Abstract
Prostatakreft (PCA) celler som gjennomgår nevroendokrine differensiering (NED) er klinisk relevante for utviklingen av residiverende kastrering-resistente PCa. Økende bevis viser at autofagi innebærer i utviklingen av nevroendokrine (NE) svulster, inkludert PCa. For å klargjøre effekten av autofagi på NED, ble androgen-sensitive PCa LNCaP celler undersøkt. Behandling av LNCaP-celler med IL-6 førte til en induksjon av autophagy. I fravær av androgen, IL-6 forårsaket en enda sterkere aktivering av autophagy. Lignende resultat ble identifisert i NED induksjon. Hemming av autofagi med klorokin (CQ) markert redusert NED. Denne observasjonen ble bekreftet av beclin1 og Atg5 støydempere eksperimenter. Ytterligere støtte rolle autophagy i NED, fant vi at LC3 ble oppregulert ved PCA vev som hadde tilbakefall etter androgen-deprivasjon terapi sammenlignet med deres primære tumor motstykke. LC3 flekker i tilbakefall PCa vev viste punktat mønster som ligner på farging av kromogranin A (CGA), en markør for NED celler. Videre autophagy hemming indusert apoptose av IL-6 indusert NE differensierte PCA-celler. Konsekvent, hemming av autofagi av knockdown av beclin1 eller Atg5 sensibilisert NE differensiert LNCaP celler til etoposid, en kjemoterapi narkotika. For å identifisere mekanismene, fosforylering av IL-6 nedstrøms mål ble analysert. En økning i fosfo-AMPK og en reduksjon i fosfo-mTOR ble funnet, noe som innebærer at IL-6 regulerer autofagi gjennom AMPK /mTOR pathway. Viktigst for denne studien er oppdagelsen av REST, en neuronal gen-spesifikke transcriptional repressor som er involvert i autofagi aktivering. REST ble nedregulert i IL-6 behandling. Knockdown eksperimenter tyder på at REST er kritisk til NED og autofagi aktivering av IL-6. Sammen våre studier antyder at autofagi er involvert ved PCA progresjon og spiller en cytoprotective rolle når NED blir indusert i PCA celler ved IL-6 behandling. Disse resultatene viser at potensialet for målretting autophagy som en del av en kombinert terapeutisk regime for NE tumorer
relasjon:. Chang P-C, Wang T-Y, Chang Y-T, Chu C-Y, Lee C-L, Hsu H-W, et al. (2014) Autophagy Pathway er nødvendig for IL-6 Induced Nevroendokrine Differensiering og Chemoresistance av prostatakreft LNCaP celler. PLoS ONE 9 (2): e88556. doi: 10,1371 /journal.pone.0088556
Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
mottatt: 18 november 2013; Godkjent: 07.01.2014; Publisert: 14. februar 2014
Copyright: © 2014 Chang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av NSC tilskudd (NSC 101-2320-B-010-047-My3) og av MMH tilskudd (MMH10194). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er en ledende årsak til kreftdødelighet i vestlige land, og forekomsten øker raskt i Asia [1]. Androgen-deprivasjon terapi (ADT) brukes for primær og metastatisk androgen-avhengige PCa [2]. Men 80% til 90% av PCA pasientene utvikler kastreringsresistent svulster innen 3 år etter vellykket ADT. Terapeutisk behandling av PCa blir hemmet av en slik utvikling av et hormon ildfast tilstand, hvorved hormonbehandling svikter, noe som resulterer i sykdommen inngår en mer aggressiv, og til slutt livstruende trinn [3]. En fascinerende, men studerte trekk hormon ildfast PCa er tilknytningen nevroendokrin differensiering (NED) [4]. NED er en prosess som er observert i løpet av ADT [5], [6]. Vanligvis er celler i en svulst som gjennomgår NED viser funksjoner som ligner på NE celler og disse cellene kalles nevroendokrine-lignende (NE-lignende) celler. NE-lignende celler er ikke-proliferativ, terminalt differensiert, og androgenreseptoren (AR) -negativ. De er meget vanskelig å drepe fordi de er motstandsdyktige overfor hormonterapi på grunn av mangler AR; Videre, de er resistente mot konvensjonell kjemoterapi, fordi de ikke deler [7]. Dessuten slipper de et stort antall neurokines, chemokiner, cytokiner og vekstfaktorer; Dette resulterer i en økning i proliferasjon av eventuelle nabo ikke-NE PCA-celler; dette skjer på en parakrin måte under ADT. NE-lignende celler er sannsynligvis de underliggende årsakene til hormon- og kjemoterapi motstand av kastrasjon-resistente PCa og tilstedeværelsen av NE-lignende celler er korrelert med en dårlig prognose [7] – [9]. Evnen til å identifisere de nye mekanismene bak NED av PCA-celler og av det terapeutiske motstanden av NE-lignende celler vil gi nye strategier som kan gjelde for forebyggelse av tilbakefall kastrering-resistente PCa eller, alternativt, til utvikling av kombinerte terapeutiske regimer for tilbakefall kastrering-resistente PCa.
NE-lignende celler kan identifiseres basert på morfologiske endringer og uttrykket av nevrale markører. Flere veier har vist seg å indusere NED i PCA celler ved hjelp av
in vitro
kultur-systemer; disse inkluderer androgen deprivasjon [10] og interlerukin-6 (IL-6) behandling [11]. Sistnevnte er spesielt viktig ettersom IL-6-nivåer er betydelig økt i pasienter som gjennomgår ADT og kliniske studier har vist at serumnivåene av IL-6 er ofte høyere hos pasienter med kastrering bestandig og metastatisk PCa [12] – [14]. IL-6 er et cytokin pleiotropisk viktig for forskjellige immunresponser, celleoverlevelse, proliferasjon og tumorigenesis [15], [16]. Kanoniske IL-6 signalbaner som omfatter (i) JAK-STAT3, (ii) PIK3-Akt og (iii) MEK-ERK. Studier har vist at IL-6 formidler vekststans og induserer NED i PCA-celler via aktivering av særegne signalveier; disse inkluderer STAT3 [17] og PIK3-ETK /Bmx [18]. Nylig Delk
et al
viste at IL-6 utskilt av stromale benmargsceller indusert NED og autofagi i beinmetastatiske PCA celler gjennom en STAT3 uavhengig vei [19]. Dermed har IL-6 er foreslått å indusere NED og tilrettelagt PCA celler blir ildfast. Dette gjør IL-6 et attraktivt mål for terapi. Imidlertid, på grunn av sin pleiotropism, rettet mot IL-6 er sannsynligvis føre til uforutsigbare responser. En bedre forståelse av de cellulære hendelser assosiert med IL-6 eksponering kan bidra til å identifisere potensielle effektive mål (er) for forebygging og /eller behandling av PCa.
Autophagy, også kalt macroautophagy, er en stor regulert lysosomal degradering bane som eukaryote celler bruker til å degradere langlivede proteiner og organeller som svar på ernæring sult eller metabolsk stress. Denne selv-fordøyelse veien er avgjørende for normal utvikling og for å opprettholde det intracellulære metabolske homeostase av terminalt differensierte celler så som neuroner. Det er også en sentral biologisk sti som fungerer for å beskytte organismer mot ulike patogener og mot kreft; det dermed er i stand til å fremme helse og levealder. Men når autophagy er kapret av kreftceller, fremkommer det som en måte for å beskytte tumorceller fra å dø, og derfor er i stand til å meddele resistens på kreftcellene. Forståelse av de molekylære mekanismene forbundet med autofagi begynte i 1993 da autofagi relaterte gener (Atgs) ble først identifisert i
S. cerevisiae product: [20]. Autophagy er en flertrinnsprosess, og således kan deles opp i flere trinn; (I) induksjon, (ii) vesikkel kjernedannelse, (iii) vesikkel forlengelse og ferdigstillelse for å danne autophagosome, (iv) dokking og fusjon med lysosomet å danne autolysosome, (v) nedbrytning, og (vi) gjenfinning [21]. Blant de viktigste oppstrøms- regulatorer av autophagic vei, klassen jeg PI3K (PI3KI) -Akt [22] og MEK1 /Erk [23], [24] molekyler lenker reseptor tyrosin kinaser til mTOR; Disse fungerer som viktige negative regulatorer av autofagi og dermed undertrykke autofagi i nærvær av insulin-lignende og andre vekstfaktor signaler. Interessant, funksjonen til klasse III PI3K (PI3KIII) er helt motsatt av PI3KI når regulere autofagi. Ved å samhandle med kjernekomponenten beclin1, akselererer PI3KIII autofagi ved å fremme vesikkel kjerne [25]. En mindre mekanismer innebærer LKB1-AMPK molekyler, som forbinder den intracellulære energi status av celler til den negative regulering av mTOR; denne vei virker til å aktivere autophagy i nærvær av spenninger som øker AMP /ATP-forholdet [26]. Andre mindre mekanismer inkluderer p53, ER stress-Ca
2 + signalering, og cytoplasma STAT3. Rollen til p53 i autophagy er paradoksalt og avhenger av subcellulære beliggenheten [27] – [29]. ER stress medfølgende Ca
2 + signalering er også involvert i reguleringen av autophagy og dette skjer ved å aktivere CaMKKβ avhengig AMPK vei [30], [31]. Til slutt, undertrykker cytoplasma STAT3 autofagi ved å binde seg til protein kinase R (PKR) og hemme fosforylering av eIF2α [32].
NE-lignende celle utvikling er avhengig av et nettverk av transkripsjons repressors og aktivatorer som styrer kjøp og vedlikehold av nevrale funksjoner. Repressor element-en stanse transkripsjonsfaktor /nevron restriktiv lyddemping faktor (REST /NRSF) ble først oppdaget som en mester transcriptional repressor som er ansvarlig for å begrense nevronale genekspresjon i ikke-nevronale celler [33] – [36]. Den repressor binder seg til en 21-bp repressor element 1 /nevron-restriktive stanse element (RE1 /NRSE) og deretter rekrutterer et undertrykkende kromatin remodelle kompleks, mSin3 og Co-REST. Dette skjer via dens to undertrykkelse domene (en i aminoenden og den andre ved den karboksylterminale), og resultatet er den epigenetisk stanse av transkripsjonen av målgenet [37]. REST er sterkt uttrykt i embryonale stamceller (ESCS), neurale stamceller (NPC) og ikke-neuronale celler, hvor proteinet undertrykker ekspresjonen av nevrale spesifikke gener, og dermed opprettholde pluripotency av ESCs og NPC ved å hemme neuronal differensiering i ikke-neuronal celler [33]. Interessant nok har REST blitt demonstrert å hemme transkripsjon av genet synaptophysin (SYN) [38], [39], en av de vanligste markører for NED i PCA-celler. En veldig fersk rapport fra Svensson
et al
viste også at REST formidler AR handlinger og modulerer androgen-deprivasjon indusert NED ved PCA [40].
For å kunne målrette bidrag NED til progresjon av PCa inn i den hormon ildfaste tilstand, har denne undersøkelsen sikte på å bestemme hvorvidt IL-6 er i stand til å opp-regulerer autophagy i PCA-celler, som i sin tur induserer celle NED. Dette vil forhindre celle apoptose i løpet av IL-6 indusert NED og som et resultat vil tillate NE-lignende celleoverlevelse i tilbakefall PCa. For å ivareta vår hypotese, undersøkte vi muligheten av IL-6 for å indusere autofagi og NED i androgen-sensitive LNCaP celler. Vi fant ut at autofagi er indusert av IL-6 og spiller en viktig rolle i IL-6 indusert NED. I samsvar med aktiveringen av autophagy under NED, kan et øket nivå av LC3 observeres i residiverende PCa vev og slik vev har en lignende foci fargemønster for CGA, en markør for NE-lignende celler. Vi undersøkte autofagi som en potensiell signal som er i stand til å beskytte PCA celler fra apoptose og cellegift som etoposid. I samsvar med den økte autophagy, AMPK aktivering og mTOR inhibering ble påvist å være tilstede i løpet av IL-6 behandling i fravær av androgen. Viktigst, vår studie identifisert nedregulering av REST, et nevron-restriktiv lyddemper; Dette ble funnet å være kritisk til NED induksjon og autofagi aktivering av IL-6.
Materialer og metoder
Cell Kultur og Plasmider
LNCaP PCA celler ble dyrket i RPMI 1640 (Gibco /Invitrogen, 31800-014) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Hyclone, SH30071.03), 1% penicillin /streptomycin (Sigma-Aldrich, P4458) og L-glutamin (Sigma-Aldrich, G7513). LNCaP-celler som stabilt uttrykker EGFP-LC3, LNCaP-EGFP-LC3, var blitt generert tidligere [41] og ble opprettholdt som beskrevet for LNCaP, men supplert med 400 ug /ml G418 (Amresco, E859). Den induserbare shRNA kassett, H1 /TO-shRNA-linker inneholdende et BsmBI-skjæringsstedet, ble innført i pLenti4 vektoren for å generere en induserbar shRNA lentiviral vektor, nemlig plenti4-H1 /TO-shRNA. Den induserbare promoter for ekspresjon shRNA er en hybrid av H1-promoteren og tetA operatør (Invitrogen, H1 /TO). Den shRNA kassett beclin1 (5′-CACCGGTCTAAGACGTCCAACAACACGAA TGTTGTTGGACGTCTTAGACC-3 «), Atg5 (5′-CACCAAGCAACTCTGGATGGG ATTGCGAACAATCCCATCCAGAGTTGCTT-3′) og REST (5»-CACCGTGTAA TCTACAGTATCACCGAAGTGATACTGTAGATTACAC-3 «) ble individuelt satt inn i plenti4-H1 /til- shRNA og disse ble deretter innført i LNCaP-celler ved TR lentiviral transduksjon. Cellene ble selektert i 14 dager ved bruk av 50 ug /ml zeocine (InvivoGen, maur-Zn-1). Knockdown effektivitet for beclin1, ble Atg5 og REST av shRNAs testet ved å bli behandlet med doksycyklin (Dox) i 48 timer. LNCaP-TR-shBeclin1, LNCaP-TR-shAtg5, LNCaP-TR-shREST ble opprettholdt som beskrevet for LNCaP, men supplert med 5 ug /ml blasticidin S (InvivoGen, maur-BL-1) og 50 ug /ml zeocine .
Fluorescent Mikros
LNCaP celler ble sådd ut på poly-L-lysin-belagte dekkglass (Marienfeld, 0111530) og etter å ha blitt behandlet som angitt, ble de løst med 4% paraformaldehyde i en × PBS i 15 minutter. Neste glassene ble montert i monteringsløsning [20 mM n-propylgallat, 80% glyserol, 20% 1 × PBS], og visualisert ved fasekontrastmikroskopi (Lecia, DMI4000B). Lengden av neuritter på objektglassene ble analysert ved MetaMorph (Molecular Devices, neurittutvekst). LNCaP-celler viser lav minimumsnivå for NED under normale dyrkingsbetingelser (RPMI 1640 supplert med 10% FBS). Den gjennomsnittlige neurite lengden av kontrollceller dyrket i RPMI 1640 inneholdende 10% FBS i hvert forsøk ble anvendt som en, og en sammenligning ble deretter gjort for neurite lengde oppnådd etter IL-6 behandlinger. De LNCaP-EGFP-LC3 celler ble fremstilt som beskrevet ovenfor for LNCaP celler med unntak av farging med Hochest 33258 (Invitrogen, H3569) før montering. EGFP-LC3 bildene ble visualisert ved hjelp av en Lecia DMI4000B fluorescens mikroskop med en 63 × linse og ble analysert ved MetaMorph (Molecular Devices, Transflour). LNCaP celler viser lave grunnleggende nivå av autofagi under normale kultur tilstand. For å skille autofagi induksjon ble cellene viser mer enn 50 intense EGFP-LC3 aggregater av 5 til 7,5 mikrometer og 15 intense EGFP-LC3 aggregater 7,5 til 20 mikrometer regnet som autofagi-positive celler etter induksjon.
Western blot og Antistoffer
Totalt cellelysater (TCLs) ble preparert fra cellene ved hjelp av NP-40 lysebuffer [0,5% NP-40 (Amresco, E109), 1 x PBS, 1 x proteasehemmere (Roche, 04693132001) ]. Proteinkonsentrasjonen av hver prøve ble deretter målt ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse fargereagens og produsentens protokoll (Bio-Rad, 500-0006). For immunoblotting ble like mengder protein applisert på og adskilt på en 6%, 8% eller 15% SDS-polyakrylamidgel etter behov. De separerte proteiner ble så overført fra gelen til 0,45 um porestørrelse PVDF-membraner (GE Healthcare, RPN303F). Neste ble membranene blokkert med blokkeringsbuffer [5% BSA i 1 x TBST]. Primære antistoffer for p-Akt (Ser473) (Cell signalering, # 9271), Akt (Cell signalering, # 9272), p-mTOR (Ser2248) (Cell signalering, # 2976), mTOR (Cell signalering, # 2983), s -STAT3 (Tyr705) (Cell signalering, # 9145), STAT3 (Cell signalering, # 9139), p-Erk (Thr202 /Tyr204) (Cell signalering, # 9101), Erk (Santa Cruz Biotechnology, sc154), p-AMPK (Thr172) (Cell signalering, # 2535), AMPK (Cell signalering, # 2793), LC3B (Cell signalering, # 2775), beclin1 (Cell signalering, # 3738), Atg5 (Cell signalering, # 2630), tubulin III ( Cell signalering, # 5666), androgen reseptor (Millipore, 06-680), REST (Millipore, 09-019), og GAPDH (GeneTex, GTX100118) ble fortynnet i 5% BSA i 1 × TBST. Membranene ble deretter probet med de forskjellige primære antistoffer, deretter behandlet med det passende sekundære antistoff. Til slutt ble membranene visualisert ved hjelp av en Pierce ECL Western blotting substrat (Thermo Scientific, 34080) og avbildes via en Luminescence /Fluorescence Imaging System (FUJIFILM, LAS-4000).
Immunohistochemistry Farging (IHC-farging)
Parafin-embedded prøver fra pasienter med primær og residiverende kastrering-resistente PCa som hadde blitt samlet inn mellom 1990 og 2010 på Mackay Memorial Hospital ble inkludert i denne studien. Etikk ble godkjent av Mackay Memorial Hospital Institute Review Board. Informert samtykke ble skrevet. Vevssnitt ble deparaffinized i xylen, rehydratisert ved hjelp av gradert etanol (100, 90, 80, 70, 50%), underkastet antigen gjenfinning av mikrobølger i 10 mM citratbuffer (pH 6,0) i 10 minutter, sperret for endogen peroksidaseaktivitet med tre % H
2o
2 i 10 min ved romtemperatur, og deretter blokkert med antistoff-fortynningsmiddel inneholdende bakgrunnsreduserende komponenter (DAKO, S302281). Til slutt ble de lysbildene farget natten ved 4 ° C med beclin1 (GeneTex, GTX61619), LC3 (Novus Biologicals, NB110-57179), REST (BETHYL, IHC-00141), eller CGA (Abcam, ab15160) spesifikke antistoffer og visualisert følgende standard protokoll ved anvendelse av 3-amino-9-etylkarbazol (AEC) som kromogen (DAKO, K346430) i nærvær av hematoxylin kontra. Den histologi og farging ble evaluert av en patolog i en blind måte ved hjelp av en fire-lags skala som representerer negative (0), svak (1), middels (2), og sterk (3) signaler.
The 3 – (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse
LNCaP, LNCaP-TR-shBeclin1, og LNCaP-TR-shAtg5-celler ble sådd på 96-brønners platene, dyrket i to dager, og deretter behandlet som angitt. Deretter ble cellelevedyktigheten undersøkt ved hjelp av MTT-analyse (Sigma-Aldrich, M5655). MTT ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,5 mg /ml, og de formazankrystaller ble oppløst med 10% SDS. Den optiske tetthet (OD) ble kvantifisert ved bruk av en mikroplate-spektrofotometer ved en bølgelengde på 570 og 660 nm.
den Caspase-3/7 ELISA-analysen
LNCaP-celler ble sådd ut i 96-brønners plater . Den følgende dag ble cellene behandlet som angitt. Caspase-3/7 aktivitet ble deretter målt ved anvendelse av et Apo-ONE Homogen Caspase-3/7 Assay kit (Promega, TB295) i henhold til produsentens protokoll. Cellene ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med en blanding av substratet og reaksjonsbuffer. Den caspase-3/7 aktiviteter var da målt ved hjelp av en fluorescens mikroplateleser (Tecan Systems, Infinite 200).
Reverse Transcription (RT) og kvantitativ PCR (qPCR)
Total RNA ble isolert fra ikke-indusert og Dox-indusert LNCaP-TR-shREST celler ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, 15596-018). Total RNA (2 mikrogram) ble revers transkribert ved hjelp Oligo-dT og Super
III RT (Invitrogen, 18080-085). De mRNA nivåer av ulike gener ble deretter bestemt ved qPCR og normalisert mot GAPDH.
Resultater
IL-6 og androgen deprivasjon synergi Frem Autophagy i LNCaP celler
Økende bevis har vist at autofagi spiller en viktig rolle i å støtte neuronal differensiering [42] – [44]. En nyere studie viser også at antophagy kan spille en viktig rolle i IL-6 indusert NED av beinmetastatiske PCA celler [19]. Serumnivåene av IL-6 har blitt funnet å øke i pasienter som gjennomgår androgen-deprivasjonsterapi (ADT) [12], [14]. Androgen-deprivasjon [45] og IL-6 [18] har også blitt funnet som er ansvarlig for utvikling og NED PCa ildfast til ADT. For å undersøke om autofagi er aktivert sammen med NED av PCa cellen under ADT, ble androgen deprivasjon og IL-6 kombinert behandling som brukes her. LNCaP-cellelinjen, en androgen-følsomme human prostata adenokarsinom-cellelinje hurtig erverver NE egenskaper, herunder opphør av mitose, neurite forlengelse og forbedret ekspresjon av neuronale markører slik som tubulin III, ved stimulering, ble valgt for studien. LNCaP celler som stabilt uttrykker EGFP-LC3, nemlig LNCaP-EGFP-LC3 celler ble dyrket i vanlig medium som inneholdt 10% FBS, 2,5%
kull /dekstran
-behandlet FBS (
CDT
) ( androgen-deprivasjon tilstand), eller 2,5% CDT pluss 100 ng /ml IL-6. Autophagosomic celler (celler med GFP-LC3-II tegnsettings) var telling ved hjelp av faste LNCaP-celler etter 48 timers behandling. Androgen-deprivasjon økt antall celler som gjennomgår autophagy til 41% (fig. 1). IL-6 alene økte antall autophagic celler til 17% (fig. 1). Interessant, antall celler som gjennomgår autophagy indusert av IL-6 i henhold til androgen-deprivasjon ble betydelig forbedret ytterligere til 87% (fig. 1). Induksjon av NED av androgen deprivasjon og IL-6 behandling ble bekreftet ved hjelp av LNCaP-celler. Neuritt-forlengelse, en typisk fenotypen til NED-celler ble observert (fig. 2A og 2B). Forbløffende graden av autophagy induksjon var sterkt korrelert med graden av NED blant LNCaP celler. Denne korrelasjonen ble ytterligere bekreftet ved Western blot-analyse. IL-6-behandlingen økte signifikant ekspresjon av neuron-spesifikk markør, tubulin III og omdannelsen av LC3-I til LC3-II (fig. 2C). Våre funn antyder at aktiveringen av autophagy kan være nødvendig for IL-6-indusert NED henhold til androgen deprivasjon betingelser.
(A) LNCaP-EGFP-LC3 celler ble kulturen i 10% FBS, 2,5% FBS og 2,5 % CDT supplert RPMI 1640 i fravær (kontroll) og nærvær av 100 ng /ml IL-6 i 48 timer. Dette ble fulgt av fiksering, kjernekontra med DAPI (blått), og analyse ved fluorescens mikroskopi (FITC, 63 x forstørrelse). (B) For hver behandling, ble prosentandelen av celler med EGFP-LC3 punktformet beregnet ved hjelp av den gjennomsnittlige fra 15 mikroskopiske felt;
barer
, SD.
(A) LNCaP celler ble behandlet med 2,5% CDT eller 2,5% CDT pluss 100 ng /ml IL-6 i 48 timer. Den induserte neurite forlengelse ble vurdert ved hjelp av lysfelt mikroskopi bilder (40 × forstørrelse). (B) Den neurite forlengelse ble kvantifisert ved å benytte gjennomsnitts fra 3-5 mikroskopiske felt;
barer
, SD. (C) LNCaP-celler ble behandlet som beskrevet i (A). Totalt cellelysater (TCLs) ble forberedt og deretter immunoblottet å oppdage tubulin III, androgen reseptor (AR) og LC3. GAPDH ble brukt som lasting kontroll.
Autophagy Hemming undertrykker NED i LNCaP celler
For å avgjøre om autofagi induksjon er viktig for IL-6-indusert NED under androgen deprivasjon forhold, vi hemme autofagi ved hjelp av klorokin (CQ), en autophagy inhibitor som blokkerer funksjonen til lysosomet. Som vist i figur 3A, CQ (50 uM) sterkt hemmet IL-6-indusert NED i LNCaP-celler og noe redusert differensiering indusert av androgen deprivasjon. Kvantifisering av neurite lengde av MetaMorph viste at det var også signifikant hemming av denne fenotype (Fig. 3B). CQ kan ha ikke-spesifikke effekter på andre enn at inhibering av autophagy pathway. For ytterligere å bekrefte betydningen av autofagi veien til IL-6-indusert NED under androgen deprivasjon forhold, benyttet vi små hårnål RNA (shRNAs), shBeclin1 og shAtg5 å knockdown uttrykk for beclin1 (Atg6) og Atg5, to ATG gener avgjørende for autofagi initiering og autophagosome formasjon, henholdsvis. Først må vi etablert en shBeclin1 induserbar knockdown cellelinje og en shAtg5 induserbar knockdown cellelinje i LNCaP celler, nemlig LNCaP-TR-shBeclin1 og -shAtg5. Immunoblotting viste at begge shRNAs var i stand til å knockdown sitt mål med hell (fig. 4A og 5A). Interessant, beclin1 knockdown-celler viste en betydelig lavere grad av NED enn kontrollceller (Fig. 4B og 4C), og et lignende resultat ble observert i Atg5 knockdown-celler (fig. 5B og 5C). Kvantifisering data viste at både Atg5 og beclin1 knockdown har signifikant inhibering effektivitet i IL-6 indusert NED (fig. 4C og 5C). I samsvar med cellens morfologi, hemming av NED ved å banke ned beclin1 og Atg5 ble identifisert ved Western blot analyse ved hjelp av tubulin III antistoff (fig. 4D og 5D). Sammen utgjør disse funn viser at autophagy reaksjonsveien er vesentlig for PCA-celler til å gjennomgå NED.
(A) LNCaP-EGFP-LC3-celler ble behandlet med 2,5% CDT eller 2,5% CDT pluss 100 ng /ml IL- 6, i fravær og nærvær av 50 uM klorokin (CQ) i 48 timer. Dette ble fulgt av fiksering, kjernekontra med DAPI (blått), og analyse ved fluorescens mikroskopi (FITC, 40 x forstørrelse). (B) Den neurite forlengelse ble kvantifisert ved å benytte gjennomsnitts fra 3-5 mikroskopiske felt;
barer
, SD.
(A) LNCaP-TR-shBeclin1 celler ble behandlet med 1 mg /ml Dox i 48 timer. TCLs var forberedt og immunoblottet å oppdage beclin1 bruker GAPDH som lasting kontroll. (B) LNCaP-TR-shBeclin1-celler ble behandlet i 48 timer med 1 ug /ml Dox for å indusere knockdown av beclin1 og de ble deretter behandlet i ytterligere 48 timer med 2,5% CDT eller 2,5% CDT pluss 100 ng /ml IL -6 å indusere celle NED. Hemming av neurite forlengelse av beclin1 knockdown ble vurdert ved hjelp av lysfelt mikroskopi bilder (40 × forstørrelse). (C) Den neurite forlengelse ble kvantifisert ved å benytte gjennomsnitts fra 3-5 mikroskopiske felt;
barer
, SD. (D) TCLs ble oppnådd fra LNCaP-TR-shBeclin1 celler behandlet som beskrevet i (A), og disse ble deretter analysert ved immunoblotting ved å bruke de angitte antistoffer.
(A) LNCaP-TR-celler shAtg5 ble behandlet med 1 pg /ml Dox i 48 timer. TCLs var forberedt og immunoblottet å oppdage Atg5 bruker GAPDH som lasting kontroll. (B) LNCaP-TR-shAtg5-celler ble behandlet i 48 timer med 1 ug /ml Dox å indusere knockdown av Atg5 og behandles deretter i ytterligere 48 timer med 2,5% CDT eller 2,5% CDT pluss 100 ng /ml IL-6 for å indusere celle NED. Hemming av neurite forlengelse av Atg5 knockdown ble vurdert ved hjelp av lysfelt mikroskopi bilder (40 × forstørrelse). (C) Den neurite forlengelse ble kvantifisert ved å benytte gjennomsnitts fra 3-5 mikroskopiske felt;
barer
, SD. (D) TCLs hentet fra LNCaP-TR-shAtg5 celler behandlet som beskrevet i (A), og disse ble deretter analysert ved immunoblotting hjelp de angitte antistoffer.
Autophagy genuttrykk i grunnskolen og residiverende PCA Prøver
De ovennevnte funn tyder på at autofagi kan aktiveres sammen med NED i PCA cellene under hormon-ildfast tilbakefall. For å karakterisere forholdet mellom autofagi og NED i PCA celler, undersøkte vi uttrykket av CGA, som er en NE svulst markør, og uttrykk for LC3, en autofagi relaterte gener, i tretten par av primære og hormon-ildfast tilbakefall PCA vevsprøver , parene blir oppnådd fra den samme pasient. Representative immunhistokjemi (IHC) resultater for CGA og LC3 er vist i figur 6. Den positive CGA farging viser et brennpunkt mønster (figur 6, stengt piler.), Som er et typisk trekk ved NE-celler i tilbakefall pca prøver; men dette mønsteret var ikke til stede i de primære PCA prøver. Interessant nok en foci farging av LC3 ble også observert i tilbakefall PCA prøver (fig. 6, åpne piler). Ut fra de tretten par av PCA prøver, 8 (62%) viste en signifikant økning i LC3 uttrykket (gjennomsnitt LC3 immunoreaktivitet (IR) av primære og residiverende PCa tumor var 0,51 og 1,12, henholdsvis; P 0,005) i tilbakefall PCa vev sammenlikne til deres primærtumor motstykke.
representant IHC flekker bilder av to par vevsprøver, nemlig primær og residiverende PCa prøver fra samme individ, ble farget ved hjelp av anti-LC3, anti-CGA, og anti-REST antistoffer .
Autophagy indusert av IL-6 Beskytter NE differensiert LNCaP celler fra celledød
Autophagy er viktig å opprettholde homeostase av terminalt differensierte celler [46]. Den observasjon at autofagi er neurobeskyttende [47], og at den autophagy induseres ved IL-6 fikk oss til hypoteser om at autofagi kan tjene som en beskyttende mekanisme for å opprettholde homeostase og øke overlevelsen av IL-6 indusert terminalt differensiert NE-lignende celler . Dersom dette er tilfelle, celledreping bør forsterkes hvis autofagi inhiberes. For å oppnå dette, utførte vi et MTT-assay for å identifisere rolle autophagic bane i IL-6 indusert vekststans og motstand mot celledød. I samsvar med tidligere studier, IL-6 behandling indusert vekst arrest i LNCaP celler (fig. 7A). Når autofagi ble inhibert ved behandling med CK, induserte dette en betydelig økning i celle-død hos IL-6-behandlede LNCaP-celler (Fig. 7A). Den økte celledreping ble funnet å være i stor grad på grunn av økt apoptose, som vist ved tilstedeværelsen av en betydelig økning i caspase-3/7-aktivitet ved 48 timer etter IL-6 pluss CQ kombinert behandling (fig. 7B). Disse resultatene viser for første gang at inhibering av autophagy er i stand til å overvinne den apoptose-motstanden av IL-6-indued NE differensierte celler, og indikerer at autofagi er den underliggende årsak bak chemoresistance av NE-lignende celler.
(A) LNCaP-celler ble dyrket i 2,5% CDT supplementert RPMI 1640 og deretter behandlet med 100 ng /ml IL-6 eller bærerkontroll i nærvær eller fravær av 50 pM CQ. Celleantall ble analysert ved hjelp av et MTT-assay cellelevedyktighet ved de indikerte tidspunkter.
poeng
, mener;
barer
, SD. (B) LNCaP-celler ble behandlet som beskrevet i (A) og deretter analysert for caspase-3/7-aktivitet ved de angitte tidspunkter. Hvert datapunkt er vist er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter;
barer
, SD.
Den beskyttende rolle autofagi i chemoresistance av NE differensiert PCA celler til cellegifter som etoposid ble deretter bekreftet av følgende funn. Som forventet, etoposid var ute av stand til å drepe de IL-6 indusert NE differensiert LNCaP-celler. Interessant etoposid induserte en signifikant økning i celledød etter knockdown av enten beclin1 eller Atg5 i NE differensiert LNCaP-celler som var blitt indusert av IL-6 i henhold til androgen deprivasjon betingelser (Fig. 8). Når de tas sammen, de ovennevnte funn tyder på at autofagi indusert av IL-6 er i stand til å beskytte IL-6-induserte NE differensierte LNCaP-celler fra apoptotisk celledød, og at en hemming av autophagy er i stand til å oppheve den apoptose motstanden, så vel som kjemoterapi motstand i forbindelse med NE-lignende PCA-celler.
LNCaP-TR-shBeclin1 (A) og LNCaP-TR-shAtg5 (B) celler ble behandlet med Dox i 48 timer for å indusert enten beclin1 eller Atg5 knockdown henholdsvis eller venstre ubehandlet.
