Abstract
Integrering av humant papillomavirus (HPV) DNA i vertsgenomet er en kritisk etiologisk hendelse i progresjon fra normal cervix til intraepitelial svulst, og til slutt til invasiv livmorhalskreft. Det har imidlertid vært lite arbeid på hvordan HPV integrasjon status knyttet til behandlingsresultat for livmorhals karsinomer. I denne studien ble HPV E2 og E6 gen kopiantall målt i 111 livmorhalskreft vev ved hjelp av real-time QPCR. Integrasjons mønstre ble delt inn i fire grupper: løssalgs integrert med episomale komponenter (gruppe 1), ett eksemplar integrert uten episomale komponenter (gruppe 2), multikopi tandem repetisjon integrert (gruppe 3), og lav HPV (gruppe 4) grupper . En tilbakefall-forutsi modellen ble bygget ved hjelp av multivariabel Cox modell for å klassifisere pasienter i risikogrupper for sykdomsfri overlevelse (DFS). Modellen ble internt validert ved hjelp av bootstrap resampling. Oligonukleotid mikromatriseanalyse ble utført for å evaluere genutrykksmønster i forhold til de forskjellige integrasjons gruppene. DFS hastigheten var dårligere i den rekkefølgen av pasientene i gruppe 4, gruppe 2/3, og gruppe 1. multivariat analyse viste at histologisk grad, klinisk stadium gruppe, og integrering mønster var signifikante prognostiske faktorer for dårlig DFS. Den nåværende prognostisk modell nøyaktig forut risikoen for tilbakefall, med et område under mottakeren opererer karakteristiske kurven (AUC) på 0,74 (bootstrap korrigert, 0,71). I konklusjonen, disse data tyder på at HPV integrering mønsteret er en potent prognostisk faktor for skreddersydd behandling av livmorhalskreft
Citation. Shin HJ, Joo J, Yoon JH, Yoo CW, Kim JY (2014) Fysisk status Humant papillomavirus Integrering i livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er assosiert med behandlingsresultat av pasientene som ble behandlet med strålebehandling. PLoS ONE 9 (1): e78995. doi: 10,1371 /journal.pone.0078995
Redaktør: Anthony W. I. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 12. august 2013, Godkjent: 25 september 2013; Publisert: 10 januar 2014
Copyright: © 2014 Shin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Center, Goyang, Korea (Grant 1.310.300 og 1.110.033). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Integrasjon av humant papillomavirus (HPV) DNA har vært betraktet som en viktig hendelse i ferd med cervikale kreftutvikling. HPV-DNA er funnet å være til stede i integrerte former i vertsceller med økende frekvens fra normal cervikal epitel for intraepitelial neoplasi, og invasiv kreft i livmorhalsen [1], [2], [3]. Det er imidlertid rapporter som viser at episomal HPV DNA er tilstede i en vesentlig del av invasiv livmorhalskreft, noe som tyder på integrering er ikke alltid nødvendig for ondartet progresjon [4], [5]. Løssalgs HPV integrering medfører forstyrrelse av E1 eller E2 åpen leseramme (ORF) [2], [4],. Som et alternativ, kan integrering av flere kopier av HPV forekomme som hode-til-hale tandemrepetisjoner [6], [7]. Når dette skjer, blir bare den virale kopiflankerende det cellulære DNA forstyrret i E1 eller E2 regionen, mens de indre kopiene har intakt E1 og E2 åpne leserammer (ORF-er). Mens tap av E2 ORF kan deregulere transkripsjon av E6 og E7, er det mulig at intakte E2 ORF, som finnes med multikopi tandem HPV integrert genomer, kan uttrykke og hevde transkripsjonskontroll på E6 /E7. I denne studien, vurderte vi den prognostiske betydningen av ulike HPV integreringsmønstre for DFS fra livmorhalskreft. Microarray analyse ble så brukt til å sammenligne forskjeller i total genekspresjon mellom disse ulike integreringsmønstre.
Materialer og metoder
Pasient egenskaper
Denne studien ble godkjent av Institutional Review Board av National Cancer Center, Korea, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. 111 pasienter på rad ble rekruttert fra juli 2003 til juli 2008 diagnostisert med HPV 16, 18, eller 58 positive plateepitel, adeno, eller adenosquamous celle karsinom i cervix. De kliniske kjennetegn ved disse pasientene er presentert i tabell 1. utredning ups inkludert rectosigmoidoscopy hos alle pasienter, magnetisk resonans imaging (MRI) av bekkenet ± abdomen hos 110 pasienter, og enten positronemisjonstomografi (PET) scan eller PET /CT (computertomografi) skanne i 93 pasienter. Alle ble behandlet med strålebehandling som består av ekstern stråle strålebehandling (EBRT) og høydose brakyterapi. Under EBRT, ble samtidig ukentlig cisplatin 40 mg /m
2 gis til alle pasienter med unntak av 9 pasienter som hadde en dårlig ytelse skala. Etter gjennomføring av primærbehandling, ble pasientene fulgt opp hver 3. måned i løpet av de første 2 årene, hver 4 måneder i løpet av tredje året, og hver 6. måned etterpå. Detaljer om strålebehandling er blitt beskrevet tidligere [8].
Sanntids polymerase chain reaction av HPV E6 og E2 gener
Utvinning, forsterkning, og genotyping av DNA ble utført som tidligere rapportert [8]. Real-time PCR ble utført med ABI Prism 7900HT System og TaqMan Universal PCR Master Mix (PE Applied Biosystems, Perkin-Elmer, Foster City, California). De primere og prober ble utformet for spesifikk amplifisering av E2 heng områder som er kjent for å være forstyrret oftest i løpet av prosessen for viral integrering [2]. Den sekvensinformasjon på hver anvendte primerene er tilgjengelig i tabell S1. Femti nanogram av mål-DNA fra hver biopsiprøve ble benyttet per reaksjon og standardkurver ble fremstilt ved amplifikasjon av en fortynningsserie av 10
6 -10
3 eksemplarer av en klon av HPV DNA i pBR322. Minst tre ikke-templat kontrollreaksjonsblandinger ble inkludert i hvert forsøk, og alle forsøk ble utført in triplo.
Klassifisering av cervikale tumorer med fysiske tilstand av HPV genomer
På grunnlag av relative kopiantall av E2 og E6 ble pasientene klassifisert i 4 grupper; Løssalgs integrert med episomale komponenter (gruppe 1) og uten episomale komponenter (gruppe 2), multikopi tandem repetisjon integrert (gruppe 3), og lav HPV (gruppe 4) grupper. Gruppe 1 svulstene fortsatt inneholde episomal HPV med forsterkning av både E6 og E2 selv om nivåene av E2 blir redusert. Gruppe 2 svulster har ingen E2 forsterkning. Gruppe 3 svulster har like nivåer av E2 og E6 som indikerer multikopi tandem gjentas HPV integrering. Gruppe 4 svulster har ingen E2 og E6 presiseringer. Disse fire gruppene ble til slutt gjen klassifisert i tre grupper basert på deres ulike kliniske utfall (gruppe 1 vs gruppe 2/3 vs gruppe 4).
Microarray analyse
Microarray analyse ble utført for 39 pasienter fra hvem ferskt frosset tumorprøver kunne oppnås. Bare pasienter med HPV16 infeksjon ble inkludert i mikromatrise eksperiment for å unngå heterogenitet forårsaket av forskjellige HPV-genotyper. Som et resultat, 14, 9, 12 og 4 prøver fra integrasjons groups1 til 4, henholdsvis, ble analysert ved bruk av hele human genekspresjon mikromatriser 44K v.1.0 (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA). Alle tall data ble normalisert med per-spot og per-chip normalisering (intensitet avhengig normalisering), og per-genet normalisering (til median) ved hjelp GeneSpring 7.3.1. Rank-baserte lineær trendanalyse ble brukt til å teste den lineære trenden i genekspresjon mellom ulike integreringsmønstre bestilt av kliniske resultater. Permutasjon metode med 250.000 re-prøvetaking ble utført for å evaluere den tilsvarende
p
-verdi. Uttrykket nivåer i log2 skala ble anvendt i analysen, og den falske funnraten (FDR) [9] ble regulert til 0,05. Microarray data har blitt deponert i Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), og er tilgjengelig gjennom Gene Expression Omnibus serie nummer GSE49288.
Statistisk analyse
Demografiske og kliniske kjennetegn er presentert som teller og prosenter for kategoriske variabler, og median og utvalg for kontinuerlige variabler. Fordelings forskjeller mellom gruppene ble vurdert ved hjelp av Pearson Chi-kvadrat test eller Fishers eksakte test. Spearmans rank korrelasjon ble innhentet for å måle sammenhengen mellom HPV virusmengde og kopiere numre. Forskjellene i kopiantall mellom grupper ble testet ved hjelp av Kruskal-Wallis test. Den multivariabel Cox modellen ble ansatt for å forutsi DFS etter justering effekten av andre potensielle konfunderende faktorer som alder, stadium gruppe, lymfeknutestatus, histologisk grad, og histologisk type. Den endelige modellen ble valgt basert på resultatet av univariable analyser samt vurdering av klinisk eller biologisk betydning av variablene. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SAS versjon 9.1 (Cary, NC) og R statistisk programvare, versjon 2.12. Alle rapporterte
p
-verdier er tosidig.
Validering av prognosemodellen ved hjelp av bootstrap resampling
diskriminering evne til multivariabel Cox modell for å forutsi to års sykdomsfri overlevelse ble vurdert ved hjelp av C statistikken, en konkordans tiltak analog til arealet under mottaker drift karakteristikk (ROC) kurve. Kalibrering av modellen ble evaluert med Hosmer-Lemeshow typen chi-kvadrat-test ved å sammenligne forskjellen mellom de observerte og predikerte to års overlevelse av den utviklede modellen for pasienter i hver kvintil. På bakgrunn av den forutsagte overlevelse, ble tre grupper dannet ved å dele pasientene inn i tertiles. Forskjellen i overlevelse distribusjoner av disse tre gruppene ble sammenlignet med log-rank test. Den prediktive modellen ble validert ved hjelp av 1000 bootstrap prøver som en intern validering å korrigere oppover skjevhet i estimering C statistikken på grunn av re-erstatte data.
Resultater
E6 og E2-genet kopiantall og integrering mønster
Klassifisering av pasienter basert på den relative mengde av E2 og E6 kopiantall resulterte i 31, 24, 37, og 14 pasienter i gruppe 1 til 4, henholdsvis. De terskel syklus (CT) forholdstall på E2 /E6 fra pasientene i hver gruppe vises med et spredningsdiagram (Fig. 1). 5 pasienter hadde unclassifiable mønstre. E6 og E2 kopiantall viste en positiv korrelasjon i Group3 (r = 0,83,
p
0,0001) og med group1 (r = 0,43,
p = 0,02
), men ikke i gruppe 2 ( r = 0,008,
p
= 0,97) eller i gruppe 4 (r = 0,26,
p = 0,37
).
E2 /E6 Ct prosenter av pasientene i hver gruppe er avbildet som prikker i spredningsdiagrammet. De horisontale linjene representerer medianverdien med interkvartilt område.
Univariable og multivariat analyse av behandlingsresultat
I løpet av oppfølgings, 33 pasienter (29,7%) utviklet sykdomsprogresjon med 25 fjernmetastaser eller 10 lokale tilbakefall. Blant disse pasientene, tre hadde begge. Tretten pasienter døde og dødsårsaken av 2 pasienter blant dem var kardiovaskulær sykdom og ukjent, henholdsvis. De ble sensurert på datoen for døden. Pasientene ble fulgt opp i median 29 måneder (variasjon, 2-67 måneder). Median periode med oppfølging for pasienter uten tilbakefall var 36 måneder (range, 6-67 måneder). Når de fire gruppene ble re-klassifisert i tre grupper, DFS frekvensen av pasientene i gruppe 1 var den høyeste, etterfulgt av grupper 2/3 og gruppe 4 i en synkende rekkefølge. De hazard ratio (HR) og konfidensintervall 1,90, konfidensintervall (CI) 0,70 til 5,15,
p
= 0,207 for gruppe 2/3 mot gruppe 1, HR 3,52, KI 1.11 til 11.14,
p
= 0. 032 for gruppe 4 mot gruppe 1, henholdsvis (
p
= 0,083 ved log-rank test, fig. 2 og tabell 2) på univariable analyse. Andre viktige prognostiske parametre for DFS inkludert scenen gruppe, nodal metastaser, histologisk grad, histologisk type og røyking av univariable analyse. I multivariat analyse, integrasjon mønster (totalt
p
= 0,014, for gruppe 2/3 vs. gruppe 1,
p
= 0,03, HR 3,15, KI 1.12 til 8.9, for gruppe 4 vs . gruppe 1,
p
= 0,004, HR 6,78, KI 1,86 til 24,79), histologisk grad, klinisk stadium gruppe, og alder forble signifikant (tabell 2)
Gruppe 1.; Løssalgs HPV integrasjon med episomale komponenter, gruppe 2; Løssalgs HPV integrering uten episomale komponenter, Gruppe 3; Multicopy tandem gjentas integrasjon, Gruppe 4; lav HPV.
Utførelsen av utfallet-forutsi modeller og intern validering
C-statistikken av modellen til å forutsi to års overlevelse var 74% (95% KI , 65% -83%) og bootstrap validert C-statistikken var 71%. Den Hosmer-Lemeshow typen Chi-kvadrat test statistikken var 9,02 med tilsvarende
p
= 0,435 som indikerer en god passform. Den log-rank test resulterte i en betydelig forskjell mellom overlevelses fordelinger av tre grupper av pasienter som er definert av den anslåtte overlevelsesrate (
p
0,0005). (Fig. 3 og tabell 3)
Microarray analyse av de 39 livmorhalskreft prøver
654 gener ble valgt som viser signifikant forskjellige uttrykk blant integrasjons grupper klassifisert av den fysiske statusen for HPV DNA (gruppe 1 vs gruppe 2 /3 vs. Group4). Fordi pasientenes overlevelse tendens til å avta fra group1 til fire, ble gener som viste en samsvarende trend i sine uttrykk nivåer undersøkt. Som et resultat ble de midlere uttrykk for 429 gener blant dem vist seg å være i gradvis økning (241) eller reduksjon (188) i størrelsesorden group1 til 4 (fig. 4). Etter en selektiv utvelgelse basert på familien messig feilrate (Bonferroni korreksjon) mindre enn 5%, transmembran modulatorer av celleadhesjon som claudin, occludin, og syndecan forble som gener som viser en signifikant reduksjon fra gruppe 1 til 4. regulatorer liten GTPase -formidlet signaltransduksjon slik som celledeling kontroll-protein 42 (CDC42) effektor proteiner, Rho-GTPase-aktiverende proteiner, og p21 (CDC42 /Rac)-aktivert kinase 2 (Pak2) også betydelig redusert. Disse gener er kjent for å spille en viktig rolle i reorganisering av actin spennings fibre, adhesjon av celle til celle, celle til ekstracellulære matriks. Blant de gener med økende trend av uttrykk fra group1 til fire var transkripsjon regulatorer, for eksempel MYC-assosiert faktor X (MAX) og tumor nekrose faktor (TNF). Også, det var molekyler assosiert med kromatin remodeling som AT-rik interaktiv domene 1A (SWI-aktig), AT-rike interaktiv domene 4B (RBP1-aktig, BRCAA1), og chromodomain helicase DNA-bindende protein. Biologiske funksjoner av disse genene ble undersøkt ved hjelp av DAVID Bioinformatikk Resources versjon 6.7 (https://david.abcc.ncifcrf.gov/). Detaljert informasjon om genene og
p
-verdi av den lineære trenden er oppført i tabell S2. Gene ontology analyse ved hjelp av dette verktøyet indikerer at nivået av ekspresjon av gener relatert til keratinocytt og T-lymfocytt-differensiering var meget lav i gruppe 4. Spesielt, retinoid X reseptor-alfa (NM_002957) ble signifikant redusert i gruppe 4, mens det var mest høyt uttrykt i gruppe 1 (data ikke vist). Dette støtter observasjon av mangel på epitelial differensiering i svulster med lav HPV DNA.
Diskusjoner
I denne studien, den prognostiske verdien av den fysiske statusen for HPV ble undersøkt i lokalt avanserte livmorsvulster. Vår studie viser at livmorsvulster med episomale komponenter har overlegen etter strålebehandling overlevelse sammenlignet med de med rent integrert HPV. Det ble også funnet at den prognose av kreft i livmorhalsen er betydelig redusert i tumorer med ikke målbart nivå av HPV DNA.
Det er tidligere blitt vist at invasive tumorer ikke alltid er sammensatt av celler med 100% integrert HPV DNA. Det er ca 17~20% av pasientene med invasiv kreft med blandet episomale og integrerte former av HPV [4], [5], eller til og med episomale former bare i 7% av pasientene [4]. Videre har flere studier vist at den fysiske tilstand av HPV i livmorhalskreft er forbundet med behandlingsresultatene [4], [10], [11]. Viral integrering mønstre er undersøkt ved Southern-blotting av E1 /E2 området [10] eller ved in situ-virus-DNA signalforsterkning metode [11] eller begge disse metodene [4].
relative mengder av E2 og E6 ble anvendt i denne studien, og overraskende ble det funnet at en tredjedel (37/111) av prøvene hadde multikopiplasmid HPV integrasjon. Tilstedeværelsen av multikopi HPV tandem gjentatte genomer i tumorer er kjent for å bli produsert av den rullende sirkelen replikering fremgangsmåte for HPV [12]. Mens prognosen for pasienter med både ett eksemplar HPV integrering uten episomale komponenter og multikopi tandem gjentas integrering var dårlig i vår studie, må den biologiske betydningen av denne observasjonen som skal avklares.
Til tross for HPV genotyping og streng real- time PCR, var det 14 pasienter med ikke-målbar HPV E2 og E6 i sine svulster som viste den verste overlevelse blant de 4 integrasjons grupper. Det er mulig at svulster uten noen HPV-DNA kan representere de med flere karakteristikker av kreft stamceller som mangler epitelial differensiering hvor viral replikasjon er begrenset med abortiv HPV-replikasjon [13]. I samsvar med denne hypotesen, microarray analyse viste lav uttrykket av gener knyttet til keratinocyte og T-lymfocytter differensiering. Videre basert på disse dataene, er det også antatt at mellom grupper forskjeller i kromatin remodelle kan indusere differensial uttrykk for de ulike gener. Spesielt, kan molekylene assosiert med Rho-GTPase signale bidra til utvikling inn i metastatiske fenotype ved svekkelse av celleadhesjon og morfologisk endring som EMT (epitelial-mesenkymale overgang) i svulstene med dårlig overlevelse som foreslått i vårt tidligere studium [14] . Flere studier må gjøres for å bevise denne ideen
De aktuelle data er i tråd med vår tidligere arbeid som beskrevet høy virusmengde. (HC2test; Digene Corp) var sterkt assosiert med en god prognose, mens pasienter med lavere virusmengde gikk mye verre etter strålebehandling [8]. I sammendraget, har vi bestemt HPV integrering mønstre ved hjelp av en ny kvantitativ PCR metode for å analysere den støkiometri av HPV E2 og E6 og bestemt deres forhold til post-stråling klinisk utfall. Integrasjons mønstre ble således funnet å være en sterk prognostisk faktor som viser en god korrelasjon med andre kjente prognostiske faktorer som stadiet, lymfeknutestatus, histologisk type og differensiering status. Videre studier ved hjelp av større prøvenummer og flere metoder for undersøkelse av HPV integreringsmønstre i livmorhalskreft vil være nødvendig for å bekrefte disse funnene.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Primer og probe sekvenser for E2 og E6 genet real-time PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0078995.s001 plakater (DOC)
Tabell S2.
Gener som viste økende (a) og avtagende (b) lineær trend fra group1 til Group4; Navnet, funksjon, fold endring (FC) av gener og p-verdien av den lineære trenden er vist under genet ontologi klassifisering
doi:. 10,1371 /journal.pone.0078995.s002 plakater (DOC)
