Abstract
snegle, en potent repressor av E-cadherin uttrykk, spiller en nøkkelrolle i epitel-til-mesenchymale overgang (EMT) i epithelial kreft. Nylig, EMT og stemness programmer er funnet knyttet sammen. I denne studien, ble uttrykket av sneglen og dens bidrag til kreftstamcelle (CSC) markør uttrykk, invasivitet, selvfornyelse, clonogenicity, og tumorgenisiteten av kreft i bukspyttkjertelen celler studert. Våre resultater viser at sneglen ble sterkt uttrykt i CSC
høy cellelinje Panc-1. Stabil, kort hårnål RNA (shRNA) -mediert Snail knockdown redusert invasjon i Panc-1 celler, i takt med økt E-cadherin Uttrykket og trans fra kjernen til membranen. Snail stanse i Panc-en også hemmet CSC markør ALDH uttrykk, sammen med redusert sfære og kolonidannende kapasitet, noe som var svært forenlig med uttrykk for stamcelle assosiert transkripsjonsfaktorer som Sox2 og Oct4. I mus xenograft-modeller, knockdown av snegle førte til et redusert antall tumorbærende mus og en redusert gjennomsnittlig størrelse av tumorer, som hadde en sterkere membranfarging av E-cadherin og lettere farging av Oct4. Sammen er disse funnene implisere Snail er nødvendig for vedlikehold av stamcelle-liknende fenotype i kreft i bukspyttkjertelen, og hemming av Snail kan være en effektiv strategi for å behandle kreft i bukspyttkjertelen ved å målrette cscs
Citation. Zhou W, Lv R, Qi W, Wu D, Xu Y, Liu W, et al. (2014) Snail Bidrar til vedlikehold av Stem Cell-Like fenotype Celler i Human kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 9 (1): e87409. doi: 10,1371 /journal.pone.0087409
Redaktør: Michael Klymkowsky, University of Colorado, Boulder, USA
mottatt: 9 juli 2013; Godkjent: 24 desember 2013; Publisert: 29 januar 2014
Copyright: © 2014 Zhou, et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation of China [81001095] National. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom er en svært aggressiv epitelial kreft med en rapportert fem års overlevelse på ca 5% [1]. Bare 20% av kreft i bukspyttkjertelen pasienter er kvalifisert for kirurgisk fjerning, og metastatisk sykdom utvikler seg ofte selv etter operasjonen, mens nåværende kjemo- og radioterapi er stort sett ineffektiv [2]. Derfor forstå de molekylære hendelser som ligger bak utvikling og progresjon av kreft i bukspyttkjertelen er stort behov for, noe som kan holde nøkkelen til utvikling av mer effektive og nye terapeutiske strategier.
En økende mengde vitenskapelige bevis indikerer at svulster inneholde en liten subpopulasjon av celler, dvs. kreft stilk-lignende celler (cscs) eller kreft-initiering celler (CIC), som oppviser et selvfornyende kapasitet, resistente mot konvensjonell kjemoterapi og er ansvarlig for terapi svikt, kreft tilbakefall og metastase [3- ]. Selv om cscs hypotese antyder at svulster kan oppstå fra stamceller eller stamceller, studier fra noen laboratorier viser at epitelial-mesenchymale overgang (EMT), en utviklingsprosess der cellene mister epiteliale egenskaper og skaffe mesenchymale egenskaper som økt motilitet og invasjon, kan gi gave til celler med stamcelle lignende egenskaper [4] -. [6]
EMT er indusert av undertrykkelse av E-cadherin uttrykk av EMT regulatorer som sneglen, Slug, og Twist. Sneglen familie av sink-finger transkripsjon repressorer undertrykker direkte E-cadherin in vitro og in vivo via en vekselvirkning mellom deres COOH-terminale regionen og den 5′-CACCTG-3 «sekvens i E-cadherin-promoteren [7]. I humane kolorektale cancerceller, ble overekspresjon av snegle rapportert å indusere ikke bare EMT, men også en CSC-lignende fenotype, som forbedret cellemigrering og invasjon in vitro og en økning i metastasedannelse in vivo [8]. Studier har også vist at sneglen spiller en vesentlig rolle i progresjon og metastatiske prosess av human kreft i bukspyttkjertelen [9], [10]. I klinisk setting, har Snail overekspresjon tidligere vært forbundet med dårligere prognose og en mer invasiv fenotype i mange kreftformer [11] – [13]. Men noen rapporter eksisterer om koblingen mellom Snail uttrykk og gevinsten av bukspyttkjertelkreft stamcelleegenskaper. Vi vurderte derfor sneglen funksjon på stamcelle markør uttrykk, selvfornyelse kapasitet i bukspyttkjertelkreft cellelinje in vitro og xenografttumorer dannelse in vivo. Vårt arbeid viser at genregulering mediert av Snail kan støtte menneskelig kreft i bukspyttkjertelen vekst med kreft i bukspyttkjertelen stamcelle.
Materialer og metoder
Cell kultur
Den menneskelige bukspyttkjertelen kreftcellelinjer Panc-1 og BxPC-3 ble ervervet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Celler ble dyrket og opprettholdt i DMEM-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco /Invitrogen, CA), penicillin-streptomycin (Flow Laboratories, Rockville, MD). Begge cellelinjer ble holdt i en fuktig atmosfære ved 37 ° C med 5% CO2. Gross cellemorfologi for tilstedeværelse eller fravær av morfologiske karakteristika er konsistente med EMT ble vurdert av to observatører blindet til behandlingsbetingelsene. Bilder av cellelinjer ble tatt med et Nikon Eclipse TS100 invertert mikroskop og Pro-micro kamera (Oplenic).
Evaluering av aldehyd dehydrogenase aktivitet
Aldefluor substrat (2,5 gl, Aldagen, Inc., Durham, NC) ble tilsatt til 1 x 10
6 tumorceller i 500 ul analysebuffer og inkubert i 60 minutter ved 37 ° C. Cellene ble analysert på en FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson) i henhold til produsentens instruksjoner. Behandling av celler med 5 mL av ALDH inhibitor dietyl-benzaldehyd (DEAB) tjente som negativ kontroll. Lentivirale vektorer uten fluorescens ble brukt for celle transfeksjon i løpet av FACS-analyse.
Sphere dannelsesbestemmelsen
Sphere-analysen ble utført som beskrevet andre steder [14]. I korte trekk ble cellene sådd ut i seks-brønns ultralav festeplater (Corning Inc., Corning, NY) med en densitet på 1000 celler /ml i DMEM supplementert med 1% N2 supplement (Gibco Grand land, NY), 2% B27 supplement (Gibco, Grand Island, New York), 20 ng /ml human blodplatevekstfaktor (Sigma-Aldrich), 100 ng /ml epidermal vekstfaktor (Peprotech, Rocky Hill, NJ) og 1% antibiotisk-antimykotisk (Invitrogen) ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO2. Sphere kulturer ble passert etter 7~10 dager. For å passasje kuler, ble mediet fjernet og kulene ble samlet og inkubert ved romtemperatur i 5 minutter i 0,05% trypsin (Solarbio, Beijing, Kina) og observert under mikroskop for å kontrollere dissosiasjon. Resultatene fra dissosiasjon celler ble siktet gjennom en 40-mikrometer filter og telles ved telleren hjelp trypan blått fargestoff før replating.
Soft agar assay
For å vurdere klonogene potensial, kolonien formasjon analysen ble utført følgende. Hver brønn i en seks-brønners kulturskål ble belagt med 2 ml bunnagar blanding (DMEM, 10% (v /v) FCS, 0,6% (w /v) agar). Etter at bunnlaget størknet, 2 ml toppagar medium blanding (DMEM, 10% (v /v) FCS, 0,3% (w /v) agar) inneholdende 1 x 10
4 celler ble tilsatt, og rettene ble inkubert ved 37 ° C i 3 uker. Platene ble farget med 0,5 ml 0,005% krystallfiolett i 1 time og deretter en dissekere mikroskop ble brukt til å telle antall kolonier . 50 celler [15]
Transwell invasjon analysen
for invasjon assay, ble 24-brønns plate Transwell system med en 8-um porestørrelse polykarbonat filtermembran (Corning Costar, Corning, New York) brukt. 1 x 10
5-celler i 100 ul serumfritt medium ble tilsatt til den øverste kammer belagt med Matrigel (BD Bioscience, Bedford, MA). Det nedre kammer inneholdt 10% FBS inneholdende medium. Cellene ble inkubert i 48 timer og celler som hadde invadert gjennom Matrigel-belagte membranen ble fiksert og farget med krystallfiolett, deretter tellet under et lysmikroskop i fire tilfeldige felt i en blindprøve.
Sanntids RT-PCR-analyse for genekspresjon
for sanntids RT-PCR-analyse, ble det totale RNA ekstrahert fra cellene ved hjelp av Trizol kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). cDNA ble syntetisert ved anvendelse av ekvivalente mengder av totalt RNA (1 pg) med tilfeldige primere i en 20 pl revers transkriptase reaksjonsblanding (Promega, Madison, WI). Real-time PCR primere ble designet og kjøpt fra Ruisai Inc (Shanghai, Kina) som følger:
Snail, fremover (5′-GCTGCAGGACTCTAATCCAGA-3 «)
og revers (5′ ATCTCCGGAGGTGGGATG-3 «);
Slug, fremover (5′-AGCGAACTGGACACACATAC-3′)
og revers (5′-TCTAGACTGGGCATCGCAG-3 «);
Twist 1 , fremover (5′-CACTGAAAGGAAAGGCATCA-3 «)
og revers (5′-GGCCAGTTTGATCCCAGTAT-3′);
ZEB1, fremover (5′-CGAGTCAGATGCAGAAAATGAGCAA-3 «)
og revers (5′-ACCCAGACTGCGTCACATGTCTT-3 «);
ZEB2, fremover (5′-GAGTTGATGCCTCGGCTATTGC-3′)
og revers (5’CTGGACATTGAGCTGCTTCGATC-3 «) ;.
GAPDH, fremover (5′-GGTGTGAACCATGAGAAGTATG-3 «)
og revers (5’GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′)
forsterkningen ble utført i en totalvolum på 20 ul som inneholder en ul av hver primer, 10 ul LightCycler Faststart DNA Master SYBR grønn jeg (Roche Diagnostics, Pleasanton, CA) og en ul 1:10 fortynnet cDNA. PCR-reaksjoner ble fremstilt i duplikat og oppvarmet til 95 ° C i 2 minutter etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder, annealing ved 55 ° C i 20 sekunder, og forlengelse ved 72 ° C i 20 sek. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer, og ble beregnet på basis av
ΔΔCt metode. N-ganger endring i mRNA ble bestemt i henhold til metoden for
ΔΔCT 2-.
Lentiviral-mediert RNAi av Snail
pcDNA6.2-GW /EmGFP-MIR vektor ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California). Double-strandet shRNAs rettet mot menneskelige sneglen ble designet av BLOCK-i T ™ RNAi designer. Den målrettede sekvens 1 var 5′-GCCTAACTACAGCGAGCTG-3 «; målrettet sekvens 2 ble 5»-GGATCTCCAGGCTCGAAAG-3 «. Begge målrettede sekvenser ble verifisert som bestemt for sneglen av Blast søke mot det menneskelige genom. Universal ikke-målsøkende kontroll shRNA (sekvenser: 5»-TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3 «, 5′-CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTC-3») ble anvendt som negativ kontroll. shRNAs ble syntetisert og klonet inn pcDNA6.2-GW /EmGFP-Mir, deretter overført til lentiviral uttrykk plasmid pLenti6 /V5-MÅL med Gateway rekombinasjon teknologi. Lentiviral produksjonen ble gjort ved transfeksjon av 293 T celler med shRNA eller negativ kontroll plasmid og emballasje Mix (Invitrogen) i nærvær av POLOdeliverer ™ 3000 Transfeksjon Reagens (Ruisai Inc, Shanghai, Kina). Supernatanter ble samlet 48 timer etter transfeksjon og deretter ble filtrert; de virale titere ble deretter bestemt ved sanntids-PCR. Subkonfluente celler ble infisert med lentivirus ved en multiplisitet for infeksjon på 50, i nærvær av 8 mikrogram /ml polybrene (Sigma-Aldrich). Panc-1 celler med stabil stanse av Snail genet ble valgt med 2 ug /ml Blasticidin i 4 uker. Da celler ble dyrket med 1 ug /ml Blasticidin. En annen negativ kontroll shRNA plasmid (sc-108 060) fra Santa Cruz Biotechnology, som koder for en kodet shRNA sekvens, ble benyttet for transient transfeksjon i henhold til protokollen.
Western blot-analyse
For helcelle proteinekstraksjon, ble cellene lysert med is-kald RIPA-buffer inneholdende 1 mM PMSF og sentrifugert ved 14000 g i 5 min. Supernatanten som inneholdt det isolerte protein ble kvantifisert ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig modifisert Bradford assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Western blot proteinprøver ble fremstilt ved å koke isolerte proteiner med denaturering prøvebuffer. Like mengder protein ble oppløst ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble deretter blokkert med 5% fettfri tørrmelk i TBS og 0,1% Tween 20 i 1 time og probet med det passende primære antistoff over natten ved 4 ° C. Membranene ble deretter vasket og inkubert med det passende pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Sigma Aldrich, St Louis, MO) i 1 time ved romtemperatur. Membranene ble deretter vasket og proteinbånd ble visualisert ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig forsterket kjemiluminescens (ECL) kit (Thermo Scientific). For å kontrollere riktigheten av lasting av protein isolert fra hel-celle lysat ble blotter strippet, vasket og reprobed med GAPDH antistoff (BioWorld) som en lasting kontroll. Bilder ble visualisert ved hjelp av ECL Detection System (Amersham, Arlington Heights, IL). Antistoffer som benyttes for Western blot analysene var som følger: kanin-mAb-anti-snegle, kanin mAb anti-E-cadherin, kanin mAb anti-vimentin, kanin mAb anti-Bmi1, kanin mAb anti-Nanog, kanin mAb anti-Oct4, kanin mAb anti-Sox2 (Cell Signaling Technology, Inc.). Densitometri av Western blot ble analysert ved bruk av bilde J programvare.
immunfluorescens-mikroskopi
Celler ble dyrket på dekkglass, fiksert i 4% formaldehyd i PBS i 10 minutter, permeabilisert med 0,2% Triton X- -100 i 10 minutter, og blokkert i 10% geiteserum i PBS-0,2% Tween i 1 time. Dekkglass ble inkubert med E-cadherin antistoff (BD Biosciences, 1:200 fortynning) i blokkeringsløsning i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking av cellene med PBS-0,2% Tween, inkuberes vi cellene i 1 time med geit-anti-kanin-IgG Alexa 594 (1:1000 fortynning; Invitrogen). Kjerner ble kontra med DAPI. Platene ble vasket grundig med PBS og montert med Fluoromount-G. Prøvene ble fotografert ved hjelp av immunfluorescens mikroskop.
In vivo-analyse av tumorvekst
Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av Animal Care og bruk komité Zhejiang University School of Medicine (ZYXK2010-0149). Enkeltceller suspensjoner (2 x 10
5 i et totalvolum på 100 ul av 1/1 (v /v) PBS /Matrigel) ble injisert subkutant inn i høyre og venstre midabdominal område av hann nakne mus (BALB /c-stamme ) i alderen 8 uker. Den tumorstørrelse overvåket daglig med målepunkter, og tumorvolumet ble beregnet i henhold til formelen (lengde x bredde
2) /2. Dyr gikk obduksjon på 28 dager etter celle implantasjon og tumorvekst ble vurdert.
Immunohistochemistry analyse av xenograft vev
De subkutane svulster som dannes i mus ble fiksert i 10% fosfat-bufret formalin og innebygd i parafin. 4-mikrometer tykke seksjoner ble deparaffinized hjelp xylen og hydrert ved en gradert serie av etanol vask. Endogen peroksidaseaktivitet ble stanset ved 10-minutters inkubasjon i 3% H
2o
2. Etter inkubasjon med blokkeringsløsning i 30 minutter ble snittene inkubert med primært antistoff fra BD Biosciences (anti-snegle, 1:200 fortynning, anti-E-cadherin, 1:200 fortynning, og anti-Oct4, 1:300 fortynning) for 1 time, et biotinylert sekundært antistoff i 20 minutter og deretter med streptavidin pepperrotperoksidase (HRP) i 10 minutter. Antistoffet ble visualisert med diaminobenzidine (DAB) kromogen, og seksjonene ble kontra med H E
Statistisk analyse
Forsøkene ble gjentatt minst to ganger.. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistisk signifikante forskjeller ble bestemt av Students t-test for uavhengige utvalg når det er hensiktsmessig å bruke SPSS statistisk analyse programvare (versjon 13.0) (SPSS Inc., Chicago, IL). Signifikante forskjeller mellom gruppene ble beregnet til P . 0,05
Resultater
Snail uttrykk og stamcelle markør ALDH i bukspyttkjertelen cellelinjer
Under mikroskop, BxPC-3 celler morfologisk epithelial i naturen. I motsetning til dette, Panc-1 celler ble blandet populasjoner av epitel og spindel-formede mesenchymal type-celler (figur 1 A). Ved hjelp av flowcytometri, dårlig differensiert cellelinje Panc-en ble karakterisert som CSC
høy celle med mer ALDH
høy befolkning, mens godt differensiert cellelinje BxPC-3 som CSC
lav celle med mindre ALDH
høy befolknings (figur 1 B). Sphere-analysen viser også at Panc-1 dannes flere og større kuler enn BxPC-3 gjorde (figur 1 A). For å få innsikt i den avgjørende rolle EMT regulatorer, undersøkte vi basal uttrykk for sneglen, Slug, Twist1, ZEB1 og ZEB2 i Panc-1 og BxPC-3. Spesielt, analyser sanntids RT-PCR viste at PANC-1-celler hadde en signifikant høyere ekspresjon av sneglen og ZEB1 mRNA (ca. 6 ganger og 4 ganger henholdsvis P 0,01) i forhold til BxPC-3-celler (figur 1 C). Det var en sammenheng mellom dårlig differensiering, Snail og ZEB1 uttrykk nivåer og kule dannende kapasitet i disse to bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Vi valgte Panc-1 cellelinjen for senere Snegle støydempere eksperimenter på grunn av dens relativt høye ekspresjonsnivå av sneglen og utmerket lentiviral transfeksjonseffektivitet.
A. Morfologi av Panc-1 og BxPC-3-celler og deres kuler. Merk at Panc-1 celler har flere spindel-formet mesenchymale bestander og kan danne flere og større kuler. ** P 0,01 sammenlignet med BxPC-3. B. ALDH aktiviteten i Panc-1 og BxPC-3 celler. Prikkplott av celler analysert ved flowcytometri for ALDH aktivitet. Celler ble behandlet med Aldefluor substrat i nærvær eller fravær av ALDH inhibitor DEAB. Etter behandling ble prøvene analysert ved strømningscytometri for tilstedeværelse av ALDH
høye celler. De presenterte verdiene er gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk. C. Real-time RT-PCR quantifing Snail, Slug, Twist1, ZEB1, og ZEB2 mRNA uttrykk i Panc-1 og BxPC-3 celler. Stolpediagrammer som viser forholdet mellom ekspresjonsnivået i Panc-1 celler til at i BxPC-3-celler. ** P. 0,01
Snail induserer EMT-lignende endringer i bukspyttkjertelkreft celle
For å undersøke hvilken rolle Snail i EMT induksjon og CSC generasjon, produserte vi et stabilt Snail knockdown Panc-en cellelinje (Panc-1 /shSnail) ved lentiviral transfeksjon.
To uavhengige stabile shSnail-uttrykke kloner (S1, S2) og en stabil negativ kontroll shRNA klone (NC) ble analysert for Snail mRNA uttrykk . S1 og S2 viste opptil 80% nedregulering av Snail mRNA nivåer, mens kontroll klone ikke viser noen signifikant reduksjon i Snail mRNA (Figur 2A). Vi valgte S1 klon som Panc-1 /shSnail for følgende eksperiment på grunn av dens høyere grad av snegle demping. Knockdown av snegle i Panc-1-celler ble bekreftet ved Western blot-analyse (Fig 2B og C). Rabbit mAb anti-sneglen ble validert mot cellelysatene fra Panc-1, MIA-PaCa2, BxPC-3, og CAPAN-1 cellelinjer. Den fargemønsteret var lik den til tidligere publiserte data (figur S1) [9], [16]. For å utelukke heterogenitet forårsaket av stabil transfeksjon og seleksjon protokollen, brukte vi en annen negativ kontroll shRNA plasmid (sc-108060) for transient transfeksjon. Real-time RT-PCR og Western blot viste ingen signifikant forskjell fra Snail uttrykk mellom stabilt og forbigående transfekterte kontroll kloner (figur S2).
A. Snail mRNA uttrykk for stabil shSnail-uttrykke (S1, S2) og negativ kontroll shRNA-uttrykker (NC) Panc-1 kloner. Verdier er gjennomsnitt og standardavvik av tredoble målinger. ** P 0,01 sammenlignet med NC. B. Western blot viser epitel-mesenchymale markører Snail, Slug, Twist1, ZEB1, ZEB2, E-cadherin og vimentin i Panc-1 celler transfektert med lentivirus-mediert negativ kontroll shRNA (Panc-1 /NC) eller shSnail (Panc-1 /shSnail). GAPDH ble brukt som lasting kontroll. C. kvantifisering av protein nivåer av Snail, Slug, Twist1, ZEB1, ZEB2, E-cadherin og vimentin i Panc-1 /NC og Panc-1 /shSnail celler. * P 0,05, ** P. 0,01
Etter lentivirus infeksjon, blindet etterforskere observert forskjeller i brutto utseende av celler. Stabil infeksjon av Panc-1-celler ved shSnail betydelig øket intercellulær adhesjon og brostein-lignende form, sammenlignet med kontrollceller (figur 3A). Deretter vurderte vi uttrykket og lokalisering av E-cadherin hjelp immunfluorescens farging. Sammenlignet med Panc-1 /NC celler, hadde Panc-1 /shSnail celler økte nivåer av uttrykk for E-cadherin og flytting av E-cadherin fra atomrommet til celle plasma membran (Figur 3B). Disse endringene var typisk for celler med en epitelial fenotype, som indikerer at cellene ble gjennomgår mesenchymale-til-epitelial overgang (MET) etter sneglen demping. For ytterligere å bekrefte observasjon, vurdert vi uttrykket av epitel adhesjonsmolekyl E-cadherin, mesenchymale celle markør vimentin og andre EMT transkripsjon faktorer Slug, Twist1, ZEB1 og ZEB2 ved Western blotting på cellelysatene. Som forventet, etter å kneble av Snail i Panc-1, ble det observert ekspresjon av E-cadherin å øke. Motsatt ble en reduksjon i uttrykket av vimentin og ZEB1 observert etter Snail knockdown. Ingen signifikante forskjeller ble observert i proteinnivå Slug, Twist1 og ZEB2 (figur 2 B, C). Disse resultatene viser en klar sammenheng mellom Snail og E-cadherin, og også foreslå en direkte eller indirekte interaksjon mellom sneglen og ZEB1, som begge har potensial til å undertrykke E-cadherin transkripsjon.
A. Morfologiske endringer av Panc-1-celler etter snegl lyddemping indikere en forandring i den cellulære vekstmønster fra en mesenchymale mot en epitelial fenotype. B. immunfluorescens farging for uttrykket og cellulær lokalisering av E-cadherin i stabile kloner av Panc-1 /NC og Panc-1 /shSnail. Nukleær DNA ble påvist ved farging DAPI. Stabil snegle knockdown fører til en økt ekspresjon av E-cadherin og dens translokasjon fra kjernen til membranen. C. Snail stanse hemmer Panc-1 invasivitet i in vitro Matrigel invasjonen analysene. ** P 0,01 sammenlignet med Panc-1 /NC. Data som vises her er middelverdien ± SD av tre forsøk.
Snail øker celle invasjon evne i bukspyttkjertelen kreft celle
Siden prosessene for EMT har blitt koblet med celle invasjon, vi neste spurte om Snail uttrykk har noen effekt på celle invasjon kapasitet i kreft i bukspyttkjertelen celler. Ved hjelp av Matrigel in vitro assay invasjon, fant vi Panc-1 celler med snegle lyddemping hadde signifikant redusert kapasitet for invasjon når sammenlignet med kontrollceller (figur 3C). Disse data bekrefter at Snail uttrykk forbedrer invasiv kapasitet på kreft i bukspyttkjertelen celler, og inaktivering av Snail fører til MET med mindre invasive egenskaper.
Snail forbedrer stamcellelignende egenskaper i kreft i bukspyttkjertelen celler
Som Snail er sterkt uttrykt i CSC
høy sammenlignet med CSC
lave celler, vi derfor undersøkt om sneglen kan påvirke uttrykket av stamcelle markør ALDH. Snegl stilnet Panc-1 celler viste en signifikant reduksjon i den ALDH
høy populasjon (1,60%) i forhold til sine kontroll motstykker (6,01%) (figur 4 A). Deretter brukte vi in vitro sfære dannelse analyse for å undersøke om Snail deltar i CSC fornyelse på serieaging. Vi viste at sneglen knockdown ikke bare påvirket den opprinnelige dannelsen av kuler, men også ført til en pågående reduksjon av sfære tall i senere generasjoner. Colony formasjonstest viste også at stanse av Snail betydelig blokkert kolonivekst av Panc-1 celler (figur 4 B). Disse eksperimentene implisere at sneglen har en viktig rolle i reguleringen av bukspyttkjertelen CSC innhold og er nødvendig for selvfornyende kapasitet.
A. Snail stanse reduserer ALDH
høy befolknings i Panc-1 celler. Prikkplott av celler analysert ved flowcytometri for ALDH aktivitet. De presenterte verdiene er gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk. B. Snail stanse vesentlig hemmer evnen til sfæren formasjon med serieaging og evnen til clonogenicity i Panc-1 celler. Representative bilder av kolonien er vist ovenfor søylediagram den. Tilsvarende forsøk ble gjentatt tre ganger. ** P 0,01, sammenlignet med Panc-1 /NC. C. Western blot analyse av celleekstrakter fra Panc-1 /NC og Panc-1 /shSnail celler for Bmi1, Nanog, Sox2, og Oct4 uttrykk. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. D. kvantifisering av protein nivåer av Bmi1, Nanog, Sox2, og Oct4 i Panc-1 /NC og Panc-1 /shSnail celler. * P 0,05, ** P 0,01 sammenlignet med Panc-1 /NC
Snail øker uttrykk for stamcelle assosiert transkripsjonsfaktorer
Som Snail uttrykk har noen forhold til. CSC innhold, brukte vi Western blotting for å fastslå om Snail uttrykk har roller i endring uttrykk for Bmi1, Nanog, Sox2, og Oct4, som er nødvendig for å opprettholde pluripotency på stamceller. Som vist i figur 4 C og D, lentiviral mediert transfeksjon av snegle shRNA induserte en dramatisk reduksjon i ekspresjonen av Sox2 og Oct4 (P 0,05 og P 0,01, henholdsvis) i Panc-1 celler, som var i overensstemmelse med tapet av CSC fenotype, noe som tyder på at uttrykket av disse faktorene kan være viktig å Snail-indusert CSC formasjonen i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Snail forbedrer bukspyttkjertelkreft celle tumorigenicity in vivo
Siden våre in vitro studier antydet at Snail spiller en regulerende rolle i kreft i bukspyttkjertelen celle invasjon og CSC formasjon, implantert vi subkutant like mange Panc-1 /NC og Panc-1 /shSnail i det nakne mus og målte den resulterende tumorvekst. Når injisert 2 × 10
5 celler, Panc-1 /NC hadde 100% (8/8) svulstdannelse mens bare 2/8 mus injisert med Panc-1 /shSnail viste bukspyttkjertelen svulst engraftment. Dessuten ble det observert en tendens til forsinket tumordannelse og en reduksjon i tumorstørrelser i tumorer avledet fra snegle stanse celler sammenlignet med de fra kontrollceller (figur 5A). Immunhistokjemi av tumorer viste en lettere farging av sneglen og Oct4, mens en sterkere membranfarging av E-cadherin i Panc-1 /shSnail tumorer, sammenlignet med de av Panc-1 /NC tumorer (figur 5B). Disse dataene er i samsvar med våre in vitro observasjoner og støtte rolle Snail i vedlikehold av bukspyttkjertelen CSC rommet.
A. Grafisk fremstilling av vekstrater på subkutane xenografttumorer bruker cellene i Panc-1 /NC og Panc-1 /shSnail. 2 x 10
5 i hver celle ble transplantert på åtte mus per gruppe. Alle mus i Panc-1 /NC gruppen, mens bare to mus i Panc-1 /shSnail gruppe hadde svulstdannelse. B. Expression of Snail, E-cadherin og Oct4 i xenografttumorer. Representative eksempler på Snail, E-cadherin og Oct4 uttrykk bestemmes av immunhistokjemi. Sterkt positiv sneglen uttrykk er til stede i kjernen og cytoplasmaet av Panc-1 /NC tumorer (a), men ikke i Panc-1 /shSnail tumorer (b). Ekspresjon av E-cadherin er svak og heterogen i Panc-1 /NC tumorer (c), men mer intensivt i membranen av Panc-1 /shSnail tumorer (d). Lavere Oct4 uttrykk er til stede i de Panc-1 /shSnail tumorer (f), sammenlignet med den i Panc-1 /NC tumorer (e). Skala barer: 10 mikrometer
Diskusjoner
Vår studie viser at sneglen som er relatert til EMT av menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler kan også regulere uttrykk for stamcellemarkører og pluripotency opprettholde transkripsjonsfaktorer. , modulerselvfornyelse kapasitet og clonogenicity. Sammen med den tumorimplantering studien våre resultater indikerer at aktiveringen av sneglen er nødvendig for opprettholdelse av kreft stamcellelignende egenskaper, som direkte påvirker startfasen, vekst in vivo. Vi har overbevisende demonstrert at hemming av sneglen kan anses som en ny strategi for å forbedre de biologiske virkninger av anticancer og kjemopreventive midler.
Forskere vanligvis identifisert cscs fra bukspyttkjertelkreft basert på ekspresjonen av celleoverflateantigener som CD44 , CD24, epitelial-spesifikt antigen (ESA), og CD133 [17] – [20]. Det er ulike konklusjoner i separate studier om hvilken markør beste beriker for bukspyttkjertelen cscs. Imidlertid har nyere studier har funnet at cellepopulasjoner beriket for høy ALDH aktivitet alene er tilstrekkelig for effektiv tumor-initiering med forbedret karsinogent potensial [21]. I vårt eksperiment, knockdown av nøkkelen EMT indus Snail betydelig redusert ALDH
høy cellepopulasjon. Disse data indikerer at EMT begaver tumorceller med stamcelle-lignende egenskaper. Våre funn er i samsvar med forskning fra Chen et al, som fant ALDH
høye celler i hode og nakke plateepitel kreft har EMT giring og endogent co-uttrykt sneglen. Videre knockdown av sneglen ekspresjon betydelig redusert ekspresjon av ALDH, inhiberte kreft stem-lignende egenskaper [22]. Disse observasjonene ble ytterligere bekreftet ved sfære dannelse in vitro og tumor implantering in vivo, hvor sneglen knockdown førte til mindre og mindre engraftment. Disse funnene er i tråd med de av Mani og kolleger [4] som har vist at tvunget uttrykk for EMT-assosierte molekyler som sneglen og Twist resultater i celler med kreftstamcelle fenotype. EMT tilbyr en alternativ måte å generere kreft stamcelleegenskaper fra differensierte epitelceller tumorceller. Denne hypotesen om dedifferentiation støttes av nylig beskrevet generasjon av pluripotente stamceller fra tilsynelatende terminalt differensierte somatiske celler [23].
Det er generelt ansett som Sox2 og Oct4 er sentrale transkripsjons regulatorer av embryonale stamceller (ESC) selvfornyelse og pluripotency [24] – [26]. Oppsamling av bevis indikerer at disse transkripsjonsfaktorene av ESCs uttrykkes ved CSC-lignende celler i forskjellige typer av kreft. Knockdown av disse genene kan føre til redusert CSC fenotype, redusere klonogene tumorigen og egenskapene til kreftceller. [27] – [29]. De er også tilstrekkelig til å omprogrammere menneskelige somatiske celler til pluripotente stamceller som viser de grunnleggende egenskapene av ESCs [23]. I denne studien fant vi at uttrykket nivåer av Sox2 og Oct4 ble redusert i Snail-tie Panc-1 celler sammenlignet med kontrollceller. Dette tyder på at snegle fungerer som en hovedbryter i regulerer pluripotente potensialene av stamcelle. Lignende resultater er funnet i andre undersøkelser, hvor høy ekspresjon av Oct4 og Nanog fremmer EMT, og er forbundet med medikamentresistens, tumormetastase og dårlig prognose i forskjellige humane malignances. [30], [31].
