Abstract
Aktivering epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) mutasjoner er anerkjent biomarkører for pasienter med metastaserende ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) behandlet med EGFR tyrosinkinasehemmere (TKI). EGFR TKI kan også ha aktivitet mot NSCLC uten EGFR mutasjoner, som krever identifisering av flere relevante biomarkører. Tidligere studier på tumor EGFR protein nivåer og EGFR genkopitallet avslørt inkonsistente resultater. Målet med studien var å identifisere nye biomarkører for responsen på TKI i NSCLC ved å undersøke hele genomet uttrykk ved ekson-nivå. Vi brukte ekson arrays og kliniske prøver fra en tidligere studie (SAKK19 /05) for å undersøke uttrykket variasjoner på ekson-nivå på 3 gener potensielt spille en sentral rolle i modulerende behandlingsrespons: EGFR, V-Ki-ras2 Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog (KRAS) og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGFA). Vi identifiserte ekspresjon av EGFR exon 18 som en ny logisk markør for pasienter med metastatisk ubehandlet NSCLC behandlet med bevacizumab og erlotinib i den første linjeinnstilling. Overekspresjon av EGFR exon 18 i tumoren var signifikant assosiert med tumor krymping, uavhengig av EGFR mutasjonstatus. En lignende signifikant sammenheng kunne finnes i blodprøver. Avslutningsvis ble exonic EGFR uttrykk særlig i ekson 18 funnet å være en relevant prediktiv biomarkør for respons på bevacizumab og erlotinib. Basert på disse resultatene, foreslår vi en ny modell av EGFR testing i svulsten og blod
Citation. Baty F, Rothschild S, Früh M, Betticher D, Droge C, Cathomas R, et al. (2013) EGFR Exon-Level Biomarkører av Respons til Bevacizumab /Erlotinib i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (9): e72966. doi: 10,1371 /journal.pone.0072966
Redaktør: Giuseppe Viglietto, Universitetet Magna Graecia, Italia
mottatt: 6 mars 2013; Godkjent: 16 juli 2013; Publisert: 10.09.2013
Copyright: © 2013 Baty et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den Exon Array analyse ble finansiert av det sveitsiske konsernet for Clinical Cancer Research (Sakk). De viktigste prøve aktiviteter ble støttet av den sveitsiske statssekretariatet for utdanning og forskning (SER) og Roche Pharma (Schweiz) AG. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. LB mottatt honorarer fra Roche og Astra Zeneca for foredrag og deltakelse i rådgivende styremøtene. OG erklærer å ha mottatt honorarer for advisory board. Alle andre forfattere erklærer at ingen konkurrerende interesse. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Prognosen for pasienter med stadium IV ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) fortsetter å være dårlig. Til tross for standard cytotoksisk kjemoterapi, vil nesten 50% overlever ikke mer enn 12-14 måneder [1], [2]. I de siste årene har forbedringer i overlevelse i hovedsak oppnådd ved oppdagelsen av prediktive molekylære markører som identifiserte undergrupper av pasienter som stammer en betydelig nytte av målrettet behandling. Flere randomiserte fase III-studier har nylig vist en betydelig fordel for epidermal vekstfaktor-reseptor tyrosin kinase hemmere (EGFR-TKI) i kjemoterapi naive pasienter huse et aktiverende EGFR mutasjon [3] – [6]. EGFR mutasjoner er funnet i ca 10-15% av kaukasiske pasienter [7]. I EGFR villtype pasienter førstelinjebehandling med EGFR-TKI kan også skade sammenlignet med konvensjonell kjemoterapi [8]. Men i uselekterte kjemoterapi-naive pasienter rollen EGFR-TKI er mindre klart, og tidligere studier har vist dårligere resultater med TKI med eller uten bevacizumab sammenlignet med kjemoterapi [9] – [11]. Disse resultatene indikerer at det er en undergruppe av EGFR villtype pasienter som kan dra nytte av behandling med en TKI eller et TKI pluss et anti-angiogent middel. Det samme gjelder for uselekterte og behandlede pasienter der rollen TKI har blitt omtalt i en rekke prøvelser og effekt og overlevelse har vist seg å være sammenlignbare med konvensjonell kjemoterapi [12] – [14]. Videre analyser siste biomarkør av tre store studier testing vedlikeholdsbehandling med erlotinib tydelig demonstrert at en undergruppe av EGFR vill type pasienter også utlede en betydelig nytte av EGFR-TKI behandling [15] -. [17]
Foruten EGFR andre druggable onkogene mutasjoner i avansert NSCLC har blitt beskrevet [18], [19]. Dessverre har de fleste pasienter med NSCLC ikke havn en tilsvarende molekylære mål dermed kjemoterapi fortsetter å være deres første behandling av valget. Derfor er avgjørende identifisering av ytterligere undergrupper av pasienter som kan stamme nytte av målrettet behandling ved å utforske ytterligere molekylære markører.
Behandling med bevacizumab og erlotinib (BE) har potensielle fordeler over kjemoterapi, særlig med hensyn til dets mer gunstige toksisitetsprofil. Det er dokumentert at tilsetningen av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) rettet mot monoklonale antistoff bevacizumab til de EGFR-TKI erlotinib oppviser øket effektivitet sammenlignet med erlotinib alene i ikke-valgte pasienter som tidligere var behandlet med kjemoterapi [20]. Denne observasjonen resulterer trolig fra økt erlotinib aktivitet, gitt manglende effekt av bevacizumab monoterapi i lungekreft.
Den sveitsiske konsernet for Clinical Cancer Research (Sakk) nylig rapportert en median tid til progresjon (TTP) på 4,1 måneder hos pasienter med ubehandlet avansert ikke-plateepitel NSCLC som behandles med BE [21]. Dette resultatet ser ut til å være dårligere enn hva som ville være forventet med moderne kjemoterapi kombinasjoner i lignende pasientgrupper [2], [22]. I dagens substudien, rettet vi å identifisere en potensiell undergruppe av pasienter som deltar i Sakk 19/05 rettssaken, særlig innenfor EGFR vill-type gruppe, som kan ha nytte av behandling med BE. Hovedmålet med denne studien var å vurdere sammenhengen av ekson-nivå uttrykk varianter av 3 spesifikke gener [EGFR, V-Ki-ras2 Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog (KRAS) og vaskulær endotelial vekstfaktor A (VEGFA)] og respons på førstelinje BE behandling hos pasienter som deltok i Sakk 19/05 rettssaken.
Resultater
Pasient og den kliniske utfall
Sakk 19/05 studien inkluderte 103 pasienter, 101 ble evaluert for den primære statistiske analyser. Totalt sett, median alder var 65 (intervall, 32-80) år. Alle pasientene var i en god allmenntilstand (WHO 0-1), 48 var menn (48%), 53 var kvinner (52%). Hoveddelen (86%) hadde stadium IV sykdom. EGFR mutasjoner ble identifisert i 15 pasienter (15%). En pasient hadde en primær motstand mutasjon T790M i exon 20. KRAS mutasjon ble identifisert hos 13 pasienter (13%). Objektiv tumorrespons på 12 uker (PR eller CR) ble observert hos 15 pasienter (15%). Disse pasientene hadde følgende EGFR mutasjonsstatus: EGFR del19 (n = 5), L858R (n = 2), ukjent mutasjonsstatus (n = 1), og EGFR villtype (n = 8). En pasient med EGFR villtype og respons på BE terapi hadde en KRAS mutasjon G12D.
Fra disse pasientene ble svulstvev for exon rekke analyse innhentet fra 42 pasienter og blodprøver fra 75 pasienter (Tabell S1 i Hjelpemiddel Information). En detaljert beskrivelse av pasientens karakteristika er gitt i tabell 1 (tumor vevsprøver) og i tabell 2 (blodprøver). Vevsprøver samsvarer med vår primære datasettet som brukes for biomarkør identifikasjon. Blodprøver ble brukt for bekreftende formål (valideringssettet).
Target genekspresjonsanalyser på ekson-nivå
epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR).
EGFR-genekspresjon ble målt ved 451 loci, hvorav 51 ble plassert i eksoner, og 400 var ligger utenfor eksoner,
ie
intronic, intergeniske eller var upålitelig (figur 1, øvre panel). Dermed ble til sammen 51 ekson probesets uttrykk intensiteter målt i EGFR-genet. Et sammendrag mål på alle disse ekson-nivå probesets ble gitt av PCA (score på den første PC-aksen). Sammenhengen mellom denne stillingen og TS12 og TTP henhold BE, OS, og TTP etter kjemoterapi ble evaluert.
De røde flått viser exonic probesets, de grå flått vise de ikke-exonic probesets (intronic, intergeniske og upålitelige ). I EGFR, KRAS og VEGFA, totalt 51 av 451, 13 262 og 25 av 26 exonic probesets ble målt henholdsvis. Alle andre probesets ble plassert utenfor eksoner,
dvs.
intronic, intergeniske eller var upålitelig.
Vi fant en signifikant korrelasjon mellom EGFR PCA score og TS12 etter BE behandling (Spearmans,) (figur 2A, venstre panel). En detaljert analyse probeset-by-probeset viste at 86% av exonic probesets viste en signifikant korrelasjon med tumorkrympning uten korreksjon for multippel testing () (figur 2B, venstre panel). To probesets viste en særlig sterk sammenheng med TS12 (ekson probesets ID 3002770 og 3002769), som forble signifikant etter Bonferroni korreksjon for multippel testing. Disse 2 probesets er plassert i exon 18 (kromosom 7 posisjonerer 55’238’440 og 55’238’092, henholdsvis). Ingen andre signifikante sammenhenger ble funnet. Seks pasienter hadde TTP på 15 måneder eller mer. Tre av disse hadde EGFR del19, og tre var EGFR og KRAS villtype.
Rad A viser sammenhengen mellom tumorkrympning ved uke 12 og ekson-nivå sammensatt score (PCA akse 1) for EGFR, KRAS og VEGFA (venstre, midtre og henholdsvis høyre). PCA score er definert som koordinatene til pasientene i et nytt rom definert av lineær kombinasjon av de opprinnelige probeset intensitetsverdier ved hjelp av prinsipal komponent analyse. Pasienter med EGFR mutasjoner er merket med rødt, de med ikke-tilgjengelig mutasjonsstatus vises som tomme sirkler. Raden B viser betydningen av korrelasjonen (-log (-verdi)) mellom hver ekson probeset og svulsten krymping i uke 12. Plasseringen av eksoner vises i blått.
Figur 3 viser signifikant sammenheng med exon 18-EGFR uttrykk intensitet og TS12. Det venstre panelet viser en sterk sammenheng mellom uttrykk intensiteten av ekson 18-EGFR (probeset 3.002.770) og TS12 (Spearmans,).
Det venstre panelet viser sammenhengen mellom uttrykk intensiteten av ekson 18-EGFR ( probeset 3002770) og svulsten krymping i uke 12. den vertikale linjen viser median uttrykk intensiteten av EGFR probeset 3002770. Pasienter med EGFR mutasjoner er vist som røde vanlig prikker og merket accrodingly. Pasienter med ikke-tilgjengelig mutasjonsstatus vises som tomme sirkler. Det sentrale panel representerer mottakeren opererer karakteristikk (ROC) kurve som viser følsomheten /spesifisitet for en test basert på ekspresjonsnivået av EGFR probeset 3.002.770 å klassifisere respondere (tumorkrympning ved uke 120/20 /30%) sammenlignet med ikke-respondere ( tumorkrympning ved uke 120/20/30%). Sletten prikker skildre de sanne positive og falske positive priser innhentet ved å feste verdien cutoff til median uttrykk nivået av EGFR 3002770. Fossen tomten (høyre panel) viser endring i tumorstørrelse i uke 12 bestilles fra venstre til høyre. Fargene er definert ved uttrykket intensiteten av EGFR 3002770 dikotomisert ved medianen av uttrykket Evel (blå: lav uttrykk intensiteter, rød: høy ekspresjon intensitet).
Den sterke korrelasjonen mellom EGFR ekson 18 uttrykk og TS12 forble svært signifikant (Spearmans,) etter å begrense analysen til EGFR villtype pasienter (se figur S1 i saksdokumenter). Denne sub-analyse indikerer at sammenhengen mellom EGFR ekson 18 uttrykk og TS12 var uavhengig av EGFR mutasjonsstatus.
ROC-analyse (i midten panel) viser forholdet mellom sensitivitet og spesifisitet avhengig av ulike cut-off nivå av ekson 18-EGFR (probeset 3002770) uttrykk for å klassifisere pasientene inn «respondere» vs «ikke-respondere». For hensikten med denne ROC analyse, kategorisering «respondere» vs «ikke-respondere» avledet fra TS12. kategori Vi foreslo 3 alternative definisjoner til «respondere» ved å sette TS12 cut-off som større eller lik 0, 20, eller 30%, avhengig av om man følger alle eller en brøkdel av stabile sykdom pasienter i «respondere» . Ved hjelp av median ekspresjon av EGFR probeset 3002770 som test-terskel gir en klassifisering nøyaktighet på 75% (sensitivitet = 100% spesifisitet = 67%). Som vist i ROC kurve, kan en høyere klassifisering nøyaktighet kan forventes ved ytterligere finjustering denne terskelen (areal under kurven [AUC] = 0,93).
De to ekson 18-EGFR probesets som viser sterkest sammenheng med TS12 viste også en signifikant sammenheng for samme endepunkt målt ved hjelp av blod ().
stabiliteten i våre funn ble vurdert ved hjelp av bootstrapping, og kryss-validering strategier. Fremgangsmåten bekreftet sterk klassifisering nøyaktigheten av exon 18 EGFR med en median ROC-AUC av 0,94 (95% CI: 0,70 til 1,00) og den spesifikke assosiasjon mellom ekson 18 regionen og tumorkrympning ved uke 12 (se fig S2 og tekst S1 for detaljert prosedyre).
Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog (KRAS) og vaskulær endotelial vekstfaktor-alfa (VEGFA).
totalt 13 og 25 ekson probesets uttrykk intensiteter ble målt innenfor henholdsvis KRAS og VEGFA (figur 1, sentral og høyre panel). PCA score på begge settene med probeset (KRAS og VEGFA) viste ikke signifikant sammenheng med noen av de kliniske endepunkter. En detaljert analyse probeset-by-probeset viste ingen signifikant sammenheng med enten TS12 (figur 2A, B, sentral og høyre panel) eller de andre undersøkte endepunkter.
Diskusjoner
Så vidt vi vet dette er den første studien utforsker sammenhengen mellom genuttrykk vurderes på et subgenic exonic nivå ved hjelp av Affymetrix Menneskelig Exon 1,0 ST arrays og respons på behandling med en EGFR-TKI i kombinasjon med en anti-angiogen agent. Vi undersøkte exon intensitetsvariasjoner innen 3 viktige gener (EGFR, KRAS og VEGFA) potensielt assosiert med respons på behandling med BE. Vi var i stand til å demonstrere en sterk sammenheng mellom de fleste, men ikke alle, av de 51 EGFR ekson probesets og TS12 av førstelinje BE behandling hos pasienter med ubehandlet avansert ikke-plateepitel NSCLC. Exon 18-EGFR nivåer viste best sammen med svar på BE. Basert på våre tidligere forsøk vi anta at signalet vi målt i EGFR Exon 18 ikke være avhengig av tumorcelle-innholdet [23]. Videre var det et kvantitativt forhold – høyere EGFR-mRNA-nivået ble korrelert med mer uttalt svulstreduksjon, uavhengig av EGFR-mutasjonsstatus. EGFR exon-nivå uttrykk analyse kan bli en nyttig biomarkør for daglig klinisk praksis som det gir flere fordeler sammenlignet med konvensjonelle mutasjonsanalyse ved gensekvensering. Vanligvis er EGFR-genekspresjon målt ved hjelp av kvantitativ RT-PCR med primere som binder til et enkelt gen region ofte nær 3′-enden av genet. Men som vist i vår studie, genekspresjon fikk betydelig variere over span av EGFR-genet. Årsaker til slike uttrykk varianter inkluderer alternativ spleising. EGFR-varianten type III (EGFRvIII) har en i-ramme delesjon av exoner 2-7 som er blitt funnet å være generert av gen-omleiring eller avvikende mRNA-spleising [24], [25]. Denne alternative spleising form er funnet i NSCLC [26], [27]. I prekliniske forsøkene, celler som uttrykker EGFRvIII var resistente mot reversible EGFR-TKI, men forble følsomme for irreversible EGFR-hemmere [28]. Vi fant den beste korrelasjon med TS12 og ekson 18. I ytterkantene av EGFR-genet flere exonic probesets viste ingen signifikant sammenheng med utfallet. Dziadziuszko og kolleger rapporterte at høy EGFR mRNA uttrykk analysert av kvantitativ RT-PCR ble assosiert med økt respons og forlenget PFS hos pasienter behandlet med gefitinib [29]. I en kinesisk studie av 79 uselekterte pasienter behandlet med erlotinib ingen signifikant sammenheng mellom EGFR mRNA uttrykk, EGFR mutasjoner, KRAS mutasjoner og kliniske endepunkter ble funnet [30].
Flere forsøk har vist at klinisk nytte med EGFR-TKI var ikke begrenset til pasienter med aktiverende EGFR mutasjoner [13], [16], [31]. På den annen side, IPASS test viste at pasienter med EGFR vill-type som ble behandlet med gefitinib hadde en betydelig kortere PFS sammenlignet med pasienter i kjemoterapi arm (risikoforhold (HR): 2,85; 95% CI: 2,05 til 3,98;) [ ,,,0],8]. I denne studien, var vi i stand til å identifisere 3 pasienter med EGFR villtype og høy ekson 18-EGFR uttrykk nivåer (2 målt i biopsier og blod, og en målt i blod bare) som hadde betydelig TS12 etter behandling med BE. Vi mener at disse resultatene er av interesse, fordi forekomsten av aktiverende EGFR mutasjoner i kaukasiske pasienter er 10-15%, og vår test kan identifisere flere pasienter som kunne fare bedre med førstelinje EGFR-TKI sammenlignet med kjemoterapi. Denne hypotesen må potensielle validering.
Interessant, pasienter med sjeldne EGFR-mutasjoner (
f.eks
del L747-S751 og del R748-S752) som svar på EGFR-TKI har ennå til å være utforsket ble også funnet å ha høyere exon-nivå av EGFR-ekspresjonsnivåer som ble korrelert med TS12. To probesets ligger på ekson 18 viste den sterkeste tilknytning svulst krymping. I en italiensk enkelt institusjon studien ble sjeldne EGFR-mutasjoner (ekson 18 og 20 og uvanlig mutasjoner i eksoner 19 og 21 og /eller komplekse mutasjoner) funnet hos 2,6% av pasientene. De rapporterte PR som erlotinib hos en pasient med en E709A + G719C dobbelt mutasjon og en reaksjon på erlotinib hos en pasient med en G719S mutasjon [32]. Andre grupper rapporterte sensitivitet for EGFR-TKI for E709A + G719C dobbelt mutasjon og for G719S mutasjon i ekson 18 [33] – [35]
Interessant, observerte vi tumor svinn hos en pasient med en KRAS mutasjon. . Denne pasienten hadde en høy EGFR ekson uttrykk. Pasienter med KRAS mutasjoner som representerer omtrent 25% av NSCLC og er blitt beskrevet som meget motstandsdyktig mot EGFR-TKI behandling med RR nær 0% og dårligere resultat for muterte pasienter behandlet med EGFR-TKI i noen studier [36], [37] . Den biomarkør analyse av SATURN rettssaken viste ingen skadelig effekt på PFS med erlotinib hos pasienter med KRAS muterte tumorer [17]. Dermed kan høy ekson EGFR uttrykk nivåer kunne identifisere pasienter med KRAS-mutasjoner som utlede nytte av førstelinje BE.
Andre potensielle molekylære markører utover EGFR-mutasjoner er blitt etterforsket for sin prediktiv rolle for behandling med TKI eller TKI i kombinasjon med VEGFR-inhibitorer. EGFR protein uttrykk oppdages ved immunhistokjemi (IHC) er til stede i 60-90% av NSCLC pasienter [13], [38] og derfor neppe være til nytte for klinisk utvalg for TKI behandling. Selv subgruppeanalyser av placebokontrollerte fase III-studier i pre-behandlede pasienter viste noen prediktiv verdi av EGFR protein uttrykk [13], [39] Disse resultatene ble ikke bekreftet verken i første linje eller vedlikehold innstillingen [17], [40] . Tilsvarende høy EGFR kopiantall, som forekommer i 30-50% av pasienter med NSCLC, og genamplifisering, som forekommer i omtrent 10% [41], har nylig blitt vist å være € styres € av EGFR mutasjoner med hensyn til deres prediktive verdi for responsen på EGFR-TKI [40]. Bestemmelse av EGFR mRNA uttrykk av kvantitativ PCR ble korrelert til EGFR FISH og IHC og viste seg å være en prediktiv biomarkør for gefitinib [29]. Verken EGFR protein uttrykk eller EGFR FISH testing blir i dag brukt i klinisk praksis og bedre molekylære markører derfor et presserende behov.
EGFR-genet gir opphav til flere RNA transkripsjoner gjennom alternativ spleising og bruk av alternative polyadenyleringssignaler [42 ]. EGFR-gen strekker seg over nesten 200 kb og det full-lengde 170 kDa EGFR er kodet av 28 eksoner. Flere alternative spleisevarianter som er beskrevet [43]. Den mest brukte metoden for å påvise EGFR-mutasjoner er direkte sekvensering av PCR-amplifiserte ekson-sekvenser. Kopiantallet av mutant allel, ubalanserte PCR-amplifikasjon og den relative mengde av forurensende villtype-allelet av ikke-tumorceller kan påvirke sensitiviteten av mutant påvisning ved direkte sekvensering [44]. På grunn av bekymring når det gjelder følsomheten av den direkte-sekvenseringsmetode, har en rekke andre metoder blitt undersøkt for å øke følsomheten for mutasjonsanalyse. Her undersøkte vi for første gang ekson uttrykk analyse. Matrisen som brukes muliggjør gen-ekspresjon analyse, samt påvisning av forskjellige isoformer av et gen. I denne studien har vi i ettertid identifisert en sammenheng mellom exon intensitetsnivåer innen EGFR og pasient utfall. Den mekanisme som EGFR ekson 18 uttrykk bestemmer en økt følsomhet for bevacizumab-erlotinib er ukjent, men forskjellige hypoteser kan bli foreslått. Exon matrise er fortsatt veldig fersk med høyt potensial teknologi. Det bremser med felles idé at genuttrykk er stabil over span av en hel gen. Derfor er det ikke overraskende at vi oppnådd en sterkere statistisk sammenheng EGFR-ekspresjon i nærheten av området som koder for den funksjonelle transmembran del av EGFR. Hvis den prediktive verdien av denne analysen kunne bekreftes i en prospektiv studie, kan ekson-nivå genuttrykk identifisere pasienter som stammer nytte av EGFR og VEGFR-målrettet terapi utover pasientene valgt av konvensjonell gensekvensering.
Det er visse begrensninger i denne studien. Det er en enkelt arm utforming, og har et forholdsvis lavt antall pasienter fra hvilken tumor-biopsier var tilgjengelig for analyse. I første halvdel av Sakk 19/05 rettssaken en behandling-naive biopsi ikke var nødvendig for studien inkludering. I denne perioden praktisk talt ingen biopsier ble samlet. Etter en endring (oktober 2006) ble biopsi obligatorisk for studier inkludering som et behandlingsnaive biopsi kan tas i nesten alle pasienter inkludert avansert stadium NSCLC pasienter [23]. Exon array-analyser ble gjort med blandede celle tumor biopsier uten tumorcelle berikende teknikk som laser-fangst mikrodisseksjon. Dette vil sannsynligvis føre til en viss fortynning av den egentlige tumor-signalet. Tumor-celle berikende teknikker kan ytterligere å optimalisere effektiviteten av biomarkører som stammer fra ekson rekke analyser. Gyldigheten av EGFR ekson uttrykk analyse som en biomarkør for respons på BE må bekreftes både ved hjelp av RT-PCR-analyse rettet mot EGFR ekson 18. Den fulle gjennomføring av validering av romanen biomarkør krever slutt videre undersøkelser ved hjelp av en uavhengig prospektiv randomisert studie .
i konklusjonen, ved hjelp av en roman genuttrykk array-teknologi med exonic dekning, var vi i stand til å identifisere ekson 18-EGFR uttrykk som en potensiell prediktiv biomarkør for erlotinib og bevacizumab hos pasienter med avansert, ubehandlet NSCLC .
Materialer og metoder
Sakk 19/05
Sakk 19/05 studie (ClinicalTrials.gov: NCT00354549) inkluderte 103 pasienter med avansert ikke-plateepitel NSCLC, 101 pasienter ble evaluert for videre analyse [21]. Kriteriene inkludert alder år, tilstrekkelig benmargsfunksjonen, normal nyre- og leverfunksjon og målbar sykdom. Pasienter med umiddelbare behov for kjemoterapi, med store sentralt beliggende svulster, pre-eksisterende kreft kavitasjon og hjernemetastaser ble ekskludert. Ekstra forbehandling bronkoskopiske biopsier for translasjons-undersøkelser ble foretatt i 49 pasienter, som 42 var av tilstrekkelig kvalitet for etterfølgende exon rekke analyse. For dagens substudien, forbehandling blodprøver var tilgjengelig fra 95 pasienter, og prøver fra 75 pasienter hadde tilstrekkelig kvalitet for ekson arrays. Total, 76 pasienter med tumor eller blodprøver eller begge deler, ble inkludert i den aktuelle substudien. Skriftlig informert samtykke for translasjonsforskning ble innhentet fra alle pasienter. Den kliniske studien samt gjeldende substudien ble godkjent av IRB av St. Gallen (EKSG 06/012).
Trial design
Sakk 19/05 var en multisenter, prospektiv, åpen -label, single-arm, fase II studie hos tidligere ubehandlede pasienter. Fra januar 2006 til april 2009, ble 103 pasienter fra 14 sveitsiske institusjoner påmeldt og fikk være til sykdomsprogresjon eller uakseptabel toksisitet. På tidspunktet for progresjon, pasienter fikk kjemoterapi med 4-6 sykluser av cisplatin og gemcitabin. Det primære endepunktet var sykdomsstabilisering rente (DSR) definert som andelen pasienter med komplett respons (CR), partiell remisjon (PR) eller stabil sykdom (SD) etter 12 uker med BE behandling. Sekundære endepunkter inkluderte TTP henhold BE, så vel som under CT, total overlevelse (OS), tumor svinn på 12 uker og 6 måneder. De kliniske resultatene av denne studien har vært rapportert tidligere [21].
Patologi analyse
formalinfiksert og parafininnebygd prøver ble gjennomgått og klassifisert i henhold til Verdens helseorganisasjons (WHOs) kriterier til. Mutasjons analyser av EGFR (exon 18-21) og KRAS (ekson 12) ble utført fra ufargede vevssnitt (3 mikrometer) eller Papanicolaou-farget cytologiske prøver å bruke direkte sekvensering som tidligere beskrevet [45], [46]. Tumorcelle berikelse ble oppnådd enten ved macrodissection eller laser-fangst mikrodisseksjon og DNA sekvensanalyse.
Exon-nivå genekspresjonsanalyser
Total RNA fra hele bronkoskopi biopsiprøver ble hentet ut og gitt tilstrekkelig kvalitet for microarray hybridisering i 42 av 49 prøver. Sirkulasjons RNA fra perifere blodprøver ble trukket ut og gitt tilstrekkelig kvalitet for microarray hybridisering i alle 75 prøver. mRNA ble hybridisert på Affymetrix Menneskelig Exon 1.0ST arrays (Affymetrix, Santaclara, CA, USA) etter standard anbefalinger fra produsenten (detaljert prosedyre tilgjengelig i Tekst S1). Rådata er blitt deponert i NCBIs Gene Expression Omnibus (GEO), og er tilgjengelig gjennom GEO-serien sjonsnummer GSE37138. De ekson og gennivå probesets var pre-behandlet, kvalitetssikret og normalisert ved hjelp av RMA prosedyre [47]. Vevet og blod datasett ble analysert uavhengig av hverandre uten pooling data. Vevet datasettet ble brukt for biomarkører mens blodet datasettet ble brukt til intern validering.
statistiske betraktninger
Den første prøven størrelse beregningen var basert på det primære endepunktet av den kliniske studien (DSR på uke 12 (DSR12) under BE behandling). De 101 evaluerbare pasienter påløpt garantert en høy presisjon i beregningen av DSR12. I en målrettet genet tilnærming, ble 3 gener spesielt undersøkt: EGFR (ENSG00000146648), KRAS (ENSG00000133703) og VEGFA (ENSG00000112715). EGFR inkludert 51, KRAS 13, og VEGFA 25 exonic probesets (figur 1). Endepunktene vurderes i denne biomarkør studien inkluderte svulst krymping etter 12 uker (TS12) av BE behandling, TTP henhold BE og OS. OS ble målt fra registrering til død av enhver årsak. Resultatet av foregående tumor EGFR sekvensering ble benyttet for substudien analyse. Den univariate assosiasjon mellom exon-nivå intensiteter og tid-til-event endepunkter ble vurdert av Cox regresjon. Korrelasjonen mellom ekson-nivå intensiteter og tumorkrympning ble målt ved hjelp av Spearmans korrelasjonskoeffisient og testet med hensyn til signifikant forskjell fra 0. Bonferroni-korreksjoner ble anvendt for å ta hensyn til flere testing. Prinsipal komponent analyse (PCA) ble brukt for å sammenfatte informasjonen i flere exon-nivå probesets i sammensatte score (score på de første hovedkomponenter). Mottaker Drifts Karakteristiske (ROC-kurvene) ble brukt til å estimere sensitivitet, spesifisitet og nøyaktighet av ekson ekspresjonssystemer basert prediktorene. For å vurdere stabiliteten av våre funn, ble en kryssvalidering strategi som brukes. Nøyaktigheten av klassifiseringen modellen ble evaluert ved hjelp av bootstrapping. Alle analyser ble gjort ved hjelp av R statistisk programvare (versjon 2.13.0, pakker xmapcore, ade4, ROCR, Daim og overlevelse) [48]
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1..
Association mellom EGFR ekson 18 uttrykk og tumor svinn i uke 12 – sub-analyse. Bare EGFR villtype pasienter ble inkludert i denne analysen. Den spredningsdiagram viser sammenhengen mellom uttrykk av EGFR ekson 18 (probeset 3.002.770) og svulsten krymping i uke 12. Den vertikale linjen viser median uttrykk intensiteten av EGFR ekson 18.
doi: 10,1371 /journal.pone.0072966 .s001 product: (TIF)
Figur S2.
Stabilitet av prediksjon evne EGFR biomarkører som bruker kryssvalideringsstrategier. Den venstre panel viser evne til EGFR biomarkør mest signifikant assosiert med TS12 (≤ / 20%) med den originale datasettet (probeset 3002770) for å klassifisere BE respondere. Den beste cut-off-verdi, sammen med den tilhørende falske positive (FPR), sanne positive rate (TPR) og arealet under ROC-kurven (AUC) er gitt. Høyre panel viser gjennomsnitt ROC kurve oppnådd etter 0,632 bootstrap kryssvalideringsprosedyre. De boksplott viser fordelingen av FPR gjennom re-samplet datasett
doi:. 10,1371 /journal.pone.0072966.s002 plakater (TIF)
Tabell S1.
Oppsummering av alle pasienter inkludert i Sakk 19/05 rettssaken. DST W12. Stabilisering sykdom uke 12, 0 = fiasko, 1 = suksess
doi: 10,1371 /journal.pone.0072966.s003 product: (PDF)
Tekst S1.
Ytterligere materiale og metoder informasjon. Det første avsnittet gir en utvidet beskrivelse av ekson-nivå genekspresjon analyse. Annet ledd gir detaljer om vurdering av stabiliteten av de oppnådde resultatene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0072966.s004 product: (PDF)
Takk
Prøve innsamling, transport og behandling ble gjort innenfor rammene av den sveitsiske Lung Biopsi Biobank som vi er svært takknemlig. Vi er veldig takknemlige til Philippe Demougin som utførte RNA isolering og exon rekke hybridisering. Studien kunne ikke ha blitt gjort uten vilje av pasienter til å delta i denne studien, spesielt for å gjennomgå en ekstra bronkoskopi i visse tilfeller.
Bidragsytere
Medlemmene av Sakk 19/05 Study teamet
