Abstract
JKA97, en benzylidene analog av harmine har blitt funnet å være en lovende kandidat medikament for human cancerterapi, selv om den underliggende molekylære mekanismer som ikke er blitt fullt ut demonstrert. I denne studien har vi evaluert effekten av JKA97 på menneskelig brystkreft celler
in vitro Hotell og
in vivo
. JKA97 hemmet veksten og proliferasjonen av MCF7 (p53 villtype), MCF7 (p53 knockdown), og MDA-MB-468 (p53-mutant) celler på en doseavhengig måte. Behandling med JKA97 arrestert brystkreftceller i G1 fase og induserte apoptose. JKA97 også undertrykte betydelig vekst av MCF7 og MDA-MB-468 xenografttumorer. Det reguleres uttrykket nivåer av G1 fase regulatorer, slik som p21, p27, cyclinE, og cylinD1. JKA97 aktivert p21 transkripsjon, uavhengig av p53, men hadde liten effekt på p21 protein stabilitet /degradering. I sammendraget, våre resultater tyder på at JKA97 hemmer human brystkreft cellevekst gjennom aktivering p21, uavhengig av p53, som gir et grunnlag for å utvikle denne forbindelsen som en roman medikament for human brystkreft terapi
Citation. Yang X Wang W, Qin JJ, Wang MH, Sharma H, Buolamwini JK, et al. (2012) JKA97, en Novel benzyliden Analog av harmine, utøver anti-kreft effekter ved å fremkalle G1 Arrest, apoptose, og p53-Uavhengig oppregulering av p21. PLoS ONE 7 (4): e34303. doi: 10,1371 /journal.pone.0034303
Redaktør: Gen Sheng Wu, Wayne State University, USA
mottatt: 19. januar 2012; Godkjent: 28 februar 2012; Publisert: 27 april 2012
Copyright: © 2012 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. R.Z. ble støttet av NIH tilskudd R01 CA112029 og R01 CA121211 og et stipend fra Susan G. Komen for Cure (BCTR070731). M.H.W. ble støttet av NIH stipend R01 CA91980. J.K.B. ble støttet av NIH stipend R15 CA100102. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
brystkreft er en av de vanligste diagnosen kreft og de viktigste årsakene til kreft dødsfall hos kvinner over hele verden. Ifølge statistiske data fra GLOBOCAN, ble ca 1.38 million nye pasienter diagnostisert med brystkreft og om 458 400 døde på verdensbasis av sykdommen i 2008 [1]. I de siste to tiårene har dødelighet av brystkreft redusert på grunn av tidlig oppdagelse, økt bevissthet og forbedrede eller nye behandlingsformer. Imidlertid visse former for brystkreft er spesielt aggressive og presentere en dårlig prognose. Pasienter med avansert stadium eller residiverende brystkreft ofte vise beskjeden svar på klinisk eksisterende behandlinger og kan også vise motstand mot konvensjonelle kjemoterapeutika [2] – [4]. Den mangelen og dårlig effektivitet av praktiske therapeutics gjør vellykket behandling av brystkreft en utfordring og nødvendiggjør oppdagelsen av alternative cellegifter med nye anti-kreft mekanismer.
naturprodukt orientert syntetiske derivater har spilt en viktig rolle i anti- kreft medisiner [5], [6]. Flere utbredte kjemoterapeutiske midler slik som paclitaxel og actinomycin C ble opprinnelig utviklet fra naturlige produkter. Harmine, en β-karbolin alkaloid hentet fra frøene av giftig plante
Peganum harmala, etter har blitt brukt medisinsk i noen tid som en anti-hypertensive stoffet; opptre ved reversibel hemming av monoaminoksidase A. Studier i det siste tiåret viser at harmine også besatt potente anti-proliferative og cytotoksiske egenskaper [7], [8].
JKA97, også omtalt som metoksy-1-styryl- 9H-pyrido- [3,4-b] indol (MW. 286,35, fig 1 A), er en analog av benzyliden harmine [9], [10]. En fersk rapport viser at JKA97 kan indusere apoptose av tykktarm og lever kreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
av en Bax avhengig og p53-uavhengig mekanisme [10]. Imidlertid er anti-kreft-aktivitet av JKA97 på andre typer av kreft og de nøyaktige molekylære mekanismer av forbindelsen ikke godt forstått. I denne studien, vi utforsket de anti-tumor aktiviteter JKA97 mot brystkreft celler med ulike genetiske bakgrunn, og forsøkte å ytterligere belyse de mulige virkningsmekanismer, noe som gir et grunnlag for fremtidig utvikling av denne agenten som menneskelige brystkreft behandling.
(A) Kjemisk struktur av JKA97. (B) Konsentrasjonen av JKA97 å indusere 50% veksthemning (IC
50) i brystcancerceller, i forhold til de tilsvarende kontroller, basert på MTT-analysen. MCF7, MDA-MB-468, og MCF7 p53KD celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av JKA97 i 72 timer. (C) Anti-proliferative effekter av JKA97 på brystkreftceller. Celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av JKA97 i 48 timer, etterfulgt av BrdUrd inkorpore-ringsanalyse. Indeksen proliferasjon ble beregnet mot ubehandlede kontrollceller (* P 0,05). (D) induksjon av apoptose i brystkreftceller etter JKA97. Celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av JKA97 i 24 timer, etterfulgt av måling av apoptose av Annexin V-analyse. Den apoptotiske Indeksen ble beregnet mot ubehandlede kontrollceller (* P 0,05). (E) Effekter av JKA97 på cellesyklusfordelingen av brystkreftceller. Celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av JKA97 i 24 timer, etterfulgt av måling DNA-innhold ved strømningscytometri. Cellesyklusfordelingen ble evaluert ved å sammenligne med den for kontrollceller (* P 0,05). Alle analyser ble utført i tre eksemplarer. Resultatene var fra minst tre separate, gjentatte forsøk.
Resultatene
JKA97 reduserer brystkreftcellevekst
in vitro
JKA97 ble evaluert for sin effekt på brystkreftcellelevedyktighet
in vitro
ved anvendelse av MTT-analysen. Tre humane brystcancercellelinjer som representerer tre forskjellige genetiske bakgrunner (MCF7 /p53 villtype; MCF7 /p53 knockdown, og MDA-MB-468 /p53 mutant) ble utsatt for forskjellige konsentrasjoner av testforbindelsen (0, 1, 2,5, 5, 10, 25, og 50 uM) i 72 timer og celleoverlevelsesprosentandeler ble bestemt. Som vist i fig. 1B, forbindelsen viste IC
50 verdier på mindre enn 20 um (6,6 til 19,0 um). De MDA-MB-468 og MCF7- p53KD celler syntes å være mer følsomme for det sammensatte enn MCF7 celler.
JKA97 hemmer brystkreft celleproliferasjon
in vitro
I likhet med effekter på celle overlevelse, JKA97 hemmet celleproliferasjon i en doseavhengig måte (fig. 1C). Vesentlige anti-proliferative effekter ble observert i alle tre celletyper med ulike p53-bakgrunn. Ved en konsentrasjon på 20 uM, JKA97 inhiberte proliferasjonen med omtrent 35%, 35% og 45%, i MCF7, MDA-MB-468, og MCF7 p53KD celler, respektivt.
JKA97 induserer apoptose av bryst kreftceller
in vitro
i tillegg til å hemme spredning, JKA97 også indusert apoptose i brystkreftceller. Som illustrert i fig. 1D, alle tre av de undersøkte brystcancercellelinjer viste en signifikant økning (P 0,05) i apoptose etter eksponering til en 20 mM konsentrasjon av forbindelsen. I MCF7, MDA-MB-468, og MCF7 p53KD celler, en 20 uM JKA97 økte apoptotiske indeksen 3,9-ganger, fem ganger, og 4,2 ganger i henholdsvis, sammenlignet med den i kontrollceller.
JKA97 fører G1 fase arrest i brystkreftceller
in vitro
Vi observerte også at JKA97 hemmet cellesyklusprogresjon, som fører til arrestasjon i G1 fasen av cellesyklus i en dose avhengig måte i alle tre cellelinjer (fig. 1E). I både MCF7 og MCF7 p53KD celler, selv ved 5 uM konsentrasjon, JKA97 førte til en signifikant (P 0,05) økning i antallet av celler i G1 fase. På 20 mikrometer konsentrasjon, ble et flertall av cellene arrestert i G1 fasen (P 0,05).
JKA97 avtar xenografttumorer vekst
in vivo
For å finne ut hvorvidt forbindelsen kan også utøve anti-kreft effekt
in vivo
, JKA97 ble administrert til nakne mus som bærer MCF7 eller MDA-MB-468 xenograft tumorer. I MCF7 xenograft-modell, den høye dosen av JKA97 (25 mg /kg) inhiberte tumorvekst med 60% (P 0,05) på dag 18, sammen med den lave dose (5 mg /kg) fører også til en betydelig tumorvekst inhibering (50%, p 0,05; fig 2A1.).
in vivo
anticancer aktivitet av JKA97 ble videre undersøkt i MDA-MB-468 xenograft modell. Denne modellen viste seg å være litt mindre følsom for medikamentet, med lav dose (5 mg /kg) og høy dose (10 mg /kg) reduksjon av tumorvekst med 45% og 52%, henholdsvis (P 0.05, fig. 2B1). I tillegg var det ingen signifikante forskjeller i kroppsvekt mellom kontroller og dyr behandlet med JKA97, eller noen brutto organ abnormiteter ved obduksjon i noen av gruppene (fig. 2A2 og B2).
JKA97 ble administrert ved i.p. injeksjon til nakne mus med MCF7- (A1) eller MDA-MB-468 (B1) xenografttumorer. For mus med MCF7- xenograft tumor, behandlingsgruppene fikk JKA97 ved doser på 5 mg /kg /dag eller 25 mg /kg /dag, 5 dager /uke, i 6 uker; for mus som bærer MDA-MB-468 xenograft tumor, behandlingsgruppene fikk doser på 5 mg /kg /dag eller 10 mg /kg /dag, 5 dager /uke, for 18 dager. Kontrollgrupper fikk bare kjøretøy. Dyrene ble også overvåket for endringer i kroppsvekt som en surrogatmarkør for toksisitet når det ble administrert til nakne mus som bærer (A2) MCF7 eller (B2) MDA-MB-468 xenograft tumorer. På slutten av forsøkene, ble xenografttumorer fjernet og tatt et fotografi (A3 og B3).
JKA97 opp-regulerer p21 uttrykk i en p53-uavhengig måte
neste undersøkte mekanismen (e) av virkningen av JKA97 ved å undersøke dens virkninger på uttrykket nivåer av forskjellige proteiner involvert i cellesyklusprogresjon. Alle tre cellelinjer ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av JKA97 i 24 timer, behandlede celler viste økt p21-ekspresjon i en doseavhengig måte. I tillegg ble CyclinD1, CyclinE, og E2F1 redusert, mens p27 ble økt, mest sannsynlig på grunn av p21-aktivering (fig. 3A). Vi behandlet videre alle tre cellelinjer med 10 uM JKA97 for varierende tidsrom, som vist i fig. 3B. De p21 protein nivåene ble øket i en tidsavhengig måte i alle celler testet, uavhengig av p53 status.
(A) MCF7, MDA-MB-468, og MCF7 p53KD celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av JKA97 i 24 timer, og ekspresjon av p53 og p21 proteiner ble bestemt ved Western blot-analyse. (B) Celler ble eksponert for 10 uM av JKA97 for den angitte tid, og ekspresjon av p53 og p21 proteiner ble bestemt ved Western blot-analyse. β-actin ble brukt som en lik-lasting kontroll av prøver.
JKA97 har liten effekt på stabiliteten til p21 protein
Effektene av JKA97 på p21 regulering ble også bestemt at den posttranskripsjonelt nivå. Alle tre cellelinjer ble utsatt for 10 uM av JKA97 eller oppløsningsmiddel i 24 timer, etterfulgt av tilsetning av proteinsynteseinhibitor, cykloheksimid (CHX, 10 uM). Som vist på fig. 4A, var det ingen merkbar forskjell i p21 protein stabilitet mellom celler eksponert for JKA97 og de som utsettes bare for løsningsmidlet.
(A1) MCF7, MDA-MB-468, og MCF7 p53KD celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av JKA97 eller vehikkel i 24 timer, etterfulgt av eksponering til proteinsynteseinhibitor cycloheximide (CHX, 10 ug /ml). p21-protein ekspresjon ble påvist ved Western blotting ved forskjellige tidspunkter etter eksponering av CHX. (A2) Grafen viser kvantifisering av Western blotting data. MCF7 (B1), MDA-MB-468 (B2) og MCF7 p53KD (B3) Celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av JKA97 eller vehikkel i 24 timer, og total RNA ble ekstrahert etterfulgt av revers transkripsjon, og påvisning mRNA nivå av p21 etter real-time kvantifisering PCR og kvantifisering RT-PCR, normalisert ved mRNA nivået av GAPDH. (C) Cellene ble transfektert med p21 promoter luciferase reporter plasmid og et Renilla luciferase reporter sammen i 12 timer, fulgt av behandling av 10 uM JKA97 eller kjøretøy i ytterligere 24 timer. Reporteren-aktiviteten ble normalisert til den tilsvarende Renilla luciferase reporter. Luciferase-assay ble utført i tre eksemplarer. Statistisk signifikans ble bestemt sammenlignet med kontroll (* P 0,05).
JKA97 induserer p21 transkripsjon
For å finne ut om p21 oppregulering av JKA97 resulterte økt mRNA på transkripsjonsnivået, alle tre cellelinjer ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av JKA97 i 24 timer, og de p21 mRNA-ekspresjonsnivåer ble bestemt ved sanntids-PCR. Tilleggs semi-kvantifisering RT-PCR ble ansatt for konsistens. Som illustrert i fig. 4B, ekspresjon av p21 mRNA ble økt med JKA97 på en doseavhengig måte.
For ytterligere å demonstrere hvordan JKA97 påvirker p21 transkripsjon, et humant full-lengde p21-promoteren reporter ble transfektert inn i alle tre cellelinjer, og disse cellene ble deretter utsatt for JKA97 (10 uM). Som vist på fig. 4C, luciferase aktiviteter av p21 reporter ble betydelig økt med 7,1 ganger, 13,4 ganger, og 6,6 ganger hos MCF7-, MDA-MB-468, og MCF7- p53KD celler, henholdsvis.
Diskusjoner
Tidligere studier indikerer at JKA97 indusert apoptose av tykktarm og lever kreftceller ved en p53-uavhengig og Bax avhengig vei [10]. Men andre mulige mekanismer og sammensatte potensial for behandling av andre krefttyper har ennå ikke fullstendig klarlagt. Så langt vi kjenner til, er denne studien den første til å undersøke både
in vitro Hotell og
in vivo
anti-tumor effekter av romanen harmine benzylidene analog i menneskelige brystkreft celler. Studien belyser flere viktige punkter: 1) JKA97 hemmer brystkreft cellevekst vesentlig; 2) JKA97 induserer celle apoptose; 3) inhibering av celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon synes å være viktig mekanisme ved hvilken JKA97 utøver sin anti-kreft effekt; 4) JKA97 opp-regulerer p21 ekspresjonen på transkripsjonsnivå, snarere enn post-transkripsjonelle nivå, uavhengig av p53; og 5) JKA97 reduserer veksten av humane brystcancer xenograft tumorer i mus på en doseavhengig måte.
Våre resultater viste at det var store forskjeller i hvilke celleoverlevelse etter JKA97 behandling, som bestemt ved MTT- assay, med MDA-MB-468-celler som er den mest følsomme (fig. 1B). MTT målings representerer det totale celleoverlevelse, som kan bli påvirket av ulike faktorer, inkludert i det minste celle proliferasjon, apoptose, og cellesyklusprogresjon. Derfor vi videre bestemmes effekten av JKA97 for celleproliferasjon, apoptose og cellesyklusfordeling. Vi brukte BrdU-inkorporering analyse for å bestemme indeksen celleproliferasjon. Selv om det var doseavhengige effekter på celleproliferasjon i hver av de testede cellelinjene anvendt i denne studien var det ingen bemerkelsesverdige forskjeller mellom MCF7 (p53 WT) og MDA-MB-468 (p53-mutant) celler, noe som indikerer at JKA97 virkningene på celleproliferasjon er p53-uavhengig. Interessant, p53 KD MCF-7-celler var mer følsomme enn andre to cellelinjer (Fig. 1C). Imidlertid, MDA-MB-468-celler ble vist å være mer følsom på apoptose (Fig. 1D) og cellesyklusfordeling analysen (fig. 1E). For eksempel, ved den høyeste dosen som brukes (20 uM), MCF7 og MCF7-celler p53 KD økt apoptose på samme måte, men MDA-MB-468-celler var mer følsom. Tatt sammen, våre resultater indikerer at induksjon av apoptose og cellesyklus-stans er mest sannsynlig å være relatert til forskjeller i celleoverlevelsesanalyse mellom de tre cellelinjer. De detaljerte mekanismer må utforskes i fremtidige studier.
I denne studien viste også vi at JKA97 hadde betydelig
in vivo
antitumoraktivitet i to brystkreft xenograft modeller. På 5 mg /kg dosenivå, har vi observert lignende svar på behandlingen mellom de to modellene. Siden vi brukt ulike høyere doser i MCF7 og MDA-MB-468-modeller, er det vanskelig å sammenligne responskurver. Den anvendes i MDA-MB-468-modellen (10 mg /kg) dose var mindre enn halvparten av dosen i MCF7-modellen (25 mg /kg), men som genereres tilsvar tumorvekstinhibitering priser. Vi spekulerer i at MDA-MB-468 celler er mer følsomme. Tatt i betraktning at det er andre faktorer som påvirker
in vivo
respons på JKA97 behandling, kan vi ikke trekke fast konklusjon om forskjellen mellom de to modellene. Videre studier er nødvendig for å demonstrere slike forskjeller og underliggende mekanismer.
Hindring av cellesyklusutvikling i kreftceller er ansett som en av de mest effektive strategier for kontroll av tumorvekst [11]. Skiftet fra en sovende hviletrinn (G0) til en aktivt voksende stat er en forutsetning for oppføring i cellesyklusen i de fleste celler og et viktig skritt for kreftceller. Cellesyklusprogresjon blir modulert av regulatorer som er kjent som cyklin-avhengige kinase (CDK) inhibitorer. Den første av disse proteinene for å bli identifisert og klonet p21 er [12] – [14]. Den p21 protein, en universell cellesyklus-hemmer, binder seg til cyclin-CDK komplekser og prolifererende cell nuclear antigen, og dermed indusere celle arrest i G1 og blokkerer celle inntreden i S-fasen. Med dette i tankene, sjekket vi forholdet mellom G1 arrest og cellesyklus relaterte regulatoriske proteiner inkludert p53, p21 og p27, etter behandling. Våre resultater viser at JKA97-mediert G1 arrest i brystkreftceller, ble koblet p21, uavhengig av p53 status (villtype, mutant, eller knockdown). Den opp-regulering av p21 og P27 proteiner øker dannelsen av komplekser med G1-S CDK og cykliner, og dermed hemme deres aktiviteter [15] – [17]. Dette antas å være den første rapport for å demonstrere mekanismen for p53-uavhengig G1 cellesyklus-stans indusert ved JKA97 i brystkreftceller. Vår undersøkelse videre demonstrert at oppregulering av p21 indusert av JKA97 var i hovedsak avhengig av en transkripsjonen mekanisme i stedet for en post-translasjonell endring. Fremtidige studier bør undersøke de underliggende mekanismene for hvordan JKA97 opp-regulerer p21 transkripsjon og påvirker nedstrøms trasé.
Mange forskere har foreslått at cellesyklus og apoptose kan knyttes. Molekyler som virker på celler i G1 fasen er vanligvis antatt å påvirke apoptose; CDK-hemmere har blitt foreslått å være indirekte involvert i apoptose gjennom regulering av CDK. P21, en større CDK-inhibitor, er indusert av begge p53-avhengige og-Uavhengig mekanismer følgende spenning [18]. I tillegg er det rapportert at overekspresjon av p21 fører til en induksjon av Bax og fremmer apoptose [19]. Tatt i betraktning at
Luo et al.
[10] har vist at JKA97 kan indusere apoptose i tykktarmskreftceller i en Bax-avhengig men p53-uavhengig måte, kreves det ytterligere arbeid som er nødvendig for å korrelere forholdet mellom cellesyklus-stans og apoptose trasé regulert av forbindelsen.
observasjonene fra denne studien gitt rasjonell bevis for anvendelsen av JKA97 som et anti-tumormiddel for human brystcancerterapi. Våre resultater, tatt i forbindelse med tidligere resultater for denne forbindelsen, tyder på at anti-cancer aktiviteten til JKA97 er uløselig forbundet med modulering av p21. Videre studier som involverer p21 mangelfulle systemer ville være nødvendig for å full måle graden av involvering av denne viktige protein. Denne studien, sammen med tidligere rapporterte funn [10], vil sikkert forbedre vår forståelse av virkningsmekanismer av JKA97, noe som gir grunnlag for videre preklinisk og klinisk evaluering av forbindelsen som en roman anti-kreft agent.
Materialer og metoder
test Compound, kjemikalier og reagenser
test~~POS=TRUNC forbindelsen~~POS=HEADCOMP JKA97, metoksy-1-styryl-9H-pyrido [3,4-b] indol, ble syntetisert og renset som tidligere rapportert [10], og strukturen ble bekreftet ved hjelp av UV, IR, MS og NMR-spektroskopi [10]. Renheten av testforbindelsen ble bestemt til å være større enn 95% med HPLC og MS-analyser. Alle kjemikalier og løsemidler som ble brukt var av analytisk kvalitet eller den høyeste grad tilgjengelig. Cellekultur forsyninger som dyrkningsmedier, fosfat-bufret saltvann (PBS), føtalt bovint serum (FBS), natriumpyruvat, ikke-essensielle aminosyrer, og penicillin-streptomycin ble oppnådd fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Antistoffer mot human p21 (C-19), p27 (C-19), Cyclin D1 (DCS-6), Cyclin E (HE12), og E2F1 (KH95) var fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA) . Den anti-humant p53-antistoff (Ab-6) var fra EMD Chemicals, Inc. (Gibbstown, NJ). Den anti-human β-aktin-antistoff (T5168) var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Cellelinjer og kultur
human brystcancer MCF7 og MDA-MB-468 -celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). MCF7 og MDA-MB-468-celler ble dyrket i MEM medium inneholdende 1 mM ikke-essensielle aminosyrer og Earles BSS, 1 mM natriumpyruvat og 10 mg /l bovint insulin, og DMEM /F-12 Hams media (DMEM /F- 12 01:01 blanding). MCF7 p53KD celler ble generert ved hjelp av den metode som er beskrevet tidligere [20], [21] og ble dyrket i det samme mediet som MCF7 celler, men supplert med 0,5 ug /ml puromycin (Sigma; St. Louis, MO). All cellekulturmedier inneholdt 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin, med mindre annet er spesifisert.
Cell Survival analysen
Effektene av JKA97 på human brystkreft cellevekst ble bestemt ved hjelp av MTT analyse og uttrykt som prosentandelene av kontrollcelleoverlevelse [22] – [25]. Cellene ble dyrket i 96-brønners plater, såing i en tetthet på 4-5 x 10
3-celler per brønn, og eksponert mot forskjellige konsentrasjoner av testforbindelse (0 og 50 IM) i 72 timer. 10 ul av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) -løsning (5 mg /ml; Sigma, St. Louis, MO) ble deretter tilsatt. Absorbansen ved 570 nm ble registrert ved hjelp av en SYNERGY Mx mikroplateleser (BioTek, Winooski, VT). Den celle overlevelse (%) ble beregnet ved å dividere den midlere OD av forbindelse-inneholdende brønner ved at av kontrollbrønnene.
Cell Proliferation Assay
Virkningene av JKA97 på celleformering ble bestemt etter den BrdUrd innlemmelse analysen (Oncogene, La Jolla, CA), etter produsentens protokoll. Celler ble sådd ut i 96-brønners plater (8 x 10
3 til 1,2 x 10
4 celler per brønn) og inkubert med forskjellige konsentrasjoner av JKA97 (0, 5, 10 og 20 IM) i 48 timer. BrdUrd ble tilsatt til mediet 10 timer før avslutning av forsøket. Den BrdUrd inkorporert i cellene ble bestemt ved hjelp av anti-BrdUrd antistoff, og absorbansen ble målt ved to bølgelengder på 450/540 nm med en synergi Mx mikroplateleser (BioTek, Winooski, VT).
Påvisning av apoptose
Celler i tidlige og sene stadier av apoptose ble oppdaget ved hjelp av en Annexin V-FITC apoptose deteksjon kit fra BioVision (Mountain View, California). I korte trekk, 4-5 x 10
5 celler per brønn ble eksponert for testforbindelsen (0, 5, 10 og 20 uM) og inkubert i 24 timer før analyse. Celler ble samlet opp og vasket med serumfritt medium, og deretter resuspendert i 500 ul av Annexin V bindingsbuffer, etterfulgt av tilsetning av 5 ul av Annexin V-FITC og 5 ul av propidiumjodid (PI). Prøvene ble inkubert i mørket i 5 min ved romtemperatur og analysert med en FACSCaliber flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, California).
Cell Cycle Målinger
For å fastslå effekten av JKA97 på cellesyklusfordeling, 4-5 x 10
5 celler per brønn ble eksponert til forbindelsen (0, 5, 10 og 20 im) og inkubert i 24 timer før analyse. Celler ble høstet og fiksert i 75% etanol ved 4 ° C over natten, etterfulgt av inkubasjon med RNase og farging med propidiumjodid (Sigma). DNA ble bestemt ved flowcytometri som angitt ovenfor.
Mus Xenotransplantat Model of Human Breast Cancer
Bruk dyr og omsorg protokollen ble godkjent av Institutional Animal bruk og vedlikehold komiteen i Texas Tech University Health Sciences Senter (IACUC # 10032, PHS Assurance # A 3056-01, USDA Registrering # 74-R-0050, NR # 039461). Kvinnelige atymiske patogenfrie nakne mus (nu /nu, 4-6 uker) ble anskaffet fra Charies River Laboratories International, Inc. (Wilmington, MA). Å etablere MCF7 menneskelige brystkreft xenograft tumor modell, hver av de kvinnelige hårløse mus ble først implantert med en 60-dagers subkutan slow release østrogen pellet (SE-121, 1,7 mg 17β-østradiol /pellet) hentet fra nyskapende forskning of America (Sarasota , FL). På den følgende dag, ble MCF-7-celler høstet fra monolagskulturer ble vasket to ganger med serumfritt medium, resuspendert i mediet, og deretter injisert s.c. (5 x 10
6-celler, totalvolum 0,2 ml) inn i det venstre inguinale området av musene. For MDA-MB-468 xenograft modell, vi brukte samme fremgangsmåte som ovenfor, men uten østrogen pellet. Alle dyrene ble overvåket for aktivitet, fysisk tilstand, kroppsvekt og tumorvekst. Tumorstørrelse ble bestemt hver dag ved kalibermåling av to perpendikulære diametere implantatet. Tumormasse (i g) ble beregnet av formelen, 1/2
en
×
b
2 der «
en
» er den lange diameter og »
b
«er den korte diameter (i cm).
in vivo
kjemoterapi med JKA97
dyrene peiling menneskelige kreft xenografttumorer ble tilfeldig delt i forskjellige behandlingsgrupper og en kontrollgruppe (7-10 mus /gruppe). Kontrollgrupper for begge modellene mottok bare bæreren. For MCF7 xenograft modell, ble JKA97 oppløst i bæreren, PEG400: etanol: saltløsning (57.1:14.3:28.6, v /v /v), og ble administrert ved i.p. injeksjon i doser på 5 og 25 mg /kg /dag, 5 dager /uke i ca. 3 uker. For MDA-MB-468 xenograft modell, ble JKA97 administrert av i.p. injeksjon i doser på 5 og 10 mg /kg /dag, 5 dager /uke i 6 uker. På slutten av forsøkene ble xenograft tumorer fjernet, veiet og fotografert etter poster.
Western Blot analyse
proteinnivåer i cellelysatene ble undersøkt ved hjelp av Western blotting som beskrevet tidligere [20 ], [21]. I korte trekk ble cellene eksponert for forskjellige konsentrasjoner av JKA97 i 24 timer og cellelysatene ble fraksjonert med identiske mengder av protein ved SDS-PAGE. Proteinene ble overført til Bio-Rad trans-Blot nitrocellulosemembraner (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) som deretter ble inkubert i blokkeringsbuffer (Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween 20 og 5% fettfri melk) i 1 time ved romtemperatur. Deretter ble membranene inkubert med de passende primære antistoffer over natten ved 4 ° C eller 2 timer ved romtemperatur, med forsiktig risting. Membranene ble vasket med skyllebuffer (Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween 20) tre ganger i 15 min og deretter inkubert med geite-anti-mus /-kaninIgG-pepperrot-peroksidase-konjugert antistoff (Bio-Rad) i 1 time ved romtemperatur. Etter vask tre ganger ble proteinene av interesse påvises ved hjelp forbedrede Chemiluminescence reagenser fra PerkinElmer LAS, Inc (Boston, MA).
RNA ekstraksjon, og semi-kvantitativ og sanntids kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av Trizol reagens fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Første-tråd cDNA ble syntetisert med 1 pg av total RNA-ekstrakt ved hjelp av iScript cDNA syntesesett (Bio-Rad, Hercules, CA). Primersekvensene som benyttes for amplifisering av gener var som følger: p21 fremover, 5′-AGC AGC GGA ACA AGG AGT-3 «, revers, 5′-TGG AGA AAC GGG AAC CAG-3′; GAPDH fremover, 5»-GGA GTC CAC TGG CGT CTT CAC-3 «, revers, 5′-GAG GCA TTG CTG ATG ATC TTG AGG-3». Semi-kvantitativ RT-PCR ble utført med blanding av cDNA produkt, primere, dNTP og Taq DNA-polymerase (Invitrogen) ved anvendelse av sykluser på 95 ° C i 30 s, 57 ° C i 30 s, og 72 ° C i 30 s, etterfulgt av en endelig forlengelse ved 72 ° C i 5 minutter. Sanntids PCR ble utført i 40 sykluser bestående av 95 ° C i 20 s, 57 ° C i 20 s og 72 ° C i 20 s ved hjelp av en maskin iQ5 (Bio-Rad, USA). Alle prøvene ble analysert ved sammenlignende terskelen syklus (C
T) metode og normalisert til GAPDH mRNA kontroll.
Luciferase Assay
Celler ble transfektert med full lengde human p21 promoter vektorer med
Renilla
luciferase reporter (som intern kontroll, Promega, Madison, WI) i 24 timer, etterfulgt av inkubasjon med JKA97 i 24 timer. Luciferaseaktiviteten av p21 promoter reporter ble bestemt med Dual-luciferase reporter Assay System (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens instruksjoner. Den p21 reporter aktiviteten ble normalisert til den tilsvarende
Renilla
luciferaserapportørplasmid aktivitet.
Statistical Analysis
Data om forskjellige behandlingsgrupper er presentert som gjennomsnitt ± standardfeil. Enveis ANOVA fulgt av S-N-K post hoc test ble anvendt for å bestemme signifikans av forskjellene mellom behandlingsgrupper og kontroller. Resultatene ble ansett som statistisk signifikant når P . 0,05
Takk
Vi takker legene. X. Zhang, H. Xu, X. Zhang, L. Ao, E. Rayburn, og D. Chen for utmerket teknisk assistanse og nyttig diskusjon, og Mr. S. Voruganti og frøken S. Nag for å lese manuskriptet.
