Abstract
Mål /Hypotese
I ulike kreftformer typer, insulinreseptoren isoform sammensetning eller insulin reseptor substrat (IRS) isoformer er annerledes enn friskt vev. Dette kan være en molekylær kobling til økt kreftrisiko ved diabetes og fedme. Siden dette er ennå uklart for prostatakreft, undersøkte vi IR isoform sammensetning og IRS balanse i prostatakreft sammenlignet med godartet og svulst ved godartet prostatavevet og brakt dette inn i forhold til celleproliferasjon.
Metoder
Vi studerte 23 godartet prostataprøver fra radikal cystektomi eller benign prostatahyperplasi kirurgi, 30 prøver fra godartet vev i direkte tilknytning til prostatakreft foci og 35 kreftprøver fra ulike pasienter. RNA ekspresjonsnivåene for insulin-reseptor-isoformer A og B, IRS-1, IRS-2, og IGF-1 reseptoren ble bedømt ved kvantitativt sanntids RT-PCR. I tillegg RNA- og proteinuttrykk av cellesyklusen regulator p27
Kip1 ble kvantifisert ved real-time RT-PCR og immunhistokjemi.
Resultater
Insulin receptor isoform A til B ratio var signifikant høyere i kreft, så vel som i tumor tilstøtende benign prostatavevet sammenlignet med utelukkende godartet prostata (p 0,05). IRS-1 til IRS-2 forholdstall var lavere i ondartet enn i benign prostatahyperplasi vev (p 0,05). Disse endrede forholdene både i kreft og tilstøtende vev var signifikant assosiert med redusert p27
Kip1 innhold (p 0,02). Interessant, IGF-1 reseptor nivåene var signifikant lavere hos pasienter med type 2-diabetes (p = 0,0019).
Konklusjon /Tolkning
Vi fant betydelige forskjeller i insulinsignalering kaskade mellom godartet prostatavevet og prostatakreft. Histologisk godartet vev tilstøtende til kreft viste uttrykk mønstre som ligner på maligniteter. Våre funn tyder på en rolle av insulin signalveien i prostatakreft og omkringliggende vev, og kan dermed være relevant for både nye diagnostiske og terapeutiske tilnærminger i denne malignitet
Citation. Heni M, Hennenlotter J, Scharpf M, Lutz SZ, Schwentner C, Todenhöfer T, et al. (2012) Insulin Receptor isoformer A og B, samt insulinreseptorer Underlag-1 og -2 Er forskjellig uttrykt i prostatakreft. PLoS ONE 7 (12): e50953. doi: 10,1371 /journal.pone.0050953
Redaktør: Giorgio Sesti, Universita Magna-Graecia di Catanzaro, Italia
mottatt: 14 juni 2012; Godkjent: 29 oktober 2012; Publisert: 10.12.2012
Copyright: © 2012 Heni et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av en bevilgning (01GI0925) fra den tyske føderale Kunnskapsdepartementet (BMBF) til den tyske Senter for diabetesforskning (DZD eV). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
type 2 diabetes (diabetes mellitus type 2) er assosiert med økt risiko for flere krefttyper [1] – [3]. Risikoen for den mest utbredte kreft hos menn, prostatakreft, synes å være uendret av diabetes [4], men dette er antatt å være på grunn av lavere testosteronnivåer i diabetes mellitus type 2 [3], [5], [6]. Videre er overlevelse etter diagnose av prostatakreft kortere hos menn med diabetes mellitus type 2 sammenlignet med menn uten [7].
For mange typer kreft, endringer i insulinsignalkaskade er rapportert. Dette starter på nivået av insulinreseptoren (IR). Denne reseptoren skjer i to isoformer, isoform A som er overveiende uttrykt prenatalt og isoform B som er uttrykt i voksen differensiert vev [8]. Mens IR-isoform B har en høy affinitet for insulin og er ansvarlig for det meste av dette hormonet metabolske effekter, har isoformen A i tillegg en høy affinitet for insulin-lignende vekstfaktor (IGF) -II og bidrar til celleproliferasjon. IR isoform A er avvikende uttrykt i mange kreftceller [8]. Mens overekspresjon av IR i prostatakreft og høyere aktivitet av signalkjeden nedstrøms har blitt rapportert [9] -. [11], isoform konfigurasjon i denne kreftformen er ikke undersøkt ennå
docking proteiner nedstrøms av IR og andre reseptor-tyrosin-kinaser (for eksempel IGF-1-reseptor), insulin reseptor substrat (IRS) -1 og IRS-2 er avgjørende for ytterligere å kommunisere signaler fra disse reseptorene [12], [13]. Til tross for IRS-1 og IRS-2 høye homologi, har de ikke-redundante funksjoner i metabolsk kontroll og celleproliferasjon [14]. Disse docking proteiner har blitt godt karakterisert med hensyn til stoffskifte og diabetes, men bare noen få studier undersøkt sine roller i maligniteter [15]. Rollen av disse proteinene i prostata kreft er fortsatt uklart.
Nyere studier beskrive molekylære endringer i histologisk godartet vev av prostatakreft bærende kjertler [9], [16]. Foruten vitenskapelig interesse i tumorbiologi, kunnskap om slike endringer er av stor betydning for klinisk bruk, f.eks ved etablering av diagnose i biopsimateriale eller å bestemme kirurgiske marginer.
Målet med denne studien var å undersøke
(i)
IR isoform sammensetning og IGF-1 reseptoren uttrykk og
(ii)
IRS balanse i prostatakreft sammenlignet med godartet vev samt til tumor ved godartet vev; og
(iii)
å bringe disse resultatene i forhold til p27
Kip1, en godt beskrevet cellesyklus inhibitor i prostata kreft [17].
Metoder
studerte prøver fra 65 pasienter utsatt for radikal prostatektomi for prostatakreft (alder 50-76 [median 65] år). Prostatavev fra pasienter som gjennomgikk radikal cystoprostatectomy grunn av blærekreft (n = 13, median alder 67 år) eller transvesical /transurethral prostata-adenom-enucleation grunn av hyperplasi (n = 10, median alder 70 år) med ingen tegn for prostatakreft ble inkludert. Kliniske karakteristika er gitt i Tabell 1. For alle pasienter med prostatakreft, pre-operative PSA nivåer samt TNM-regi og Gleason score var tilgjengelig. For analyse av Gleason score, sammenlignet vi prøver fra «prostatakreft» gruppe med en Gleason scorer opptil 3 + 4 (= 7a, N = 11) med en slik å ha en Gleason score på 4 + 3 = 7b og høyere (N = 24).
studiet ble godkjent av den lokale etikkutvalg (Universitetet i Tübingen) og alle deltakende pasienter ga skriftlig informert samtykke.
for å sikre optimal kvalitet på prostatavevet og for å unngå forsinket frysing av den friske vev, ble en prosedyre utføres for å sikre umiddelbar frysing. Vev fra normal prostata ble frosset i flytende nitrogen umiddelbart etter kirurgisk reseksjon prøven ( «godartet» gruppe; N = 23). Prøvene ble inkludert i studien, dersom a) histopatologisk opparbeidelse av hele kirurgiske prøven viste ingen tegn på prostatakreft og b) en representant lysbilde fra samplet vev viste non-maligne prostata histologi.
Vev fra radikal prostatektomi prøven (som resulterer i «tumor tilstøtende prostata vev «og» prostata kreft vev») ble samplet som følger: umiddelbart etter reseksjon prøven var digitalt palpated og kutte inn på lokalisering av den antatte tumorområdet (området av perifer hardhet ). Da en perifer prøve i størrelse på omtrent 5 x 5 x 3 mm ble skåret ut og delt i lengderetningen inn i 3 lameller, hvorfra de ytre to (I og III) ble hurtigfrosset i flytende nitrogen. Den midterste lamell (II) ble formalinfiksert, parafininnebygd og behandlet til en histologisk lysbilde. Opparbeidelse av middel lysbilde av en erfaren uropathologist besluttet gruppetilhørighet av parallell frosset vev: Hvis det var ingen tegn til prostatakreft på lysbildet, den respektive vev ble ført til tumor ved benign prostata tissue»-gruppen (N = 30). Hvis dekselet viste tumorvevet under 60% av arealet, ble den respektive vev ekskludert fra studien på grunn av sin blandede vev tegn. Dersom svulsten andelen var over 60% av sleiden, ble den parallelle vev inkludert i analysen som «prostata kreftvev» (N = 35).
På grunn av denne tilnærmingen, hver analyserte prøve ble avledet fra en annen pasient.
de frosne vevsprøver ble brukt for RNA isolering, tilsvarende parafin vev for immunhistokjemi. De frosne prøvene ble lysert i RLT ved hjelp Tissue Lyser kit (Qiagen). RNA ble ekstrahert ved RNeasy Mini Kit (Qiagen). PCR (i duplikater) ble utført på en LightCycler 480 (Roche Diagnostics) ved hjelp av sonder Master og fluorescerende prober fra Universal Probe Library (Roche Diagnostics). Den følgende real-time PCR protokoll ble benyttet [18]:
Denaturering program (95 ° C i 5 minutter), en forsterkning og kvantifisering program gjentatt 45 ganger (95 ° C i 10 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder, 72 ° C i en andre [Fluorescenstilgangen]), og til slutt en avkjølingsprogram til 4 ° C. Primere ble utviklet ved hjelp av Roche Probe Design 2 programvare (Roche diagnostikk-) og kjøpt fra TIB MOLBIOL (Berlin, Tyskland)
Insulin receptor isoform A ble forsterket ved hjelp av følgende primere:. Frem TTT TCG TCC CCA GGC CAT, reversere CCACCGTCACATTCCCAAC. Insulinreseptoren isoform B ble forsterket ved hjelp av primere: Spiss TTT CGT CCC CAG AAA AAC CTC T, reversere CCA CCG TCA CAT TCC CAA C. Begge reaksjoner brukte 5 «6-FAM fosforamiditt-TCG CCA AGG GAC CTG CGT T-BBQ (4, 4-bis- [2-butyloctyloxy] -p-quaterfenyl) som en probe. Som en intern kontroll, brukte vi disse PCR for å beregne bidraget fra insulinreseptoren isoform A til den totale insulinreseptoren innhold på tre humane vev: i HepG2-hepatom-celler, 69% av insulinreseptoren var isoform A, mens i differensierte humane adipocytter og i skjelettmuskel, bare 30% var isoform A. disse verdier er sammenlignbare med verdiene rapportert for disse vev i litteraturen [8]. p27
kip1 (CDKN1B) ble forsterket med primere: fremover GAG AGC CAG GAT GTC AGC G, omvendt TTG TTT TGA GTA GAA GAA TCG TCG GT. For denne reaksjon ble 5 «6-FAM fosforamiditt-CCT TTA ATT GGG GCT CCG GCT AAC T-BBQ anvendt som en probe. De andre reaksjoner som brukes standard Roche prober og følgende primere: IGF-1 reseptoren frem TCA GCG CTG CTG ATG TGT, omvendt GGC TCA TGG TGA TCT TCT CC; Insulin reseptor substrat (IRS) -1 videre GCC TAT GCC AGC ATC AGT TT, omvendt TTG CTG AGG TCA TTT AGG TCT TC; IRS-2 frem TGA CTT CTT GTC CCA CCA CTT, omvendt CAT CCT GGT GAT AAA GCC AGA.
For immunhistokjemi, lysbilder ble deparaffinized, rehydrert og nedsenket i 3% hydrogen peroxide løsning. Antigen henting ble utført ved å skyve koking i citrate buffer.p27
kip1 protein ble oppdaget ved hjelp Vectastain Elite ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Etter blokkering endogene avidin /biotin av Vector blokkerende kit (Vector) og uspesifikk farging ved inkubasjon med normalt serum (hest, ABC kit) et monoklonalt mus-klon SX53G8 antistoff (Dako, (Santa Barbara, CA, USA) ble anvendt i en fortynning av 1:150 ved 4 ° C over natten inkubering. den sekundære antistoff ble anvendt i henhold til fabrikantens anbefalinger og DAB (Vector) ble anvendt for visualisering. Alle Glassene ble motfarget med Mayer hematoksylin. Tonsil vev tjente som positiv kontroll. Farging ble kvantifisert ifølge semikvantitativ immunhistokjemi referanseskala som spenner 0-300 som beskrevet i [19].
for statistiske analyser ble JMP 9.0 (SAS Institute, Cary, NC, USA) brukes. Ikke normalfordelte data ble logaritmisk transformert før statistisk analyse. Forskjeller mellom to grupper ble testet ved t-test. Forskjeller mellom flere grupper ble testet ved ANOVA etterfulgt av Tukey Kramer post-hoc tester. Korrelasjoner ble analysert ved hjelp av lineær regresjonsanalyse. Resultater med p 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
Resultater
For å evaluere relative uttrykk nivåer, vi beregnet forholdstall mellom de to IR-isoformene, mellom hvert IR isoform og IGF-1 reseptoren også. som mellom IRS 1 og 2. Sammenligning av godartet vev med prostatakreft, IR isoform A til B-forholdet var signifikant forskjellig i favør av isoform A i kreft sammenlignet med godartet vev (figur 1 A). IRS-1 til IRS-2-forholdet ble endret med relativt høyere IRS-2 ekspresjon (figur 1 B). For begge prosenter, histologisk godartet vev tilstøtende til kreft var signifikant forskjellig fra godartet vev, men ikke til prostatakreft (Figurene 1 A og B). Mens det var ingen forskjell mellom gruppene i IR isoform A til IGF-1 reseptoren ratio (figur 1 C), IR isoform B til IGF-1 reseptoren forholdet var betydelig lavere i kreft og nærliggende vev sammenlignet med benign prostata (figur 1 D) . Når gjenta analysene i undergruppen av alle pasienter uten diabetes, alle forskjeller rapportert for hele gruppen forble signifikant (all post-hoc p 0,05, data ikke vist). I tillegg, i denne undergruppen IR isoform A til IGF-1 reseptoren forholdet var betydelig lavere i histologisk godartet vev ved siden av kreft i forhold til de to andre vevstyper (ANOVA p = 0,0099, post-hoc p 0,05).
Barer representerer midler + SEM., N = 88. data var log
e
transformerte før statistisk analyse. Når sammenligning mellom grupper av ANOVA resulterte i statistisk signifikante forskjeller ble Tukey Kramer post-hoc test utført. Statistisk signifikante resultater av denne test er gitt i figurene. (A) Insulin reseptor isoform A /insulinreseptorer isoform B-forholdet. ANOVA p = 0,0002. (B) IRS-1 /IRS-2-forhold. ANOVA p = 0,0426. (C) Insulin receptor isoform A /IGF en reseptor-forhold. ANOVA p = 0,2. (D) Insulin reseptor isoform B /IGF 1 reseptoren ratio. ANOVA p = 0,0016. ANOVA – variansanalyse; IGF – insulinlignende vekstfaktor; IR – insulinreseptoren; IRS – insulin reseptor substrat; RNA – ribonukleinsyre; SEM -. Standard feil av gjennomsnittet
I immunhistokjemi, uttrykk for p27
Kip1 ble homogent fordelt langs kjertel ringene (figur 2 A og B). I de fleste prøvene en nukleær farging var tilstede, mens bare i tilfelle av sterk farging et ekstra cytoplasmiske fraksjon ble detektert. Inflammatoriske celler og fartøy farget positivt, men ble ikke ansett for kvantitativ evaluering. Prøvene var tilgjengelige for immunhistokjemi og farging var vellykket i 68 prøver. Det var en signifikant negativ korrelasjon av p27
Kip1 med IR isoform A til B ratio (figur 2 C). For IRS-1 til IRS-2-forhold, vi har oppdaget en signifikant positiv korrelasjon med pf27
Kip1 (figur 2 D). Mens p27
Kip1 var positivt korrelert med IR isoform B til IGF-1 reseptoren ratio (figur 2 F), ble ingen sammenheng med IR isoform A til IGF-1 reseptoren ratio funnet (figur 2 E).
(A) og (B): Representative farging for p27
Kip1, A: en prostatakreft prøve med sterk farging. B: en prostatakreft prøve med svak farging. Bar = 100 mikrometer. (C) – (F): genuttrykk forhold er blottet for kvantifisering av p27
Kip1 farging. Lines representerer tilpasset linje ± konfidensintervall, N = 69. (C) Insulin reseptor isoform A /insulinreseptorer isoform B-forholdet. (D) IRS-1 /IRS-2-forhold. (E) Insulin receptor isoform A /IGF en reseptor-forhold. (F) Insulin receptor isoform B /IGF en reseptor-forhold. Data var log
e
transformerte før statistisk analyse. Korrelasjoner ble analysert ved lineær regresjonsanalyse. IRS – Insulin receptor underlaget; IGF -. Insulin-like growth factor
I 55 prøver, vi også kvantifisert uttrykk for p27
Kip1 (CDKN1B) på RNA-nivå og oppdaget en positiv korrelasjon til immunhistokjemiske protein expression data ( p = 0,0306). I likhet med de proteindata, p27
Kip1 RNA ble signifikant negativt korrelert til IR-isoform A til B-forholdet (p = 0,0069). For p27
Kip1 RNA, var det en trend mot positiv korrelasjon til IRS-1 til IRS-2-forhold (p = 0,0675) så vel som en trend mot positiv korrelasjon med IR-isoformen A til IGF-1-reseptor-forhold (p = 0,0862). Ingen sammenheng med IR isoform B til IGF-1 reseptoren ratio ble funnet (p = 0,7).
I prostatakreft prøvene, ingen av de analyserte mRNA uttrykk forholdstall ble assosiert med Gleason score, preoperative PSA-nivå WHO er eller T- eller N-stadium (alle p≥0.2).
Når vi sammenlignet prøver av pasienter som lider av type 2 diabetes med slikt fra pasienter uten, fant vi ingen forskjeller i IR isoform A til B ratio eller i en IRS /IRS 2-forhold (p = 1,0 og 0,7, henholdsvis). IGF-1 reseptor nivåer var imidlertid signifikant lavere hos pasienter med type 2-diabetes (p = 0,0019).
Diskusjoner
Vi undersøkte sammensetningen av molekyler som er viktige for insulin signaloverføring i prostatakreft i forhold til godartet prostatavevet. Godartet vev ble enten avledet fra en helt godartet prostata eller det var histologisk godartet vev tilstøtende til prostata kreft. Interessant var det signifikante forskjeller mellom ondartede og godartede prostata men ikke mellom svulsten og omkringliggende vev. I begge isoformer forholdet mellom IR A og B var forskjellig i favør av isoformen A og IRS-1 til IRS-2-forholdet var forskjellig i favør av IRS-2. Mens IR isoformen A til B, så vel som IRS-1 til IRS-2 forholdstall var ikke forskjellig i pasienter med type 2-diabetes, har vi funnet IGF-1-reseptoren for å bli redusert i denne pasientgruppen.
i mange andre kreftformer [8], fant vi høyere uttrykk av IR isoform A i forhold til isoform B. Derfor fant vi reduserte nivåer av cellesyklusen inhibitor p27
Kip1 i prøver med høyere IR isoform A. Både insulin og IGF- II kan aktivere denne isoform; men det er forskjeller i nedstrøms signalisering [20]. Videre IGF-II bindes til IGF-1-reseptoren og denne reseptoren også hersket det metabolsk aktive IR isoform B i våre prostatakreft prøver. Dette ble igjen forbundet med endret P27
Kip1 nivåer. Således forutse alle våre funn øket proliferative virkninger av insulin og IGF-II i prostata kreft. Av interesse, spesifikke antistoffer for IR-isoformen A er under utvikling for behandling av kreft [8]. Basert på våre funn, kan disse stoffene også tilby terapeutiske muligheter i prostatakreft.
Vi fant prostatakreft til overuttrykke IRS-2 over IRS-1. Interessant, IRS-2 ble identifisert som en positiv regulator av metastase i brystkreft, mens IRS-1 kan være en suppressor av metastase [21], [22]. Denne rollen av IRS-2 i patogenesen av metastasering synes å være et generelt prinsipp som gjelder for andre ondartede sykdommer, så vel [15], [21]. Siden IRS-2 er nedstrøms IR som liganden, insulin, er markert forhøyet i diabetes mellitus type 2, foreslår våre funn av høyere IRS-2 i prostatakreft økt risiko for metastaser hos menn med diabetes. I tråd med denne hypotesen, overlevelse etter diagnose av prostatakreft er betydelig kortere hos pasienter med diabetes mellitus type 2 i forhold til en slik uten [7].
betydelig lavere IGF-1 reseptoren uttrykk i prøver fra pasienter med type 2 diabetes er mye uventet for oss. Vi er ikke kjent med rapporter om et slikt fenomen i prostata eller andre vev. Men basert på det relativt lite antall pasienter med diabetes i vår studie, kunne vi ikke analysere dette funnet separat i prostatakreft versus sunn prostata. Selvfølgelig, dette bør undersøkes i fremtidige studier, siden redusert IGF-1 reseptoren tilgjengelighet i prostatakreft hos pasienter med type 2 diabetes kan gjøre dem mer sannsynlig å svare på visse radio- eller kjemoterapi [23], [24], men kanskje gjør dem motstandsdyktige mot behandling direkte rettet mot den IGF-1 reseptoren [24].
en ytterligere overraskende funn i vår studie er kjennetegn ved histologisk godartet vev ved siden av prostatakreft. Selv om dette vev synes som normalt prostatavev histologisk, er dens sammensetning av insulinsignalmolekyler mer lik kreft enn for friskt vev. Sammenlign observasjoner er gjort i tidligere studier samt [9], [10]. Minst to forskjellige forklaringer er tenkelige: Insulin-signalkaskade i hele prostata kan bli endret lenge før kreft utvikler seg med en andre hit er nødvendig for å utløse kreft voksende. En annen mulig forklaring er at kreft endrer dens omkringliggende vev og induserer en vev gradient av IR /IRS subtype uttrykk. Til tross for at histologisk godartet, tilstøtende vev kan derfor allerede være endret av svulsten og kan til slutt havnen karsinogent potensial. Dette fenomenet er til stede i andre kreftformer, f.eks epigenetisk forandringer er til stede så langt som 4 cm borte fra brystkreft [25]. Hvis den andre hypotesen beviser sant i videre studier, kan det ha store konsekvenser for diagnostisering av prostatakreft: selv om kreften fokus vil bli savnet i en prostatabiopsi, ville endret IR /IRS sammensetningen i prøven indikerer kreft i orgelet og spør ytterligere tiltak.
En begrensning av vår studie er at vi ikke måle fastende insulin og fasting glukose nivå i de pasientene som de undersøkte prøvene stammer. Major determinanter av disse parametrene, nemlig alder og kroppsmasseindeks (BMI) samt forekomsten av type 2-diabetes og bruk av diabetes narkotika, ikke skiller mellom pasientgrupper i vår studie. Men insulin og glukose ble vist å regulere IR isoform sammensetning [8], [26], [27], og videre studier bør derfor ta disse parametrene.
I tillegg vil det være svært interessant å sammenligne IR /IRS sammensetning på proteinnivået i tillegg til det mRNA-nivå. Den tilgjengelige mengden av vev i vår studie var ikke nok for tilstrekkelig vestlige blotter. Dessuten hadde tilgang til bare en prøve av hver prostata. Studerer flere prøver fra en enkelt organ med annen nærhet til området av kreft kan tillate detaljerte studier om mulige graderinger av IR og IRS isoform sammensetning fra kreft til omkringliggende vev. Slike analyser kan avdekke årsaken til vår observasjon av likhetene mellom prostatakreft og omkringliggende vev.
Til sammen fant vi signifikante forskjeller i IR-signalkaskade mellom godartet prostatavevet og kreft. Histologisk godartet vev ved siden av prostatakreft viste uttrykk mønstre som ligner på malignitet. Våre funn tyder på en rolle av insulin signalveien i prostatakreft og kan dermed være relevant for både nye diagnostiske samt terapeutiske tilnærminger i denne malignitet.
Takk
Vi ønsker å takke for den gode tekniske assistanse av C. Haas og L. Nono (Universitetet i Tübingen, Tübingen, Tyskland).
