativt vanskelig tilkomst, mangelen av vev og mangel på molekylære endringer prediktive av kreft. Mens molekylærbiologi av lungekreft har blitt grundig studert, finnes ingen pålitelige diagnostiske molekylære korrelater [7]. Lungekreft utviklingen er preget av sekvensiell opphopning av epigenetiske og genetiske avvik i somatiske celler [8]. Disse avvik har en enkel nukleotid punktmutasjoner, forandringer i kromosomet kopitallet [9], [10], og spesifikke genomiske amplifikasjoner eller delesjoner som er implisert i patogenesen av lungetumorutvikling og progresjon gjennom aktivering av onkogener og inaktivering av tumorsuppressorgener [11], [12], [13], [14], [15], [16].
fordi ikke alle preinvasive lesjoner utvikle seg til invasive tumorer, er det avgjørende å identifisere molekylære determinanter kjøring til en invasiv fenotype [16]. Fluorescens in situ hybridisering fremstår som et potensielt nyttig klinisk verktøy for vurdering av diagnose, prognose, og effekten av behandlingen i lungekreft [17], [18], [19], [20], [21], [22] . Kromosom Aneuploidy er funnet nært knyttet til diagnostisering av lungekreft. Nylig har vi testet gevinst i kopiantall av to av fire utvalgte DNA-mål, tas som en refleksjon av genomisk ustabilitet og en markør for risikoen for lungekreft utvikling [10], [23]. I denne studien hypotese vi at et utvalgt sett av cytogenetiske forandringer i preinvasive lesjoner kan være en bedre prediktor for lungekreft. Derfor fant vi ut om resultatene av cytogenetisk analyse var assosiert med sykdomsprogresjon i de folkevalgte individer. Vi valgte seks DNA målene ofte forsterket i lungekreft [12], [14], [15], [24], [25] inkludert to centromeric prober (CEP3 og CEP6) og fire sonder til områder med hyppige genomisk forsterkning, dvs. 3q28 (
TP63
) [11], [13], 5p15.2 (D523 og D5S721 markører) [26], 8q24 (
MYC
) [27], og 7p12 (
EGFR
) [28]. Med disse validerte FISH prober, utførte vi en kvantitativ vurdering av kjernefysisk representasjon av genomiske locus kopiere nummer i preinvasive lesjoner og deres tilknytning til en diagnose av invasiv lungekarsinom.
Materialer og metoder
pasientpopulasjon kjennetegn
populasjonen inkluderte 70 forsøkspersoner rekruttert ved University of Colorado Cancer Center (UCCC), British Columbia Cancer Agency (BCCA) og University of Iceland Hospitals (UIH). Denne populasjonen representerer en undergruppe av pasienter som tidligere har undersøkt [23] og omfatter alle fag fra den studien med diagnosen moderat dysplasi (4 med lungekreft, 22 kontroller), alvorlig dysplasi (6 med lungekreft, 15 kontroller) eller carcinoma
i situ product: (17 med lungekreft, 6 kontroller), for hvem bronkial deler var tilgjengelig.
fagene studert ble alle vurdert å ha høy risiko for lungekreft basert på en historie av minst 30 stk -years av røyking og spirometrisk bevis for luftveisobstruksjon dokumenteres med FEV1 /FVC rasjon på mindre enn 75% og en FEV1 på mindre enn 70% av forventet. Tidligere røykere ble definert som å ha sluttet på minst ett år før innmelding. Pack-årene ble definert som det gjennomsnittlige antall pakker røykt per dag multiplisert med antall år røykte. Fleksibel fiberoptiske bronchoscopy ble utført med både autofluorescence og hvitt lys undersøkelse av luftveiene ved hjelp av enten en Xillix LIFE II eller OncoLIFE system på UCCC og BCCA områder; hvitt lys undersøkelse alene ble utført på UIH. De BCCA tilfeller hadde blitt diagnostisert i en prospektiv studie av tidlig lungekreft hjelp autofluorescence og hvitt lys bronkoskopi eller pasienter innlemmet som en del av to National Cancer Institute sponset chemoprevention prøvelser. Disse inkluderte 27 pasienter med klinisk diagnose av invasiv carcinoma (utbredte tilfeller) og 43 pasienter som forble fri for invasiv svulst i minst ett års oppfølging (kontroller). Detaljerte spørreskjemadata som stammer fra personlige intervju var tilgjengelig på alle forsøkspersonene, inkludert demografiske kjennetegn og røyking historie. Studien ble godkjent av de lokale Institutional Review Styrene i Vanderbilt University, University of Colorado Health Sciences Center, den BCCA- University of British Columbia Clinical forskningsetikk Board, National bioetikkomité Island og islandsk Data Processing kommisjonen.
Histologi og utvelgelse av områder av interesse
Alle biopsier oppnådd ved bronkoskopi ble scoret i henhold til den nyeste WHO klassifisering [29]. Biopsi med diagnoser som spenner fra moderat dysplasi til kreft
i situ
ble valgt for FISH analyse. Diagnostiske områder innenfor enkelte biopsier ble anmeldt og avbildes av en patolog (WAF), som markerte områder av interesse å være spesielt undersøkt av fisk.
FISH for CEP3, TP63 (3q28), D523, D5S721 (5p15. 2), CEP6, EGFR (7p12), og mYC (8q24)
Fire-micron parafinsnitt ble først sendt til en 4-target FISH analysen (LAVysion, Abbott Molecular, Des Moines, IL) inkludert sekvenser som omfatter den DNA-markører D523 og D5S721 på 5p15.2, cent 6,
EGFR
genet på 7p12 og
MYC
genet på 8q24, ifølge protokollen beskrevet andre steder [23]. Alle deler analysert ved hjelp av FISH ble sekvensielt til de respektive H 0,01), var det ikke for
EGFR Hotell og 5p15.2 . Når disse forholdene ble analysert i henhold til den andel av celler som inneholdt mer enn to kopier av hver enkelt markør, observerte vi foreninger begrenset til de samme 4 markører. Interessant, forsterkning av sekvenser ble påvist i totalt 8 prøver, for fire av de testede mål:
TP63
, 5p15.2,
EGFR Hotell og
MYC
. Amplifikasjon ble representert ved små og mellomstore grupper av signaler (EGFR) eller med mer enn 50% av celler som bærer mer enn 5 kopier av signaler (myc, 5p15.2 og TP63). Representative bilder er presentert i Figur 1.
Fase kjerner farget i blått med DAPI viser økt kopi antall
TP63
i CIS (A). Segmenterte bilder av fire-farge hybridiseringsanalyser med LAVysion sonden i grov dysplasi lesjoner, viser høye kopiantall av 5p15.2 genomisk region (grønne flekker) (B);
EGFR
genamplifisering (gruppert røde flekker) (C); og høy kopiantall av
MYC product: (gule flekker) (D). Alle deler analysert av fisk ble sekvensiell til H E avsnitt presenteres
Andelen lesjoner unormal for hver fisk markør (i henhold til saken eller kontrollstatus), med unormalt definert som. bety kopiantall per celle er større enn to er presentert i tabell 3. tilstedeværelsen av en ondartet sykdom i luftveiene ble bare moderat forbundet med en hastighet på kopitall abnormaliteter bortsett
MYC
, som ble hyppigere amplifisert i preinvasive lesjoner av pasienter med lungekreft.
Siden tilgang til normal bronkialepitelet fra de samme personene ikke var mulig, ble moderat dysplasi brukt som referanse baseline for å måle sammenhengen mellom kopi nummer misdannelser og lungekreft status . Som vist i tabell 4, oddsen for å ha lungekreft gitt at en preinvasive lesjon hadde gevinst for genomiske regioner økt fra 4,23 (1,21 til 14,8, 95% KI) når 1 eller 2 markører av 4 (CEP3, T
TP63
, CEP6,
MYC
) var unormal til 11 (2,63 til 45,9, 95% KI) når 3 eller 4 markører viste forhøyede kopiantall. Videre justering for alder, kjønn, senter, nåværende røykestatus og histologi grad av lesjon økt oddsen til 17.
Når vurderes som en kandidat biomarkør signatur prediktiv for lungekreft, følsomheten av tilstedeværelsen av abnormitet i de 4 markører var 82% og spesifisiteten var 58%. Mottakeren opererer karakteristiske (ROC) kurver vist i Figur 2 viser merverdi av histologi og epidemiologisk informasjon, slutt å oppnå et område under kurven for 92,6%. Den demografisk informasjon representerer kjønn, alder, paknings år med røyking historie, og røykestatus. Forskjellene mellom kurvene var betydelig mellom demografi kontra demografi og cytologi (p = 0,02) eller kontra demografi, cytologi og 4 fisk biomarkører (p = 0,002). Selv viser en trend, forskjellen var ikke signifikant mellom demografi og cytologi vs demografi, histologi og 4 fisk biomarkører (p = 0,11).
Den demografisk informasjon representerer kjønn, alder, pakke år røyk historie, og røyking status.
Diskusjoner
molekylær tilnærminger for tidlig deteksjon for lungekreft har blitt rettet mot blod, spytt, den utåndet pust og bronkial biopsi [7], [33]. Preinvasive bronkial lesjoner er godt etablert markører for risiko og likevel histologisk karakter ikke nødvendigvis forutsi utfallet [16], [34], [35]. Målet vårt var å finne ut av hvilke genomisk endringer i preinvasive lesjoner kan forutsis å ha en lungekreft hos høyrisikopersoner. Mens genomisk instabilitet var adressert tidligere er basert på en kvantitativ analyse [23], et mer raffinert molekyl signatur er forventet å bedre forbinder med diagnose av lungekreft. Våre resultater tyder på at bestemte cytogenetiske forandringer stede i preinvasive lungelesjoner som forsterkning eller over-representasjon av
TP63 Hotell og
MYC
gener er sterkt knyttet til diagnostisering av lungekreft, og derfor foreslå en rollen av disse markørene i vurderingen av risikoen for lungekreft. I motsetning til p53,
TP63
er sjelden mutert i lungekreft, men en betydelig andel av kreft og premaligne lesjoner er forsterket for både
TP63 Hotell og
MYC
gener.
Selv om kromosom endringer har vært knyttet til de fleste solide svulster og tjene som et kjennetegn på kreft hos mennesker [36], de blir stadig mer komplisert; dvs. at hovedmønster blir fortynnet med mange varianter [10], [37], [38]. Genomiske forandringer i luftveisepitel forekomme både stokastisk og senere i en klonal måte. Klonal (identisk endring i 2 eller flere celler) og ikke-klonale forandringer assosiert med røyking historie delta i startfasen prosessen. Enkelte endringer kan indikere risiko bedre enn andre. Hittil har de fleste av disse endringene har vært ansett konsekvenser i motsetning til formål i lungen kreftutvikling. Noen av disse lave nivå avvik har blitt kalt tilfeldig støy, men kan gjenspeile mål på ekte ustabilitet. Non-klonale kromosomale endringer (NCCAs) som defekte mitotiske tall, kromosom fragmentering, missegregation eller engangs genomisk endringer indikere en dynamisk prosess som fører til ustabilitet [39]. I denne studien, har vi funnet at den høye frekvensen av ikke-kodende centromeric forandringer (CEP3 og CEP 6) er uavhengig av hverandre forbundet med en diagnose av lungekreft (tabell 2), og derfor selv ikke er spesifikt knyttet til tumorgenese, er det sannsynligvis en del av den genomiske ustabilitet kommer sammen med sykdomsprosessen.
i motsetning til dette bestemte genomiske amplifikasjoner eller overstrykninger [12], [15], [40] har vært implisert i patogenesen av tumorutvikling delvis gjennom aktivering av onkogener [41] og inaktivering av tumorsuppressorgener. Noen genomiske signaturer synes å vedvare etter svulstutvikling, gjennom sin progresjon [42] og deres histologi differensiering. Preinvasive lesjoner har vist kopinummer endringer i flere kromosomale regioner, inkludert 3q28, 5p15 og 8q24 [10], [13], [23], [43], [44] og disse endringene ble også funnet. Genomisk ubalanse har blitt grundig undersøkt i invasive NSCLCs bruker CGH eller SNP rekke metodikk og mange loci ble funnet ofte forsterket eller overrepresentert i en eller begge plateepitel og adenokarsinom i lungene [14], [15], [24], [25 ], [45], [46], [47], [48], [49]. Hvis noen av dem er vist å være tidlige hendelser, kan dette forbedre teste ytelsen i forbindelse med diagnostisering av lungekreft.
Vi antok at genomisk endringer i
TP63
, 5p15.2,
EGFR
,
MYC
, CEP 6 og CEP tre, kan gi et mål på risikovurdering. Økt kopiantall (overrepresentasjon eller forsterkning) er teknisk mer pålitelig å oppdage med færre falske positive enn genomisk tap, hovedsakelig ved bruk av FISH-analyse i seksjonert prøver å stille atom avkorting, og dermed har vi fokusert på loci som var involvert i genomisk gevinst. Cut off på «normal» kopitall økning ble satt til ≤2 kopier pr kjerne basert på det faktum at den normale disomic cellene har to kopier av hver genomisk mål og disse cellene ble seksjonert ved 4 um, noe som ga avkortede kjerner. Selv om denne verdien ikke kan bli optimal avskåret å bruke, er det konservative og forsikrer at prøvene klassifisert som stiller genomisk gevinst er faktisk uvanlig.
TP63
er en tiltalende mål på tuppen av en av de mest utbredte region av forsterkning i lungekreft.
TP63
er en homolog av p53, som spiller en rolle i utvikling og onkogenese ved å regulere spredning og differensiering. Interessen for
TP63
stammer fra dette «to gener i ett» konseptet med agonist og antagonist egenskaper som kan være involvert i tumorutvikling [50].
TP63
er en kompleks gen som har flere transkripsjons isoformer, hvorav noen er tumor dempere (
TP63
isoformer), mens de andre er onkogener (Δ
TP63
; dN
TP63
) [11] sikret TA
TP63
isoformer kan binde seg til DNA gjennom p53-responsive elementer og derfor «p53-aktig». Den & n
TP63
utøver dominerende negative effektene over p53 og er foreslått som onkogen. Vi fant ut at det er en tidlig og hyppig genomisk forsterkning av
TP63
i utviklingen av plateepitel karsinom i lungene og at pasienter med NSCLC som viser forsterkning og overekspresjon av
TP63
har forlenget overlevelse [13 ]. Den ΔΝ
TP63
α spleise varianten er den mest vanlige uttrykk isoform i skjellepitel [11], [13]. Den onkogene aktiviteten til
TP63
isoformer kan forklare hvorfor vi ser forsterkning og overekspresjon av dette proteinet.
MYC
er også en viktig onkogen i lungekreft. Den uttrykkes i et stort antall NSCLCs [51]. Genamplifisering ved 8q24 og resulterende økt ekspresjon av
MYC
er en vanlig forekomst i karsinomer [48], [52], [53]. Det fører til økt dannelse av
MYC
: Maks heterodimer transkripsjonsfaktorer som endrer genuttrykket i stor grad ved å rekruttere histone modifiserende enzymer [47]
Våre data tyder på at de observerte endringene for. 5p15 og
EGF R
var mindre prediktiv av kreft, men disse endringer syntes å skje tidligere i dysplastisk prosessen, i det minste hos røykere. Blant 20 bronkial prøver med normal histologi fra som aldri har røykt, har ingen forhøyede
EGFR
eller 5p15 kopiantall. Gjennomsnittlig kopiantall for disse 20 prøvene var 1,77 (STD 0,53) for
EGFR Hotell og 1,73 for 5p15 [10]. Disse observasjonene er også i overensstemmelse med den observasjon av hyppig
EGFR
mutasjoner (24-43%) funnet i luftveisepitel i nærheten av tumorer [54], [55], og med de data som viser hyppig tidlige hendelser på 5p i squamous differensiering av lungekreft [55], [56].
Vårt design inkludert kontroller som ikke presentere med lungekreft i minst 12 måneder etter endobronchial biopsi. Siden genomisk ustabilitet oppstår ikke bare blant tilfeller, men også blant kontrollene, kan noen av disse høyrisiko kontroller etter hvert utvikle lungekreft senere og vår tverrsnittstudie design ikke ta denne risikoen. Andre begrensninger av studien omfatter arten av de undersøkte vev, er en relativt liten prøvestørrelse (selv om studiet av 70 fullt ut annoterte høygradige preinvasive lesjoner kreves tre sentre, og er en av de største rapportert til dato), og den manglende evne til å studere disse prøvene «progresjon over tid.
bruk av bronkial biopsier for vurdering av risikoen for lungekreft er usannsynlig å være av optimal klinisk bruk, selv om det kan være nyttig for å forutsi fremtidig kreft hos personer som tilfeldigvis gjennomgå en biopsi viser høy klasse bronkial preneoplasia. Denne type av molekylær analyse kan ha til å bevege seg til surrogat vev i luftveiene, inkludert histologisk normale luftveisepitel. Den lille størrelsen på preinvasive lesjoner og den potensielle terapeutiske virkningen av biopsier gjøre evalueringen av progresjonshastigheten til aberrasjoner i disse vevene heller vanskelig. Tverrsnittsstudier tillater undersøkelse av sammenhengen mellom endringer og sykdomstilstand. Likevel, for å bevise klinisk nytte, vil søker biomarkører kreve ytterligere validering i prospektive kohortstudier.
Nøyaktigheten av vår cytogenetisk signatur kan bli bedre på forskjellige måter. Genom brede kopi antall endringer av invasive og preinvasive lesjoner kan tillate valg av regioner mer spesifikt knyttet til diagnostisering av lungekreft. Økende antall mål studert i små vevsprøver er utfordrende, men nyere teknologi kan bidra til å nå dette målet. Til syvende og sist, raffinering en genomisk signatur observert i preinvasive lesjoner som spår som er sannsynlig å utvikle lungekreft ville være svært informativ. I denne sammenheng kan gjentatte målinger av slike endringer og frekvensen av en oppkonsentrering være spesielt verdifulle i å forutsi sannsynligheten for å utvikle lungekreft.
I denne studien vi tok fordel av fremskritt innen lungekreftmolekylærgenetikk og viste at det er en sterk sammenheng mellom målrettede genomiske forandringer i preinvasive bronkiale lesjoner og diagnose av lungekreft. Disse forandringer kan bli pålitelig vurdert av FISH, og kan representere en metode for å måle risikoen for utvikling av lungekreft. Den prediktive verdien av disse endringene fortjener videre evaluering i luftveisepitelet av høyrisikopersoner i longitudinelle studier.
bekreftelser
Forfatterne takke UCCC Cytogenetikk Kjerne for teknisk assistanse.
