Abstract
Resistent kreft fenotype er en viktig hindring i vellykket behandling av prostatakreft. Hovedmålet med studien var å utforske resistensmekanismer i den avanserte typen prostatakreftceller (PC-3) og for å avklare hvilken rolle autophagy i disse prosessene. Vi utførte time-lapse forsøket (48 timer) med ROS generere plumbagin ved hjelp multimodale holografisk mikroskop. Videre også utførte vi den flow-cytometri analyse og QRT-PCR analyse av genuttrykk ved 12 utvalgte tidspunkter. TEM og Konfokalmikroskopi ble brukt til å bekrefte resultatene. Vi fant ut at autofagi (nemlig mitophagy) er en viktig motstand mekanisme. De store ROS produserende mitokondrier ble belagt med en membran autophagic avledet fra endoplasmatisk retikulum og degradert. Ifølge våre resultater, kan øke ROS motstand skal også ledsages av økt gjennomsnittlig cellestørrelse og Polyploidisering, som synes å være nøkkelen motstand mekanisme når den er tilkoblet med en flukt fra alderdom. Mange forskjellige typer celle-celle interaksjoner ble registrert inkludert entosis, vesikulært overføring, spising av døde eller døende celler, og engulfment og kannibalisme av levende celler. Entosis ble avslørt som en mulig mekanisme for Polyploidisering og aktivert den langsiktige overlevelsen av kreftceller. Betydelig redusert cellemotilitet ble funnet etter plumbagin behandling. Vi fant også en omfattende induksjon av pluripotency gener uttrykk (
Nanog
,
SOX2
, og
POU5F1
) på tidspunktet punktet i 20 timer. Vi antar, at overekspresjon av pluripotency gener i den del av prostata tumorcellepopulasjon utsettes for ROS fører til høyere utviklings plastisitet og evne til raskere reagere på endringer i det ekstracellulære miljøet som kan til slutt føre til en endring av celle skjebne.
Citation: Balvan J, Gumulec J, Raudenska M, Krizova A, Stepka P, Babula P, et al. (2015) Oksidativt stress Resistance i metastatisk prostatakreft: Fornyelse av Self-Eating. PLoS ONE 10 (12): e0145016. doi: 10,1371 /journal.pone.0145016
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 15 september 2015; Godkjent: 25 november 2015; Publisert: 15.12.2015
Copyright: © 2015 Balvan et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra det medisinske fakultet, Masaryk universitet til junior forsker (Michal Masarik) og ved prosjekt MUNI /A /1549/2014 og MUNI /A /1326/2014 med støtte fra Specific University Research Grant, som fastsatt av departementet for utdanning, ungdom og sport i Tsjekkia i år 2015. de bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Den kommersielle selskap (TESCAN) gitt støtte i form av lønn for forfatteren Aneta Krizova, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Den spesifikke rolle denne forfatteren er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. Samarbeidet med et kommersielt selskap (TESCAN) endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer .
Innledning
Prostatakreft (PC) er en av de hyppigst diagnostiserte krefttyper hos menn. De fleste av prostata kreft er i utgangspunktet lydhør overfor androgen deprivasjon terapi, men senere skulle dukke opp en aggressiv, androgen-uavhengig fenotype motstandsdyktig mot konvensjonell terapi. Denne avanserte type prostatakreft metastasizes enkelt. Hematogeneous metastaser er vanligvis til stede i 35% av pasienter med prostatakreft med den hyppigste lokalisasjon i bein (90%). Den mye studert modell for androgen-uavhengig, avansert, metastaser produserende prostatakreft er PC-tre cellelinje etablert fra korsmetastasering av en 62 år gammel hvit mann med karakteren 4 av prostata adenokarsinom. PC-3 celler er hemizygous for 17p kromosom, og deres eneste eksemplar av
p53
genet har et stoppkodon i posisjon 169 [1]. Som et resultat, har PC-3-celler ikke uttrykker funksjonell p53-protein, noe som gjør den ganske motstandsdyktig overfor p53-mediert apoptose [2]. Videre har vi valgte PC-3-cellelinjen og ikke DU145, fordi DU145 prostata kreftceller uttrykker PTEN, som ikke uttrykkes av PC-3-celler [3, 4]. Flere funksjonelle studier støtter rollen PTEN som en kritisk tumor suppressor i prostatakreft [5-7].
I vår forrige undersøkelse viste vi at PC-tre cellelinjen viste høyere motstand mot cisplatin-indusert apoptose og ikke mindre andel av G2 /M fraksjon (4n DNA innhold) tydelig i 22Rv1 celler [8]. Cisplatin er primært ansett som et DNA-ødeleggende middel, som danner forskjellige typer hardt repareres addukter med cellulær DNA [9]. I tillegg til DNA-skade, cisplatin induserer også reaktive oksygenarter (ROS) [10]. På grunn av det faktum, har vi fokusert på en annen ROS-produserende reagens, plumbagin [11], som ikke utgjør en DNA-addukter, for å vurdere betydningen av celledød modulering og håndtering av ROS for PC-3-motstand. Plumbagin (5-hydroxy-2-metyl-1,4-naphthoquinone) forekommer naturlig i medisinsk urt
Plumbago zeylanica L
. og tilhører naftokinoner. Naftokinoner vise sine cytotoksiske handlinger gjennom to måter: som pro-oksidanter, redusere oksygen til reaktive oksygenforbindelser; og som elektrofiler, som danner kovalente bindinger med vev-nukleofiler [12]. Videre plumbagin ble også vist å undertrykke aktivering av nukleær faktor-kB (NF-kB) [13].
I nyere studier, ble ROS generasjon forbundet med mitokondrier som en følge av nedsatt mitokondriell proteinsyntese [ ,,,0],10]. Videre ble det påpekt at celler med et underskudd på funksjonelle mitokondrier er mer motstandsdyktige mot celleskader ved cisplatin [14]. Men Panov
et al
. funnet ut, at prostata kreftcellelinjer LnCap, PC-3, og DU145 inneholdt 2 til 4 ganger mer mitokondrier per gram av celler enn normale prostata epitelceller. Luftveis aktiviteter mitochondria isolert fra normale prostata epitelceller var også 5-20 ganger lavere enn de av mitokondrier isolert fra prostatakreftceller [15]. Derfor antar vi at det finnes noen beskyttende mekanismer mot ROS i PC-3 celler. Mange celleskader forårsaket av ROS kan være subletal (spesielt hvis de undersøkte cellene har forstyrret apoptose-utløser mekanismer) og resultere i en endret stabil tilstand hvori de skadede celler som er i stand til å overleve. Selv om en skadet celle drives til oncosis (oncosis er en pre-dødelig fase som følger en alvorlig celleskade) eller begynnende alderdom, er det sannsynligvis noen mekanismer for å reversere denne prosessen [16-18], særlig hvis cellen er i stand til å bli kvitt skadelige faktorer og gjenopprette ATP produksjon. En mulig måte å få nok energi for overlevelsen kan være autofagi [19], kannibalisme eller entosis [20, 21]. Autophagy ble først ansett som en mekanisme som undertrykker ondartet transformasjon. Imidlertid ble sterke bevis for en dobbel rolle autofagi oppdaget [22]. I tidlige svulster, kan autofagi være virkelig en potent tumor suppressor fordi det kan forsikre organeller og protein kvalitetskontroll og forhindre genomisk ustabilitet og Aneuploidy organ [23]. Men det er betydelige bevis på at autofagi har en kreftfremmende rolle i etablerte svulster [24].
En av de viktigste histopatologiske trekk ved menneskelige solide svulster er forekomsten av store atypiske kreftceller med formert kjerne-DNA som er kjent som polyploide kjempekreftceller (PGCCs). Økt PGCCs tall vises vanligvis i slutten av sykdomsstadier og karakterer eller som følge av kjemoterapi [25]. Et viktig mål med studien var å undersøke mulige mekanismer for forsvar mot ROS i avansert type av prostata kreft celler. Vi prøvde å vurdere rollen til autofagi og dannelsen av polyploide gigantiske kreftceller (PGCCs) i avansert type av prostatakreft. Vi har også forsøkt å verifisere en hypotese om at autofagi kan være mekanismen for resistens mot ROS i stedet for den mekanisme av celledød. Denne hypotesen støttes av nyere funn tyder på at godt karakterisert autofagi aktivatorer og mTOR-hemmere (for eksempel rapamycin, PP242, eller resveratrol) markert forbedre hastigheten og effektiviteten av puripotent stamceller generasjon [26].
Materialer og metoder
kjemiske og biokjemiske reagenser
Hams F12 medium, føtalt bovint serum (FBS), (mycoplasma gratis), penicillin /streptomycin og trypsin ble kjøpt fra PAA Laboratories GmbH (Pasching, Østerrike). Fosfatbufret saltoppløsning (PBS) ble innkjøpt fra Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA, USA). Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA), ble plumbagin og andre kjemikalier av ACS renhet kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA), med mindre annet er angitt.
Cellekulturer og dyrkede celle forhold
Menneskelige PC-3 prostata kreftceller ble anvendt i denne studien (passasje 18-24). PC-tre cellelinje ble etablert fra klasse 4 prostatahyperplasi adenokarsinom fra 62 år gammel hvit mann og stammer fra metastatisk nettstedet i bein. PC-3-cellelinjen ble anskaffet fra HPA kultursamlinger (Salisbury, UK).
PC-3-celler ble dyrket i Hams F12-medium med 7% FBS. Mediet ble supplert med penicillin (100 U /ml) og cellene ble opprettholdt ved 37 ° C i fuktet inkubator med 5% CO
2. Hypoxy /sult-resistente PC-3, ble utvalgt ved dyrkning uten tilgang på oksygen og uten medium erstatning for en måned.
plumbagin behandling
stamløsning av plumbagin ble fremstilt i dimetylsulfoksyd ( DMSO) og fortynnet med mediet. Et like stort volum av DMSO (sluttkonsentrasjon ≤ 0,1%) ble tilsatt til kontrollene. Den plumbagin behandling ble startet etter at cellene nådde konfluens på ~ 50%. For cytotoksisitet vurdering, et område av konsentrasjoner for 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, og 6 pmol /l av plumbagin ble anvendt. Tidspunkter for celle høsting og dermed for senere analyser var 0 timer, 40 min., 1,5, 4, 6, 8, 10, 16, 20, 24, 36 og 48 timer.
Cell innhold kvantifisering
Totalt celleinnhold ble målt ved hjelp av Casy modell TT system (Roche Applied Science, USA) og følgende protokoll: først, kalibrering ble utført fra prøvene av levedyktige og nekrotiske celler. For de nekrotiske celler, ble 100 ul cellesuspensjon og 800 pl Casy blå løsning blandet og etterlatt i 5 minutter ved romtemperatur. Deretter ble 9 ml CasyTone tilsatt. For å fremstille en levedyktig celle-standard, ble 100 ul av cellesuspensjon blandet med 10 ml CasyTone. Alle påfølgende målinger ble utført på 100 x 100 ul fortynnet cellesuspensjon. Før hver måling ble bakgrunn subtrahert. Alle prøver ble målt i duplikater.
Måling av cellelevedyktighet-MTT-test
suspensjon av 5000 celler ble tilsatt til hver brønn av standard mikrotiterplater. Volum på 200 ul ble overført til brønnene 2-11. Mediet (200 ul) ble tilsatt til den første og til den siste kolonne (1 og 12, kontroll). Platene ble inkubert i 2 dager ved 37 ° C for å sikre cellevekst. Mediet ble fjernet fra kolonne 2 til 11. Kolonner 3-10 ble fylt med 200 ul medium inneholdende en øket konsentrasjon av plumbagin (0-6 umol /l). Som en kontroll, ble kolonnene 2 og 11 fylt med mediet uten plumbagin. Platene ble inkubert i 12 og 24 timer, og deretter ble mediet fjernet og cellene ble vasket i PBS. Kolonnene 1-11 ble fylt med 200 ul medium inneholdende 50 ul av MTT (5 mg /ml i PBS), inkubert i fuktig atmosfære i 4 timer ved 37 ° C, og innpakket i aluminiumsfolie. Etter inkubering ble MTT-holdige medium erstattet med 200 ul av 99.9% dimetylsulfoksid (DMSO) for å oppløse MTT-formazan-krystaller. Deretter ble 25 ul av glycin-buffer tilsatt til alle brønner og absorbansen ble bestemt umiddelbart ved 570 nm (VersaMax mikroplateavleser, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
Cell vekst og spredning ved benyttelse impedansmåling
celle~~POS=TRUNC vekst~~POS=HEADCOMP ble analysert ved hjelp av real-time celle analyse (RTCA) system (xCELLigence; Roche Applied Science og ACEA biovitenskap). For det første var den optimale konsentrasjon for såing proliferasjon og cytotoksisk analyse bestemmes. PC-3-celler ble sådd ut ved en tetthet på 7000 celler per brønn i E-skiver 16. Etter poding av det totale antall celler i 200 ul medium i hver brønn, i E-plate 16, vedlegget, spredning og spredning av cellene ble overvåket hvert 15. min. Etter 24 timer ble plumbagin tilsatt og celleindeks (CI), som reflekterer cellenes levedyktighet, ble overvåket. Alle forsøk ble utført for 250h. Resultatene er uttrykt som en celle indeks som bruker produsentens programvare (Roche Applied Science og ACEA biovitenskap). Forsøkene ble gjort i duplikater.
flowcytometrisk analyse av celledød
Dobbelt farging med fluorescein (FITC) /propidiumjodid (PI) ble foretatt ved hjelp av Annexin V-FLUOS-farging kit (Roche Applied Science) i henhold til produsentens protokoll for å bestemme prosentandelene av levedyktige, apoptotiske og nekrotiske celler etter eksponeringen for plumbagin. I korthet ble cellene høstet ved gjentatt pipettering og vasket to ganger med PBS (sentrifugert ved 2000 rpm i 5 min), resuspendert i 100 ul Annexin-V-FLUOS merking løsning og inkubert i 15 min. i mørke ved 15-25 ° C. Annexin V-FITC bindende ble oppdaget av flowcytometri (Partec GmbH, Münster, Tyskland) (Ex = 488 nm, Em = 533 nm, FL1 filter for Annexin-V-FLUOS og FL3 filter for PI).
strømningscytometrisk deteksjon av autophagosomes
Autophagosome formasjonen i PC-3 celler ble oppdaget ved hjelp av CYTO-ID Autophagy Detection Kit (Enzo, PA, USA) etter produsentens anvisninger. De CYTO-ID grønn fluorescerende reagenser spesifikt påvise syre autophagic vakuoler dannet under autofagi. I korthet ble cellene høstet ved forsiktig gjentatt pipettering, spunnet ned og vasket to ganger i RPMI 1640 med 5% føtalt bovint serum (FBS). Cellene ble resuspendert i 500 ul friskt fortynnet CYTO-ID farging reagens og inkubert i mørke ved 37 ° C i 30 minutter. CYTO-ID fluorescens av celler ble umiddelbart analysert ved flowcytometri hjelp flyten cytometr (Partec GmbH, Münster, Tyskland) (Ex = 480 nm, Em = 530 nm, FL1 filter for CYTO-ID, SSC for cellulær detalj). Prosentandelen av celler med CYTO-ID farging ble brukt til å representere dannelsen av autophagosomes.
flowcytometrisk analyse av intakte friske celler
Celle pellet ble fremstilt som nevnt ovenfor. Cellene ble resuspendert i 500 ul friskt fortynnet 1 uM SYTO 16 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) fargeløsning og inkubert i mørke ved 37 ° C i 45 min. SYTO 16 fluorescens av celler ble umiddelbart analysert på samme instrument som nevnt ovenfor (Ex = 488 nm, Em = 518 nm, FL1 filter for SYTO 16, FSC for cellestørrelse). Prosentandelen av SYTO 16-positive celler ble analysert. Dataene ble analysert ved bruk av Flomax programvare (Partec GmbH, Münster, Tyskland).
fluorescens mikroskopi og cellefarging
For fluorescens mikroskopi, cellene ble dyrket direkte på mikroskop glass (75×25 mm , tykkelse 1 mm, Menzel Glasser, Braunschweig, Tyskland) i Petri-skåler i det ovenfor beskrevne dyrkingsmedium (se Dyrkede celleforhold). Cellene ble overført direkte på skinnene, som ble nedsenket i dyrking media. Etter behandlingen ble de mikroskop objektglass med et monolag av celler fjernet fra petriskålene, skyllet i dyrkningsmediet uten plumbagin tilskudd og PBS-buffer og anvendt direkte for farging og fluorescensmikroskopi.
Cellene ble inkubert med følgende svært spesifikke fluorescerende prober: reaktive oksygenforbindelser ble visualisert ved hjelp CellROX Deep Red reagens (life Technologies, USA, fem mikrometer, celle-permeant, livs celle beis med absorpsjon /emisjon maxima av 644/665 nm), ble mitokondrier visualisert bruker MitoTracker Grønn FM (life Technologies, USA, 300 nM, celle-permeant livs celle flekken med absorpsjon /emisjon maxima av 490/516 nm), og endoplasmatiske retikulum ble visualisert ved hjelp av eR-Tracker Red (life Technologies, USA, 1 mikrometer , celle-permeant, livs celle flekken med absorpsjon /emisjon maxima av 587/615 nm). Etter inkubering (45 min, 37 ° C, mørke), ble cellene vasket tre ganger med PBS-buffer (0,05 M, pH 7,0) og observert under konfokale mikroskop (Leica TCS SP8 X, Tyskland) ved anvendelse av passende eksitasjons- og emisjonsbølgelengder.
TEM visualisering av PC-3 ultrastructure
PC-3 celler ble forsiktig høstet ved gjentatt pipettering og spunnet ned (2000 rpm, 5 min.). I korthet ble cellene fiksert med 3% glutaraldehyd i kakodylatbuffer i 2 timer og vasket tre ganger i 30 minutter i 0,1 M kakodylatbuffer. Etter dette, ble de fiksert med 0,02 M OsO
4 oppløst i 0,1 M kakodylatbuffer, dehydrert i alkohol, og infiltrert med aceton og No. 1 Durcuptan blanding over natten. Dagen etter ble cellene infiltrert med nr 2 Durcuptan blanding, embedded og polymerisert. Ultratynne seksjoner (90 nm, Ultramicrotome LKB, Bromma, Stockholm, Sverige) ble overført til nett dekket med Formvar membran (Marivac Ltd, Halifax, Canada). 2% uranylacetat og Reynold løsning ble anvendt for kontrast farging. Seksjonene ble sett i transmisjonselektronmikroskop (Morgagni 268, FEI Europa B.V., Eindhoven Nederland). Programvare analyse (Soft Imaging System, GmbH, Münster, Tyskland) ble brukt for bildeanalyse av celle ultrastructure.
Kvantitativ fase bildebehandling
Kvantitativ fase bildebehandling er en ikke-invasiv teknikk med høy egenverdi kontrast selv for naturlig gjennomsiktige objekter som levende celler. Derfor er denne metode er egnet for langtids observasjoner av celle reaksjoner på behandlingen uten noen ekstra farging. I disse eksperimentene kvantitativ fase bildebehandling ble utført av Tescan multimodale holografisk mikroskop Q-fase. Q-fasen er basert på den opprinnelige begrepet koherens-kontrollerte holografisk mikroskop [27, 28].
Kvantitativ fase bildebehandling ble igangsatt umiddelbart etter plumbagin behandling. Cellene ble dyrket i Flow kamre u-Slide jeg Lauer Familie (Ibidi, Martinsried, Tyskland) For å image nok antall celler i ett synsfelt, mål Nikon Plan 10 /0.30 ble valgt. Hologrammer ble tatt til fange av CCD-kamera (XIMEA MR4021 MC-VELETA). Hele bildet gjenoppbygging og bildebehandling ble utført i Q-PHASE kontroll programvare. Kvantitative fase Bildene vises i gråtoner med enheter av pg /nm
2 som ble omregnet fra opprinnelige radianer ifølge Barer og Davies [29, 30]. Filmer med identifikasjons piler ble utarbeidet i ImageJ programvare.
RNA Isolation og revers transkripsjon
TriPure Isolation Reagens (Roche, Basel, Sveits) ble brukt for RNA isolering. RNA prøver uten revers transkripsjon ble anvendt som negativ kontroll for QRT-PCR for å utelukke DNA-kontaminering. Det isolerte RNA ble anvendt for cDNA-syntese. RNA (1000 ng) ble transkribert med transcriptor første tråd cDNA syntese kit (Roche, Sveits), som ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. CDNA (20 ul) fremstilles fra total-RNA ble fortynnet med RNase-fritt vann til 100 pl, og mengden av 5 ul ble direkte analysert ved hjelp av LightCycler
®480 II System (Roche, Basel, Switzerland).
kvantitativ real-time polymerase chain reaction
QRT-PCR ble utført ved hjelp av TaqMan genekspresjon analyser og LightCycler
®480 II System (Roche, Basel, Sveits). Det amplifiserte DNA ble analysert ved den komparative Ct-metoden ved hjelp av β-actin som en referanse genet. De primer og probe sett for ACTB (assay ID: Hs99999903_m1), BECN1 (Hs00186838_m1), BIRC5 (Hs00153353_m1), 2CCl (Hs00234140_m1), MAP1LC3 (Hs00797944_s1), SOX2 (Hs01053049_s1), Nanog (Hs04260366_g1), POU5F1 (Hs04260367_gH), og HIF1A (Hs00153153_m1) ble valgt ut fra de TaqMan genuttrykk analyser (Life Technologies, USA). Den QRT-PCR ble utført under de følgende amplifikasjonsbetingelser: totalvolum på 20 ul, utgangs inkubering ved 50 ° C /2 min, etterfulgt av denaturering ved 95 ° C /10 min, deretter 45 sykluser ved 95 ° C /15 sek og ved 60 ° C /1 min.
statistikker
Pearson korrelasjon, prinsipal komponent analyse og cluster analyse ble utført for å avdekke sammenhenger mellom saker og variabler. Disse analysene ble utført på standardiserte data; klyngen analyse ble utført ved hjelp av Ward metode. Alle diagrammer er avbildet med gjennomsnitt og standardavvik. Programvare Statistica (Statsoft, Tulsa, OK, USA) ble benyttet for analyse.
Resultater
Fastsettelse av IC50 for plumbagin
For å vurdere den cytotoksiske effekten av plumbagin på PC -3 cellelinje, og for å velge konsentrasjoner for videre analyser, MTT-test og sanntids celleanalyse (RTCA) impedans basert test ble foretatt med konsentrasjoner: 0 (ingen medikament tilsatt), 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4 , 5, og 6 pmol /l. Ved hjelp av logistisk regresjon, ble konsentrasjonen IC50 bestemt på tidspunkter 6 og 24 (se figur 1A, 1B, 1C og 1D). Utgangen fra RTCA metode er en celle indeks (CI), se figur 1A, som reflekterer antall celler, samt morfologiske parametere, slik som størrelse, form, og graden av cellebinding til underlaget. Dette innebærer at en økning i den gjennomsnittlige størrelse av overlevende celler kan påvirke CI verdi og kan korrelert med høyere IC50-verdier (1,4 uM og 10 uM IC50 etter 6 timer og 24 timers behandling, henholdsvis). Vi utførte flow-cytometrisk analyse ved hjelp av SYTO 16 dobbelt-positivitet som en markør for levedyktige celler og forover spredning (FSC) for å detektere størrelsen av overlevende celler etter 2 uM plumbagin behandling. Antall store friske celler avbildet som en SYTO 16 ++ /FSC + (rød) klynge ved flow-cytometri prikkplott ble forhøyet i 24 tidspoeng sammenlignet med 6h time-punkt; se figur 1F, 1G, 1I og 1J. Dette forsøk ble utført i tre paralleller. Den gjennomsnittlige frekvensen av store SYTO 16 ++ var 15,92% etter 6t av plumbagin behandling og 19,58% etter 24 av plumbagin behandling (Fig 1E). Som vi observerte ingen dele celler i løpet av behandlingen (sammenlign behandlet og ubehandlet time-lapse, S1 og S5 videoer, celledeling var tydelig bare i ubehandlede celler), fremveksten av større kreftceller kunne antas nemlig fordi ingen økning i andelen annexin V- /propidiumjodid (PI) – celler (friske celler som ville følge av delende) ble observert mellom 5h tidspunktet, og 24 tids punkt av behandlingen (figur 1E). Ifølge disse resultatene, kan det skifte i IC50-verdier identifiseres av RTCA metoden gjenspeiler den økte cellestørrelse mellom 6h og 24 timer tidspunkter, som bekreftes av mikroskopisk analyse; se figur 1 H og 1K.
(A) Real-time overvåkning av relativ celle impedans (viste som en celleindeks) ved hjelp av RTCA system. (B) MTT vurdert respons på 6 t plumbagin behandling. (C) MTT vurdert respons til 24 plumbagin behandling. (D) IC50-verdier i henhold til RTCA og MTT og lengden av behandlingen. (E) tidsavhengige endringer i mengden av store celler med intakte kjerner (SYTO 16 ++ /FSC +) og intakte celler (AnnexinV- /PI-) vurderes av flow-cytometri. (F) Tall for store friske celler avbildet som SYTO 16 ++ /FSC + (rød) klynge ved flow-cytometri prikkplott på 6t tids punkt; Fremoverkastet lys (FSC) er proporsjonal med celle-overflate eller størrelse. (G) korning av store friske celler avbildet som SYTO 16 ++ /SSC + (rød) klynge ved flow-cytometri prikkplott på 6t tids punkt; Side-spredt lys (SSC) er proporsjonal med celledetalj eller intern kompleksitet. (H) Morfologi av PC-3 celler etter 6t plumbagin behandling, 20x forstørrelse, fasekontrastmikroskop. (I) Tall for store friske celler avbildet som SYTO 16 ++ /FSC + (rød) klynge ved flow-cytometri dot tomt i 24-timers-punkt; Fremoverkastet lys (FSC) er proporsjonal med celle-overflate eller størrelse. (J) korning av store friske celler avbildet som SYTO 16 ++ /SSC + (rød) klynge ved flow-cytometri dot tomt i 24-timers-punkt; Side-spredt lys (SSC) er proporsjonal med celledetalj eller intern kompleksitet. (K) Morfologi av PC-3 celler etter 24 timer plumbagin behandling; gigantiske PC-3 celler med polyploid giganten kreftcelle (PGCCs) -lignende morfologi er markert med piler. 20x forstørrelse, fasekontrastmikroskop.
PC3 cellelinje er disponert for mitophagy
For å vurdere den relative intensiteten av mitophagy relaterte gener uttrykk (
Nature1
,
FUNDC1
,
SMURF1
, og
Parl
) i PC-3 cellelinje, brukte vi CellMiner Database (https://discover.nci.nih.gov/cellminer /). Det gjør det mulig å bestemme nøyaktig utvalgte gener uttrykk mønstre fra 5 microarray plattformer i 60 cellelinjer (NCI60 panel) (S1 vedlegg). Pro-mitophagic gener
Nature1
,
FUNDC1
, og
SMURF1
ble relativt overexpressed i PC-3 sammenlignet med andre cellelinjer; på den annen side,
Parl plakater (ansvarlig for Nature1 cleavage) ble underexpressed. Disse data tyder på at PC-3 celler har muligens en høy grad av mitokondrie kvalitetskontroll og er i stand til å effektivt identifisere og deretter degradere skadede mitokondrier.
endoplasmatiske retikulum rammede mitophagy
For å etablere om majoriteten av reaktive oksygenarter (ROS) i cellen er produsert av mitokondriene, søkte vi fluorescent farging etter plumbagin behandling. Generelt opphopning av ROS ble overvåket ved hjelp CellROX Deep Red Reagens. Clear colocalisation av ROS og mitokondrier farging ble funnet (se figur 2B og 2C). Major ROS produserende mitochondria (se piler) ble belagt med isolasjon membranen avledet fra ER (se figur 2D). Denne observasjonen ble bekreftet ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM) (se figur 2F). Hovne og skadede mitokondrier ble pakket ved engulfing membran og gradvis brytes ned (se figur 2G). Ingen lag membran ble funnet rundt friske mitokondrier (se figur 2E).
(A) Phase kontrast mikroskopi av PC-3 cellers etter plumbagin behandling. (B) Generelt akkumulering av ROS etter plumbagin behandling overvåkes av konfokalmikroskopi ved hjelp CellROX Deep Red Reagens. Områder med ROS opphopning er markert med piler. (C) Mitokondrier farging overvåkes av konfokalmikroskopi hjelp MitoTracker grønne; området i forbindelse med ROS i figur 2B er markert med piler. (D) endoplasmatisk retikulum (ER) farging overvåkes av konfokalmikroskopi hjelp ERTracker Red; områder knyttet til ROS i figur 2B er markert med piler. (E) Ubehandlet PC-3-celle, tverrsnitt av uskadet mitokondrier (markert med rød pil); Transmisjonselektronmikroskop (TEM) visualisering. (F) plumbagin behandlet PC-tre celle, mitokondrier belagt med ER membranen med ribosomer (markert med rød pil); TEM visualisering. (G) plumbagin behandlet PC-tre celle, gradvis nedbrytning av mitokondrier i autophagosomes visualisert ved TEM (røde piler); Hovne mitokondrier som en markør for skade (gul pil).
Time-lapse bildebehandling
En time-lapse video ble tatt til fange av holografisk mikroskop for å observere intensiteten av celle migrasjon og også å kvantifisere kinetikken av PC-3-celler død i 48 timer. Mange forskjellige typer celle-celle interaksjoner ble overvåket og identifisert i løpet av denne perioden, inkludert vesikulær overføring (fig 3F og 3G), spise av døde eller døende celler (hyppighet av observasjon 2,5%, Fig 3C, S3 Video) og engulfment og kannibalisme leve -celler (frekvens på observasjon 0,8%, fig 3B). Under kannibalisme av levende celle, kom en cannibalic celle i kontakt med en målcelle. Neste skritt var en gradvis engulfment av målcellen. Kjernen i målcellen viste innledningsvis uendret, mens den henger cellens kjerne begynte å endre seg i en mer halvmåneformet form. Bird øye struktur typisk for kannibalisme ble observert (figur 3B, S2 Video). Til slutt, målcellen døde av. De 2 mikrometer plumbagin behandling hadde en spesiell betydning for cellemotilitet og om endringer i celle-til-celle kommunikasjon. En betydelig reduksjon av cellemotilitet og kommunikasjon ble funnet etter plumbagin behandling (se figur 3 H og 3I, S1 og S5 videoer).
For detaljert time-lapse videoer se S1-S4 videoer. (A) Time-lapse avbildning av entosis; internalisert celle (rød pil) spilte en aktiv rolle i sin engulfment, noe som resulterte i fullstendig internalisering. Begge typer celler (oppsluke og omsluttet) var levedyktig i lang tid og levde etter omtrent fem timer lenger enn de andre observerte plumbagin-behandlede tumorceller. (B) Time-lapse avbildning av celle fusjon med kannibalisme (fordøyelsen av oppslukt celle); under smelte kannibalisme av levende celler, cannibalic celle (rød pil) kom i kontakt med målcellen (blå pil). Det neste trinnet var gradvis engulfment av målcellen. Kjernen i målcellen viste innledningsvis uendret, mens den henger cellens kjerne begynte å endre seg i en halvmåneformet form. Fugl øye struktur ble observert som en konsekvens av målcellen vacualisation (se grønn pil). (C) Time-lapse avbildning av kannibalisme uten fusjon; den døende celle (blå pil) ble angrepet og utnyttet av cannibalic celle (rød pil). Målcellen var døde etter angrepet. (D) Time-lapse avbildning av oncosis; Kolloidosmotisk celler dannet typiske cytoplasmatiske blemmer som vanligvis fører til nekrose (se rød pil). (E) Time-lapse avbildning av omvendt oncosis; innledende forming av Kolloidosmotisk blebs (se rød pil) førte ikke til nekrose; den bleb ble absorbert og cellen forble levedyktige. (A-E) Multimodal holografisk mikroskopi, 10x forstørrelse. (F) Kommunikasjon mellom PC-3 celler; visualisert ved TEM (se røde piler). (G) Vesicula overføring mellom PC-3 celler; visualisert ved TEM (se røde piler). (H) Speed av migrasjonen av ubehandlet PC-tre cellepopulasjonen; vurderes ut fra holografiske mikros data ved CellProfiller programvare ved måling av «avstanden» parameter. (I) Speed av migrasjon av PC-tre cellepopulasjon etter 2 mikrometer plumbagin behandling.
I oncosis, tidlige forandringer inkludert merkede endringer i cellen form og volum (Fig 3D, S1 Video).
