Abstract
Som en nylig identifisert og karakterisert genet, p42.3 er assosiert med celle spredning og tumorigenicity. Ekspresjonen av p42.3 blir oppregulert i human magekreft (GC), men dens underliggende virkningsmekanismer er ikke godt forstått. MicroRNAs (mirnas) er kjent for å spille viktige regulatoriske roller i mange cellulære prosesser. Her benyttet vi bioinformatikk og eksperimentelle tilnærminger for å undersøke regulatoriske forhold mellom mirnas og p42.3 genet. Vi viste at Mir-29a kunne undertrykke p42.3 uttrykk på både mRNA og proteinnivåer via direkte binding til sin 3’UTR. Videre ble det observert en invers sammenheng mellom MIR-29a og p42.3 uttrykk i mage kreft cellelinjer og prøver GC vev, spesielt i tilfeller hvor p42.3 ble nedregulert. Til sammen har vi belyst tidligere ikke roller MIR-29a og indikerte at Mir-29a kan fungere, i hvert fall delvis, ved å målrette den p42.3 genet i menneskets GC
Citation. Cui Y, Su WY , Xing J, Wang YC, Wang P, Chen XY, et al. (2011) MiR-29a Hemmer Cell Proliferation og induserer cellesyklus arrest gjennom nedregulering av p42.3 i Human Gastric Cancer. PLoS ONE 6 (10): e25872. doi: 10,1371 /journal.pone.0025872
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 28 februar 2011; Godkjent: 13 september 2011; Publisert: 05.10.2011
Copyright: © 2011 Cui et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Basic Research program of China 973 program (2010CB5293, National High Technology Research and Development program of China (863 program) (2006AA02A402, Foundation National Natural Science of Key program (nr 30830055) og departementet . of Public Health, Kina (nr 200 802 094) til FJY de organer hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
p42.3 er en roman gen som har nylig blitt isolert og identifisert av mRNA differensial display (mRNADD) teknikk. den full-lengde cDNA av p42 0,3 er omtrent 4,0 kb, og at genet koder for et 389 aminosyre (aa) protein som er beregnet til å ha en molekylvekt på 42,3 kDa. Videre forskning har vist at dens ekspresjon er cellesyklusavhengig i mage kreft (GC) cellelinjer. Dens protein expression topper i løpet av M-fasen av cellesyklusen, før den gradvis avtagende etter celledeling; Dette indikerer at p42.3 kan være involvert i cellesyklusregulering. Videre stanse av p42.3 av små interfererende RNA (siRNA) resulterer i oppregulering av CHK2 og nedregulering av cyklin B1, som er to viktige proteiner involvert i cellesyklusregulering [1], [2]. Mens RT-PCR og immunohistokjemiske analyser har vist at p42.3 blir oppregulert i GC sammenlignet med normale vevsprøver, har funksjonelle undersøkelser antydet at uttømming av p42.3 kan ikke bare resultere i hemming av GC-celleproliferasjon og kolonidannelse
in vitro
, men kan også i betydelig grad redusere tumorgenisitet i nakne mus [3]. Selv om tidligere studier har antydet en avgjørende rolle for p42.3 genet i patologi av GC, de spesifikke underliggende mekanismene for sin handling gjenstår å avklare.
microRNAs (mirnas) består av en klasse for liten (~ 22 nukleotider), endogene, ikke-kodende RNA som er kjent for å spille viktige regulatoriske roller i genuttrykk [4]. Det primære transkript miRNA kalles pri-miRNA [5], som blir transkribert ved RNA polymerase II eller III [6], [7]. Den pri-miRNA spaltes deretter ved drosha-DGCR8 mikroprosessor komplisert å produsere forløperen hårnål molekyl (pre-miRNA) som deretter eksporteres fra kjernen til cytoplasma ved exportin-5 /Ran-GTP. Med hjelp av et kompleks som inneholder RNase dicer og dobbelt-trådet RNA-bindende protein, TRBP, er ~70-nukleotid pre-miRNA prosessert til modne miRNA [8]. Den funksjonelle tråd av det modne miRNA er lastet inn i RNA-induserte stanse kompleks (RISC), som inneholder proteiner, argonaute (Ago) og Tnrc6, mens den andre strengen blir vanligvis nedbrytes [9]. Den modne miRNA guider RISC til de ufullkomne komplementære sekvenser i mål-mRNA for å undertrykke den beslektet mRNA translasjon, fremme transkripsjon forråtnelse, eller begge deler [10]. Det er anslått at de kodende gener er sannsynligvis regulert av mirnas og, mens et miRNA kan regulere mer enn én mål-gener, kan visse gener reguleres ved flere mirnas [11].
Økende bevis tyder på at mirnas er involvert i et vidt spekter av fysiologiske og patologiske prosesser, inkludert utvikling, differensiering, proliferasjon og apoptose [12.13,14,15]. Selv om forandringer av miRNA uttrykket er blitt bestemt i mange humane tumorer, inkludert kolorektal, mage og bryst kreft [16], [17], er antallet slike svulster i stadig ekspansjon. Men de detaljerte funksjoner av miRNA i svulster fortsatt ikke klarlagt.
Nyere studier har antydet at Mir-29 har komplekse funksjoner i ulike sykdommer. MiR-29a kan oppføre seg som en tumor suppressor i både lunge og bukspyttkjertel cancer cellelinjer, og således det eksogene overekspresjon av MIR-29a resulterer i en betydelig reduksjon i invasiv potensial og spredning av disse cellelinjer [18]. Svulsten suppressor rolle MIR-29a er også støttet av sin observert downregulation i et bredt spekter av solide tumorer, inkludert neuroblastom, sarkomer og hjernesvulster [19]. I motsetning til dette er MIR-29a oppregulert ved lat human B-celle kronisk lymfatisk leukemi (B-CLL) [20], og akutt myeloid leukemi (AML) [21], som tyder på en mulig rolle svulst promoter. I tillegg kan den avvikende ekspresjon av MIR-29a finnes i mange ikke-maligne sykdommer, inkludert leverfibrose [22], diabetes [23] og Alzheimers sykdom [24]. Selv om mange gener har allerede blitt bekreftet å være direkte mål for MIR-29a, som PPM1D [25], PI3K [26] og neuron navigator 3 [24], representerer de en svært liten andel av de totale gener som MIR-29a mål.
i denne rapporten viser vi at p42.3 uttrykket ble kontrollert på nivåene av både mRNA og protein av MIR-29a via direkte målretting av 3’UTR av p42.3. MiR-29a kunne undertrykke celledeling og indusere cellesyklus-stans, i det minste delvis, via nedregulering av ekspresjon p42.3. Videre fant vi at uttrykket av p42.3 protein ble omvendt korrelert med MIR-29a uttrykk i menneskelige GC vev.
Resultater
p42.3-3’UTR er putatively målrettet av MIR -29a
Antatte mirnas som ble spådd å målrette p42.3 genet ved mer enn én database ble analysert. De to øverste mirnas som ble spådd for tre ganger ble valgt for ytterligere bekreftelse og de tre andre mirnas, inkludert MIR-29a, hvis antatte bindende områder var nær de av de to øverste ble også valgt som kandidater for validering. MiR-29a ble spådd av TargetScan og miRGEN databaser, som indikerte at dens antatte bindingsstedet var i posisjonene 213-219 av p42.3-3’UTR (figur 1A). De andre kandidatene er ikke listet her.
A. Sekvensen av MIR-29a med den antatte bindingsstedet i det humane p42.3-genet. Den antatte bindingssetet med mutanten er vist i det nedre panel. B. Regulering av reporter genuttrykk av MIR-29a i MKN-45 celler co-transfektert med pri-MIR-29a og reporter gen som inneholder den antatte bindingssetet. **:
P
0,01
Direkte rettet mot p42.3-3’UTR av MIR-29a
Reporteren genet analysen ble benyttet til. validere om p42.3 var et direkte mål på MIR-29a. Wild-type og mutant p42.3-3’UTR inneholder den antatte bindingssetet av MIR-29a ble klonet i individuelle plasmider og smeltet sammen med reporteren genet. Det fluorescerende intensitet av reportergenet ble signifikant redusert i gruppen som ble ko-transfektert med WTpcDNA3 /EGFP /p42.3 og pcDNA3.1 /pri-MIR-29a sammenlignet med kontrollen. I tillegg var det ingen signifikant nedgang av fluorescentintensiteten i gruppen som var co-transfektert med MUTpcDNA3 /EGFP /p42.3 (figur 1B), ytterligere bekrefter at Mir-29a indusert nedregulering av p42.3 genekspresjon via spesifikk binding av den antatte stedet for det p42.3-3’UTR.
uttrykk av MIR-29a og p42.3 er omvendt proporsjonale i GC cellelinjer
for å finne sammenhengen mellom p42 0,3 og MIR-29a, studerte vi den endogene uttrykk for MIR-29a og p42.3 i seks menneske GC cellelinjer (SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-en og AGS) og en normal gastrisk epitel cellelinje (GES-1, figur 2A-C). Vi har funnet at nivået av p42.3 mRNA var signifikant høyere enn den normale kontroll i alle GC cellelinjer med unntak av SGC-7901, hvor forskjellen ikke var statistisk signifikant. Ekspresjonsnivået av p42.3 var variabel på proteinnivået, men var signifikant høyere i alle GC cellelinjer sammenlignet med GES-1. Vi viste også at MIR-29a ekspresjon var lav i fire av de GC cellelinjer ( SGC-7901, MKN-45, MGC-803 og AGS), som avslørte en invers sammenheng med p42.3 uttrykk. Selv om ekspresjonen av MIR-29a var høy i SNU-1, dette var ikke statistisk signifikant. Det er verdt å nevne at den høye uttrykk for MIR-29a i MKN-28 var et unntak.
A. Ekspresjon av mRNA p42.3 og modne MIR-29a i seks GC cellelinjer (SGC-7901, MKN-28 MKN-45, MGC-803, SNU-1, og AGS) normalisert til den normale gastriske epitel cellelinje (GES -1) ved hjelp av kvantitativ sanntids RT-PCR. Endogene referanser var GAPDH og U6 liten kjernefysiske RNA, henholdsvis. *:
P
0,05, **:
P
0,01. B og C. Ekspresjon av p42.3 protein i GC og normale gastriske epitel-cellelinjer analysert ved western blotting (B) og er vist som gjennomsnitt ± SD (normalisert, C). *:
P
0,05, **:.
P
0,01
MiR-29a regulerer p42.3 uttrykk
for å vurdere om p42.3 ble undertrykt av MIR-29a, behandlet vi MKN-45 celler med de etterligner og hemmere av MIR-29a i 48 timer for å eksogent opp- og nedregulere uttrykket av MIR-29a spesifikt; ekspresjonen av p42.3 ble deretter bestemt. Etter transfeksjon av MKN-45-celler med de etterligner, økte MIR-29a-ekspresjon ved tilnærmet 10 ganger, mens ved behandling med inhibitorene reduserte MIR-29a nivå med mer enn 50% (figur 3A-B). Dette antydet at både de etterligner og hemmere av MIR-29a arbeidet effektivt i våre eksperimenter. Overekspresjon av MIR-29a kunne gi en betydelig undertrykke uttrykket av p42.3 på både mRNA og protein nivå, som var en lignende effekt ved å stanse all p42.3 av p42.3 siRNA (si-p42.3). Vi oppdaget også at CHK2 ble oppregulert og cyclinB1 ble nedregulert etter stanse av p42.3 av p42.3 siRNA. Interessant, ble tilsvarende effekter som utøves på CHK2 og cyclinB1 ved overekspresjon av MIR-29a i MKN-45 celler (figur 3C-D). I tillegg transfeksjon av MIR-29a-hemmere dramatisk redusert CHK2 uttrykk og økt p42.3 og cyclinB1 uttrykk (Figur 3E-F). Dette antydet at MIR-29a kunne regulere ekspresjonen av p42.3-genet i MKN-45-celler.
A. Effekt av MIR-29a ligner på den endogene uttrykk for p42.3 mRNA. Moden MIR-29a ble eksogent oppregulert, mens den endogene uttrykk for p42.3 mRNA ble betydelig nedregulert i MKN-45 celler. **:
P
0,01. B. Effekt av MIR-29a-hemmere på endogene uttrykk for p42.3 mRNA. Moden MIR-29a ble eksogent nedregulert, mens den endogene uttrykk for p42.3 mRNA ble betydelig oppregulert i MKN-45 celler. *:
P
0,05, **:
P
0,01. C og D. Effekt av MIR-29a etterligner på den endogene ekspresjon av p42.3, cyklin B1 og CHK2 proteiner som var lik dem fra si-p42.3. Uttrykket nivåer av p42.3 og cyclin B1 protein sunket betraktelig etter MKN-45 celler ble behandlet med SI-p42.3 eller MIR-29a ligner mens nivået av CHK2 protein økt dramatisk. Data er vist som gjennomsnitt ± SD (normalisert, D). *:
P
0,05. E og F. Effekt av MIR-29a-hemmere på endogene uttrykk for p42.3, cyclin B1 og CHK2 protein. MiR-29A-hemmere reverseres uttrykket endringer sett i C og D. *:
P
0,05, **:.
P
0,01
MiR-29a inhiberer celleproliferasjon in vitro
i henhold til data fra celleproliferasjonsanalyse, trakk vi den absorpsjonsevne kurvene ved bølgelengden 450 nm etter transfeksjon for ulike varigheter. Vi fant at celleproliferasjon ble betydelig inhibert etter transfeksjon av MKN-45-celler med p42.3 siRNA i 48 timer og 72 timer, og et lignende mønster ble observert etter at cellene ble transfektert med etterligner av MIR-29a. Imidlertid er graden av undertrykkelse oppnådd ved MIR-29a ligner var større enn p42.3 siRNA-indusert nedregulering (figur 4A). Tvert imot, ble cellevekst fremmet av ca. 10%, sammenlignet med den negative kontroll når transfektert med inhibitorer av MIR-29a i 48 timer, men det var en reduksjon på 72 timer (figur 4B). Dette indikerte at Mir-29a kan hemme celleproliferasjon via undertrykke uttrykket av p42.3.
A. MiR-29a ligner hemmet celleproliferasjon og den inhiberende hastighet ved 48 timer var omtrent 20% og omtrent 40% ved 72 timer, mens p42.3 siRNA inhiberte celleproliferasjon med ca. 15% etter 48 timer og 72 timer. **:
P
0,01. B. MiR-29a-inhibitorer fremmet cellevekst med ca. 10% etter 48 timer, men virkningen svekket ved 72 timer. *:.
P
0,05
MiR-29a blokker cellecyklusprogresjonen
stanse av p42.3 av p42.3 siRNA kan føre til cellesyklus arrestere; Derfor undersøkte vi om MIR-29a kan påvirke cellesyklusprogresjon via rettet mot p42.3 genet. Etter MKN-45 celler ble transfektert med p42.3 siRNA i 48 timer, fant vi at cellesyklus ble blokkert på G1 fase (75,93%,
P
0,05), sammenlignet med negativ kontroll ( 66,18%). Vi fant at etterligner av MIR-29a kan også indusere G1 fase arrest i MKN-45 celler når de ble behandlet i 48 timer (75,56%,
P
0,05, figur 5).
Flow cytometri analyse bekreftet at både p42.3 siRNA og MIR-29a ligner indusert G1 fase arrest i MKN-45 cellelinje.
uttrykk av MIR-29a og p42.3 protein i GC og deres korrelasjon med clinicopathological egenskaper
Ved hjelp av en kvantitativ real-time PCR teknikk, ble Mir-29a påvist i 60 par av GC vev og deres matchet ikke-kreft tilstøtende vev, mens p42.3 proteinnivå ble også vurdert i disse vev ved Western blotting. Ut av 60 GC vevsprøver, p42.3 uttrykk var høy i 35 tilfeller (35/60 58,33%) i forhold til sine matchet ikke-kreft tilstøtende vev. I de 25 sakene der p42.3 uttrykk ble nedregulert, MIR-29a uttrykk var høy i 21 saker. MiR-29a uttrykk var lav i 27 tilfeller (27/60, 45%). Ovennevnte data antyder en invers sammenheng mellom MIR-29a og p42.3 protein uttrykk i vevsprøver (
P
= 0,000, Tabell 1 og figur 6), men korrelasjonskoeffisienten var ikke bra (r = -0,316 .)
det var en invers sammenheng mellom uttrykket av p42.3 protein og MIR-29a og ligningen for forholdet deres ble y = -0.3458x + 2,8126 (y: uttrykk for MIR-29a, x .: uttrykk for p42.3 protein)
Videre MIR-29a og p42.3 protein uttrykk ble evaluert med hensyn til clinicopathological egenskapene til de 60 pasientene som vevsprøver ble tatt. Våre funn tyder på at det var ingen åpenbare sammenhenger mellom p42.3 protein og MIR-29a uttrykk, henholdsvis med clinicopathological funksjoner (tabell 2).
Diskusjoner
p42.3 genet er høyt konservert i pattedyr og, som et onkogen, kan det spille en viktig rolle i den progressive transformasjonen av normale gastriske epitel-celler til kreftceller. Dens differensial ekspresjon i løpet av cellesyklustrinn viser at p42.3 kan være involvert i cellesyklusregulering. Dette ble ytterligere bekreftet ved resultatene, som viste at p42.3 stanse kan forandre ekspresjonen av to viktige proteiner, CHK2 og cyklin B1, som er involvert i cellesyklusregulering. Ved hjelp av tap-av-funksjon eksperimenter demonstrerte vi at p42.3 kan stimulere cellulær proliferasjon og som rapportert, våre resultater viste at p42.3 ble overuttrykt i GC vev sammenlignet med tilstøtende ikke-kreft mucosa [3]. Imidlertid er de molekylære mekanismer som resulterer i den avvikende ekspresjon av genet i p42.3 GC dårlig forstått, som det fremgår av mangelen på tilgjengelig litteratur. Mirnas kan regulere genuttrykket ved å målrette bindingsstedene i målet mRNA [27] og i kreft hos mennesker, mange mirnas har allerede vært innblandet. Imidlertid har den funksjon av bare noen få blitt forstått til nå, særlig i GC [28].
I denne rapporten har vi valgt MIR-29a for videre undersøkelser av en reporter gen system og til slutt identifisert som P42. 3 var et direkte mål gen av MIR-29a. Våre data foreslått at de fire databaser (TargetScan, microRNA.org, mikrokosmos Targets versjon 5 og miRGen) brukte var effektive, men ikke perfekt, verktøy for prediksjon av miRNA mål og gitt eksperimentelle bevis for forbedringer i den underliggende algoritmen.
Vi viste at p42.3 uttrykk ble omvendt proporsjonale med MIR-29a uttrykk i fire GC cellelinjer. I tre av disse, MKN-45, MGC-803 og AGS, dette var tydelig ved både mRNA og proteinnivå, men dette var ikke tilfelle i den SGC-7901 cellelinje. I tillegg MIR-29a uttrykk var ikke lav i MKN-28 og SNU-1 cellelinjer. Samlet utgjør disse observasjonene tillatt oss å hypoteser om at den regulatoriske rolle MIR-29a er komplisert i GC cellelinjer og at Mir-29a kan spille ulike roller i ulike cellulære bakgrunn. Men de detaljerte mekanismer for Mir-29a funksjoner i GC cellelinjer krever videre undersøkelser.
I vår studie, MIR-29a overekspresjon kan indusere lignende effekter til de som ble oppnådd ved å stanse all p42.3 av p42.3 siRNA. Begge p42.3 mRNA og protein ble nedregulert etter-celler ble transfektert med p42.3 siRNA eller MIR-29a etterligner og celleproliferasjon og cellesyklus ble undertrykt når celler gjennomgikk den samme forstyrrelse. Det foreslått at MIR-29a kan være involvert i patogenesen av GC via undertrykkelse av p42.3 genekspresjon. Men vi fant fra vekstkurvene at graden av undertrykkelse av MIR-29a ligner var større enn ved p42.3 siRNA. Etter vår mening kan den viktigste årsaken til dette være at spesifikke mirnas kunne regulere hundrevis av gener for å kontrollere cellular funksjon. I den foreliggende undersøkelse, kan MIR-29a hemme celleproliferasjon, i det minste delvis, ved å målrette p42.3.
Våre data viser at selv om hastigheten for høy ekspresjon av MIR-29a var 55% (33 /60) i GC, p42.3 uttrykk var lav i 21 av disse sakene. Dette antydet at Mir-29a kan ha en viktig rolle i GC vev med lave nivåer av p42.3.
I denne studien har vi validert at p42.3 er et direkte mål på MIR-29a. Vi har også vist at MIR-29a kan hemme celleproliferasjon og blokkere cellesyklus, i det minste delvis, via undertrykkelse av p42.3 ekspresjon i GC. Vi konkluderer med at Mir-29a kan spille en avgjørende rolle i å regulere uttrykket av p42.3 i GC. Interessant vi fant ut at p42.3 genet kan også regulere uttrykket av MIR-29a (dataene er ikke vist her), men den underliggende reguleringsmekanisme vil bli utredet i fremtiden.
Materialer og metoder
Bioinformatikk
Fire effektive beregnings tilnærminger som utnytter ulike evaluere systemer [29] – [32] ble brukt for prediksjon av de regulatoriske mirnas som retter seg mot p42.3 genet, inkludert TargetScan (http: //www.targetscan.org/), microRNA.org (https://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do/), Targets mikrokosmos versjon 5 (https://www.ebi.ac.uk/enright-srv /mikrokosmos /htdocs /mål /v5 /) og miRGen (https://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi#Results). Målene ble valgt for ytterligere bekreftelse fra gruppen av miRNAs som var felles for de resultatene som genereres fra mer enn ett søk.
Vevsprøver
Seksti par histopathologically bekreftet GC og tilstøtende ikke-kreft vev prøvene ble tatt fra pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon ved Renji Hospital tilknyttet Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Kina mellom juli 2007 og januar 2009. matchet ikke-kreft tilstøtende vev ble oppnådd minst 5 cm fra tumor nettstedet. Studien ble godkjent av forskningsetiske komité for Shanghai Jiaotong University og informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter, mens skriftlig samtykke ble innhentet fra hver pasient.
Cellelinjer og kulturforhold
Menneskelig GC cellelinjer, SGC-7901, MKN-28 MKN-45, MGC-803, SNU-1 og AGS, og GES-1-normal gastrisk epitel cellelinje, som ble anskaffet fra ATCC (USA), ble opprettholdt i RPMI 1640 medium (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Celler ble dyrket ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator. En løsning av trypsin (0,25%) ble brukt til å løsne cellene fra kulturflaske.
Vector konstruksjon
For å konstruere ekspresjonsvektorer pri-MIR-29a ble først forsterket med primere designet av primer Premier 5.0 programvare (tabell 3) og deretter klonet inn i pcDNA3.1 (Invitrogen). For å produsere de plasmider som inneholdt den antatte bindingssetet av MIR-29a, både villtype og mutante sekvenser fra posisjon 111 til 380 av den p42.3-3’UTR ble kjemisk syntetisert (figur 1A), og deretter ble klonet til nedstrøms av EGFP genet på
Bam
HI og
Eco
RI steder i pcDNA3 /EGFP vektor (Saierbio, Tianjin, Kina).
Reporter gen assay
MKN-45 celler ble sådd i triplikate brønner på en 24-brønn plate på dag før transfeksjon. PcDNA3.1 (+) /primær MIR-29a ble ko-transfektert med mut-pcDNA3 henholdsvis /EGFP /p42.3-3’UTR villtype og. Deretter tilsettes 0,5 pg av pcDNA3.1 (+) /primær-MIR-29a og 0,5 ug pcDNA3 /EGFP /p42.3-3’UTR ble tilsatt til hver av brønnene, mens 0,1 ug av vektor pDsRed-C1 (Clontech ), som uttrykte den RFP, ble tilsatt til hver vel som en endogen referanse. Celler som bare ble transfektert med pcDNA3 /EGFP /p42.3-3’UTR eller pcDNA3 /EGFP /p42.3-3’UTR + pcDNA3.1 (+) ble anvendt som kontroller. Celler ble samlet inn 48 timer etter transfeksjon og analysert basert på intensiteten av EGFP og RFP fluorescens påvises ved hjelp av fluorescens spektrofotometer F-4500 (Hitachi, Japan).
Cell transfeksjon
Transfeksjon av MKN-45 -celler ble utført ved anvendelse av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) ved å følge protokollen fra produsenten. MKN-45-celler ble utsådd i 6-brønners plater eller 96-brønners plater ved 30% konfluens dag før transfeksjon. Etterligner (100 Nm, GenePharma) og hemmere (200 nM, RIBOBIO) av MIR-29a ble brukt til eksogent opp- og nedregulere uttrykket av MIR-29a. Til taushet p42.3 genekspresjon ble MKN-45 celler transfektert med siRNA mot p42.3 (SI-p42.3, 100 nm, GenePharma). Kontrollen RNA (navngitt som NC) var ikke-homolog til noen menneskelige genom sekvens. Sekvensen av oligo-nukleotider er vist i tabell 4.
Sanntids RT-PCR
Total RNA ble isolert ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen) og ble deretter behandlet med RNase-fritt DNase I (Fermentas, San Diego, CA, USA). Total RNA (500 ng) ble revers transkribert ved hjelp av PrimeScript RT reagent Kit (Takara, Dalian, Japan). Primersekvensene som brukes til å forsterke p42.3 og GAPDH er vist i tabell 3. For å analysere ekspresjon av det modne MIR-29a, 2 ug av det totale RNA ble utsatt for revers transkripsjon ved å bruke alt-i-ett mirna Q-PCR Detection Kit (GeneCopoeia, Guangzhou, Kina). Kvantitativ real-time PCR for moden MIR-29a og U6 ble utført i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av ABI 7300 real-time PCR system og spesifikke primere designet av GeneCopoeia, Kina. Den relative uttrykk for p42.3 og MIR-29a ble normalisert til en endogen referanse (henholdsvis GAPDH og U6 small nuclear RNA) og i forhold til kontrollgruppen. Resultatene ble presentert som fold endring, beregnes ved hjelp av to (-ΔΔCT) metoden [33]; et relativt uttrykk forhold på 1,0 ble betraktet som lav, mens et forhold på 1,0 ble betraktet som høy ekspresjon [14]
Western blotting
Total-protein fra dyrkede celler og vev. det ble tatt ut av RIPA Lysis Buffer som inneholder PMSF, i henhold til produsentens instruksjoner (Beyotime, Shanghai, Kina). Proteinkonsentrasjonen ble målt under anvendelse av Bradford-metoden [34]. Total, 40 ug protein ble underkastet elektroforese gjennom 10% SDS-polyakrylamidgeler og ble deretter overført til en PVDF-membran (Millipore). Membranen ble inkubert med p42.3 antistoff (1:500, Abmart, Kina), CHK2 antistoff (1:1,000, CST), cyclinB1 antistoff (1:1,000, CST) eller GAPDH (1:5,000, Kang Chen, Kina) ved 4 ° C over natten. Sekundære antistoffer ble merket med HRP (Kang Chen, Kina) og de signaler som ble påvist ved anvendelse av ECL-sett (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA). Deretter ble bildene analysert ved ImageJ 1,43 programvare. Proteinet ekspresjon ble normalisert til en endogen referanse (GAPDH) og i forhold til kontrollgruppen. En relativ uttrykk forholdet mellom 1.0 ble ansett som lav uttrykk, mens et forhold på 1.0 ble ansett som høyt uttrykk [14]
Celleproliferering analysen
høstet MKN-45 celler. (ca. 5 x 10
4-celler) ble sådd ut i 96-brønners kulturplater. Cellulær proliferasjon ble målt ved 24 timer, 48 timer og 72 timer etter transfeksjon, henholdsvis, ved hjelp av celletellingsleder-8 (DOJINDO, Japan) i henhold til produsentens protokoll. Absorbansen ved en bølgelengde på 450 nm, som viser positiv forhold til kapasiteten av cellulær proliferasjon, ble bestemt ved et spektrofotometer (E-LIZA MAT-3000).
Cell syklus assay
Forty -eight timer etter transfeksjon ble cellene løftes med 0,25% trypsin og vasket i DPBS (Gibco); de ble deretter fiksert i 70% etanol ved -20 ° C i 24 timer. For flowcytometrisk analyse (EPICS XL Beckman Coulter), ble celler inkubert i RNAse (Fermentas) ved 37 ° C i 30 minutter, behandlet med PI (Sigma) og suspendert i 300 ul DPBS.
Statistisk analyse
data ble vist som gjennomsnitt ± SD av minst tre separate forsøk. Betydningen ble analysert med t-test og ikke-parametriske tester (Mann-Whitney U test og Kruskal-Wallis H test). Den statistiske betydningen av sammenheng mellom uttrykk av MIR-29a og p42.3 protein ble beregnet ved chi-kvadrat test og Spearmans rang korrelasjon. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS 13.0 programvare (IBM, USA) og forskjeller ble betraktet som statistisk signifikant på
P
0,05.
