Abstract
Bakgrunn
Det er begrenset informasjon om mekanismer der mirnas bidra til lunge kreftutvikling. Denne studien ble gjennomført for å undersøke uttrykk og funksjon av miRNAs indusert av sigarettrøyk kondensat (CSC) i normale menneskelige respiratoriske epitel og lungekreft celler.
Metodikk
Micro-array og kvantitativ RT PCR (QRT-PCR) teknikker ble anvendt for å vurdere miRNA og vert-gen-ekspresjon i dyrkede celler, og kirurgiske prøver. Programvare styrt analyse, RNA kryss-link immunoprecipitation (CLIP), 3 «UTR luciferaserapportørplasmid analyser, QRT-PCR, fokusert super-matriser og vestlige blot teknikker ble brukt til å identifisere og bekrefte mål av MIR-31. Chromatin immunoprecipitation (chip) teknikker ble brukt for å evaluere histone merker og transkripsjonsfaktorer innenfor LOC554202 promoter. Celler og xenograft eksperimenter ble brukt for å vurdere virkningene av MIR-31 på spredning og tumorigenicity av lungekreft celler.
Resultater
CSC betydelig økt MIR-31 uttrykk og aktivert LOC554202 i normal luft epitel og lungekreft celler; MIR-31 og LOC554202 uttrykk vedvarte etter seponering av CSC eksponering. MIR-31 og LOC554202 uttrykk nivåer var signifikant forhøyet i lungekreft eksemplarer i forhold til tilstøtende normale lungevev. CLIP og reporter analyser vist direkte interaksjon av MIR-31 med Dickkopf-en (Dkk-1) og DACT-3. Over-uttrykk for MIR-31 markant redusert Dkk-1 og DACT3 uttrykk nivåer i normale respiratoriske epitel og lungekreft celler. Knock-down av MIR-31 økte DKK-en og DACT3 nivåer, og opphevet CSC-mediert reduksjon i Dkk-1 og DACT-tre uttrykk. Videre over-uttrykk for MIR-31 redusert SFRP1, SFRP4, og WIF-en, og økt Wnt-5a uttrykk. CSC økt H3K4Me3, H3K9 /14Ac og C /EBP-B nivåer i LOC554202 promoter. Knock-down av C /EBP-β avskaffet CSC-mediert aktivering av LOC554202. Over-uttrykk for MIR-31 betydelig forbedret spredning og tumorigenicity av lungekreft celler; knock-down av MIR-31 hemmet veksten av disse cellene.
Konklusjoner
Sigarettrøyk induserer ekspresjon av MIR-31 rettet mot flere motstandere av kreft stamcellesignalisering i normal luft epitel og lungekreftceller . MIR-31 fungerer som en oncomir under menneskelig lunge kreft
Citation:. Xi S, Yang M, Tao Y, Xu H, Shan J, Inchauste S, et al. (2010) sigarettrøyk Induserer C /EBP-β-mediert aktivering av MIR-31 i Normal Menneskelig Respiratory epitel og lungekreft celler. PLoS ONE 5 (10): e13764. doi: 10,1371 /journal.pone.0013764
Redaktør: Oliver Eickelberg, Helmholtz Zentrum München /Ludwig-Maximilians-universitetet München, Tyskland
mottatt: 1 juni 2010; Godkjent: 04.10.2010; Publisert: 29 oktober 2010
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health egenutført midler. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Genetic samt epigenetisk dysregulering av genekspresjon i løpet av malign transformasjon skyldes delvis avvikende ekspresjon av mikro-RNA (mirnas) [1], [2]. Disse små (~21-mer) ikke-kodende RNA-molekyler som regulerer genekspresjon ved å binde seg til 3′-utranslaterte regioner (3′-UTR) av mål-mRNA transkript utløser degradering eller translasjonsbevegelse undertrykkelse avhengig av graden av komplementaritet mellom frøet sekvensen av miRNA og mRNA-motivet [3]. Omtrent 30% av alle mRNA er potensielle miRNA mål. Hittil har mer enn 800 mirnas blitt identifisert hos mennesker, som hver er målrettet mot flere funksjonelt-relaterte gener, og dermed formidling komplekse regulatoriske nettverk [3], [4].
En rekke miRNAs har vært innblandet i patogenesen av menneskelige lunge kreft, de aller fleste som er direkte knyttet til røyking [5], [6]. Noen av disse miRNAs fungere som onkogener (oncomirs), mens andre fungerer som tumor suppressors. For eksempel, MIR-21, som aktiveres delvis via avvikende EGFR-signalering undertrykker ekspresjon av PTEN og PDCD4, tilrettelegging spredning, invasjon, og resistens mot apoptose av lungekreftceller [7] – [11]. Aktivering av MIR-93, MIR-98 og MIR-197 hemmer uttrykk for FUS1, styrke cellecyklusprogresjonen og cellegift-motstand i lungekreftceller [12], [13]. Undertrykkelse av MIR-15A og MIR-16, som målrette cykliner D1, D2 og E, opphever Rb-mediert cellesyklusregulering i lungekreftceller [14]. Videre er nedregulering av la-7 familiemedlemmer som målretter mange mRNAer som koder for cellesyklusregulerende proteiner som Ras, AURKA, AURKB og E2F5 øker proliferasjon og tumorigenisitet av lungekreftceller [7], [15], [16]. Interessant nok flere miRNA endringer ofte observert i lunge cancer, slik som nedregulering av la-7 og over-ekspresjon av MIR-17-92, blir detektert i kreft stamceller [17], [18] samt pseudoglandular lunge parenchyma [19], noe som tyder på embryonale omprogrammering av miRNA uttrykk under lunge kreftutvikling.
til tross for nylige studier som viser miRNA uttrykk profiler som korrelerer med tumorhistologi, samt røyking status og prognose for pasienter med primær lungekreft, [6], [20] – [22], er begrenset informasjon tilgjengelig om miRNA endringer som direkte bidrar til initiering og tidlig progresjon av disse kreftformer. I denne studien, benyttet vi en in-vitro modellsystem for å undersøke miRNA endringer mediert av sigarettrøyk kondensat (CSC) i normal menneskelig respiratorisk epitel, og lungekreft celler avledet fra røykere samt røykere. Heri, rapporterer vi at CSC induserer ekspresjon av MIR-31 rettet mot flere Wnt signal antagonister, også Dickkhopf-en (Dkk-1) og DACT3 i normal menneskelig respiratorisk epitel samt lunge kreftceller. Disse observasjonene gir en direkte mekanisk kobling mellom sigarettrøyk og aktivering av en oncomir undertrykke antagonister av stamcellesignalisering i løpet av tobakk-indusert lungekreftutvikling.
Materialer og metoder
Cellelinjer og behandlingsforhold
Alle lungekreftlinjer ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), og holdt i RPMI-medium supplert med 10% FCS, 10 mM glutaminsyre og 1% penicillin /streptomycin. Primære normale humane liten luftveis-epitelceller (SAEC) og normale humane bronkiale epitelceller (NHBE) ble oppnådd fra Lonza, Inc (Frederick, MD), og dyrkes pr leverandørens instruksjoner. Udødeliggjort menneskelige bronkial epitelceller (HBEC) ble sjenerøst gitt av John D. Minna (UT Southwestern, Dallas, TX), og dyrket i komplett keratinocyte-SFM media (Invitrogen, Carlsbad, California) supplert med 5 ug /L epidermal vekstfaktor ( EGF) og 50 mg /l bovint hypofyseekstrakt (BPE). Sigarettrøk kondensater (CSC) avledet fra Kentucky referanse 3R4F forskning blandings sigaretter (University of Kentucky) ble fremstilt som beskrevet [23], og resuspendert i en konsentrasjon på 1 mg tjære /ml i RPMI, som ble definert som 10% CSC [24 ]. For røyk eksponering eksperimenter, ble cellene dyrket i 10-cm retter i passende normale media (NM) med eller uten CSC (1%). Mediet ble skiftet daglig med tilsetning av frisk CSC. Cellene ble dyrket som er nødvendig, og høstet på ulike tidspunkter for analyse.
Det menneskelig vev
Primærlungekreft prøver og tilstøtende histologisk normal lungeparenkym ble høstet intraoperativt fra pasienter som gjennomgår potensielt kurativ reseksjoner på NIH intern gjennomgang styregodkjente protokoller, krever skriftlig informert samtykke. Alle vev ble umiddelbart hurtigfrosset med et parti av høstet vev sendt for umiddelbar bekreftelse histologisk av en uavhengig, anatomisk patolog på en blindet måte. Vevsprøver var bar-kodet og lagret i Thoracic Oncology Laboratory, Kirurgi Branch, NCI. For mikroRNA isolering og ekspresjon analyse, ble de små RNA-fraksjonen isolert med RT2 qPCR-Grade miRNA Isolation Kit (Qiagen, Valencia, CA), og miRNA ekspresjon ble kvantifisert med den QRT-PCR miRNA Detection Kit (ABI, Carlsbad, CA) .
miRNA overekspresjon og hemming
Precursor og inhibitor mirnas pMiR-H31PA-en, pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP negativ kontroll, MZIP31-PA-1, pGreenPuro Scramble hårnål negativ kontroll ble kjøpt fra SBI (System biovitenskap, Mountain View, California). miRNA forløpere eller hemmere (både på 50 nM) ble transfektert inn i cellene ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California).
Reporter vektorer og DNA-konstruksjonene
De 3 «UTR av DKK1 (850 bp) og DACT3 (2461 bp) ble PCR-amplifisert fra human SAEC cDNA, og satt inn nedstrøms for CMV-drevet ildflueluciferase kassett i pMIR-RAPPORT vektor (Ambion, Austin, TX) mellom
Hind III
og
Spe I
nettsteder. Mutant reporter plasmider (3 «UTR av DKK1 og DACT3) ble opprettet ved hjelp av QuikChange seterettet mutagenese Kit (Stratagene, Wilmington, DE). Alle innsats fragmenter ble bekreftet ved direkte sekvensering.
Luciferase miRNA mål reporter analyser
For miRNA mål validering, ca 2 × 10
4 SAEC celler per brønn i 24-brønners plater ble midlertidig transfektert med 25 til 50 ng av hver ildflue luciferase reporter konstruksjon (Promega, Madison, WI), 150-175 ng pcDNA3 tom vektor, 200 ng pRTK-Luc (Promega) som intern kontroll, og 30 pmol av pre-MIR-31 (SBI, Mountain View, California). Renilla luciferase vektor ble benyttet til å normalisere transfeksjonseffektivitet. Omtrent 24 timer etter transfeksjon, ildflue og Renilla luciferasepreparater aktiviteter ble analysert. Normaliserte relative lysenheter representerer ildflue luciferase-aktivitet /Renilla luciferaseaktivitet.
proliferasjonsanalyser
Celler ble sådd ut ved en konsentrasjon på 5 x 10
4 celler per brønn i 24-brønners plater og dyrket i NM med eller uten CSC pluss plasmid transfeksjon. Tredoble brønner ble høstet og tellet ved trypanblått eksklusjons teknikker.
Kvantitativ RT-PCR
For mRNA, ble totalt RNA utarbeidet etter TRIzol reagens (Invitrogen) og genomisk DNA ble eliminert med TURBO DNA- gratis Kit (Ambion). Ett pg av total RNA ble revers transkribert ved hjelp av iScript revers transkriptase (Bio-Rad). Utelatelse av revers transkriptase tjente som en negativ kontroll. cDNA ble forsterket ved hjelp av Platinum PCR SuperMix (Invitrogen). PCR ble utført som følger: 5 minutter ved 94 ° C, 35 sykluser av 60 sekunder ved 94 ° C, 60 s ved 57-60 ° C og 60 s ved 72 ° C, etterfulgt 5 minutter ved 72 ° C. Real-time kvantitativ RT-PCR-analyse ble gjort som beskrevet [25] med Dkk-1, DACT3, SFRP1, SFRP4, WIF-en, og p-aktin primere fra Applied Biosystems eller integrert DNA Technologies (Coral, IA). For mikroRNA isolasjon og uttrykk analyse, uttrykk for miRNA isolert med RT2 qPCR-Grade miRNA Isolation Kit (Qiagen) ble kvantifisert med QRT-PCR miRNA Detection Kit (ABI).
Chromatin immunoprecipitation (chip)
Celler ble tverrbundet med 1% formaldehyd, lysert og ultralydbehandlet på is for å generere DNA-fragmenter med en gjennomsnittlig lengde på 200-800 bp [26]. Etter pre-clearing, ble 1% av hver prøve lagret som input brøkdel. Immunpresipitasjon ble utført ved hjelp av antistoffer som spesifikt gjenkjenner H3K4me3, H3K9Ac, H3K14Ac (Abcam), RNA polymerase II (Upstate) eller IgG kontroll. DNA ble eluert og renset fra komplekser, etterfulgt av PCR forsterkning av LOC554202 arrangøren bruke primere og betingelser som beskrevet [27].
siRNA og shRNA knockdown
Calu-6 og H841 celler ble midlertidig transfektert med sirnas rettet mot C /EBP-α og C /EPB-β, eller simulert siRNA sekvenser (Dharmacon, Lafayette, CO) ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Målgenet knockdown ble bekreftet ved RT-PCR og Western blot-teknikker.
Western blot-analyse
Proteinekstrakter ble samlet som tidligere beskrevet [26]. Prøvene ble separert på 4-12% Tris-glycin-SDS-polyakrylamidgel-elektroforese-geler og blottet på Immobilon P-membran (Millipore, Billerica, MA); proteiner ble oppdaget ved hjelp av forbedrede chemiluminescence gjenkjenning reagenser (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Antistoffer som benyttes for Western-analyse ble geite-anti-DKK-1, mus anti-DACT3, og geite-anti-β-aktin (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA).
RT-PCR-matriser
wnt signale RT-PCR super-arrays (PAH-043A) ble hentet fra SABiosciences (Frederick, MD). 1 ug total RNA ble brukt for revers transkripsjon og hele cDNA reaksjonen ble fortynnet og fordelt på de 96 brønner av super-matrisen plate. Reaksjonene ble utført med RT
2 SYBR Grønn /ROX PCR Master Mix (SABiosciences). Resultatene ble analysert ved hjelp av programvare som leveres av leverandøren https://www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php.
mikroRNA microarray analyse
Brønn molekylære RNA (små RNA) ble hentet fra celleplatene med Mirvana ™ miRNA isolasjon kit (Ambion, Austin, TX) ved hjelp av miRNA berikelse metoden i henhold til produsentens protokoll. Tre hundre nanogram små RNA fra vevsprøver var direkte merket med N-kode miRNA merking kit (Invitrogen) per leverandørens protokoller. I korthet modne mirnas i små RNA prøver ble først hale med poly (A); poly (A) hale mirnas ble deretter merket med en fangst sekvens, etterfulgt av hybridisering til Cy5 /Cy3 merket 3DNA dendrimerer. For microarray databehandling og normalisering ble microarray chips skannet med en GenePix 4000B scanner (Axon Instruments, Union City, CA) og median stikk intensiteter ble generert ved hjelp GenePix 5.0 (Axon Instruments, Union City, CA). Microarray data ble behandlet og normalisert (50%) bruker GeneSpring (Agilent, CA). Statistikk og clustering analysene ble utført ved hjelp av GeneSpring programvare. Ekspresjonsnivåene av mirnas ble utsatt for to-veis analyse av varians (ANOVA), for CSC behandlede vs ubehandlede tilstander for de forskjellige cellelinjer.
Ago CLIP (Identifisering av AGO-1-assosiert mRNA)
Cellene ble høstet og CLIP-eksperimenter ble utført ved anvendelse av enten anti-AGO familien eller elF2C antistoffer som beskrevet (28). I korthet ble cellene kryssbundet med bestråling for 400 mJ /cm
2 og ytterligere 200 mJ /cm
2 i Stratalinker, og lysert for å generere RNA /protein (AGO) -komplekser [28] – [30]. Etter pre-clearing, ble 1% av hver prøve lagret som input brøkdel. Immunpresipitasjon ble utført ved hjelp av spesifikke antistoffer mot enten AGO familie (Millipore, Billerica, MA), eller elF2C (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), eller kontrollere IgG. RNA ble isolert og renset fra komplekser, etterfulgt av PCR forsterkning av 3 «UTR fra Mir-31 mål.
Murine xenograft eksperimenter
Calu-6 og H358-celler transfektert med pCDH-CMV-MCS -EF1-copGFP vektorkontroll og pMiR-H31PA-1 ble suspendert i PBS ved en konsentrasjon på 1 x 10
6 celler /100 ul, og inokulert subkutant i kontralaterale flankene av atymiske nakne mus (10 mus per behandlingsgruppe per eksperiment ). Musene ble overvåket to ganger ukentlig, og tumorvolumene ble beregnet på basis av vinkelrette diametre. Omtrent 21 dager og 35 dager senere for Calu-6 og H358-eksperimenter, henholdsvis, mus ble avlivet, og evaluert med hensyn på prosent tumor ta, og massen av skåret xenotransplantater. Deretter tumorvev ble hurtigfrosset i flytende nitrogen, og lagret for senere analyse. Alle dyr prosedyrer ble godkjent av National Cancer Institute Animal Care og bruk komité, og var i samsvar med Guide NIH for omsorg og bruk av forsøksdyr.
Statistical Analysis
Forskjeller mellom matchet prøver fra de samme lungekreftpasienter, slik som tumor og normalt vev ble testet med den signerte-rank test. Gruppene ble sammenlignet med Wilcoxon-Mann-Whitney-testen. Konfidensintervall for forskjellen i median mellom to gruppene ble beregnet ved bias-korrigerte og akselerert bootstrapping metoder. Forskjeller i tumorvolum mellom motstående flankene av tumor-bærende mus ble testet med Wilcoxon-rank test tegnet ved 5 dagers mellomrom.
P
verdiene ble justert for multippel testing av komplett resampling [31]. Konfidensintervall for medianen av flanke forskjeller ble beregnet som eksakte ikke-para to-tailed konfidensintervall basert på Wilcoxon signed-rank test.
Primer Sekvenser
Sendt inn som tabell S1.
Resultater
Up-regulering av MIR-31 i dyrkede celler eksponert for CSC
Foreløpige eksperimenter med array-teknikker ble utført for å undersøke miRNA uttrykk profiler i et panel av normal luft epitel ( SAEC og NHBE), udødeliggjort menneskelige bronkial epitelceller (HBEC) og lungekreft celler (Calu-6, H841, H1299, H1650 og H1975) dyrket i normal media med eller uten CSC. Denne analysen avslørte unike basal miRNA uttrykk profiler sammenfallende med histologi (normal vs ondartet). Videre lungekreft linjer avledet fra røykere (Calu-6, H1299, H841) var lett skiller seg fra de fra ikke-røykere (H1650, H1975) (M. Yang, manuskript under forberedelse).
Av spesiell interesse , nevnte mikromatriseeksperimenter foreslått at CSC behandling indusert uttrykk for MIR-31 i normal luft epithelia samt lunge kreftceller. For videre å undersøke dette fenomen, ble kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) eksperimenter utført for å undersøke MIR-31-ekspresjon i SAEC, HBEC, Calu-6, og H841-celler dyrket i normalt medium (NM) med eller uten CSC i 5 dager . Disse eksperimentene (figur 1A) viste at ubehandlet Calu-6 og H841cells utstilt høyere endogene nivåer av MIR-31 i forhold til SAEC og HBEC celler; ytterligere analyse viste at fem dagers CSC eksponering oppregulert MIR-31 uttrykk 5,5 ganger og 3,6 ganger hos SAEC og HBEC, henholdsvis i forhold til kontrollene. Lignende behandling økt MIR-31 uttrykk 3,1 og 6,5 ganger i Calu-6 og H841 celler, henholdsvis (Figur 1b). Tidsforløpet eksperimenter viste oppregulering av MIR-31 i SAEC og H841 celler i løpet av 24 timer etter start av CSC eksponering, med uttrykk topp og flate ut ca 96 timer senere (figur 1C). Interessant, oppregulering av MIR-31 ved CSC varte i 20 dager etter fjerning av CSC fra kulturmedium (figur 1B).
A) QRT-PCR-analyse av endogent MIR-31 ekspresjon normalisert med kontroll miRNA ( RNU44) i SAEC, HBEC, Calu-6, og H841cells. Basale nivåer av MIR-31 er høyere i lunge kreft i forhold til kultur normale eller udødeliggjort menneskelige luftveis epitelceller. B) QRT-PCR-analyse av MIR-31-ekspresjon i SAEC, HBEC, Calu-6, og H841cells dyrket i normalt medium (NM) med eller uten CSC i 5 dager. Økt MIR-31 uttrykk var tydelig 20 dager etter seponering av CSC behandling. C) QRT-PCR-analyse som viser tidsavhengig aktivering av MIR-31 i SAEC og H841cells dyrket i NM med eller uten CSC i 0, 12, 24, 48, 72, 96 og 120 timer. D) QRT-PCR-analyse viser MIR-31 uttrykk i humane lungekrefttilfellene i forhold til sammenkoblede tilstøtende normale lungevev. MIR-31 nivåer i svulster var høyere enn tilsvarende normal lunge. Videre MIR-31 nivåene var signifikant høyere hos lungekrefttilfellene fra aktive /tidligere røykere sammenlignet med de fra aldri-røykere.
MIR-31 uttrykk i grunnskolen lungekreft prøver
Tilleggs QRT-PCR-eksperimenter ble utført for å undersøke MIR-31 ekspresjonsnivåer i en tilfeldig utvalgt panel av primære ikke-småcellet lungekreft og tilstøtende histologisk normale lunge parenchyma (kliniske og patologiske data oppsummert i tabell 1). Som vist i figur 1D, ble Mir-31 uttrykk høyere (gjennomsnittlig 4,13 ganger; range 1,47 til 12,46 ganger) i lunge kreft i forhold til paret normal lunge vev. Interessant, MIR-31 nivåer i lungekrefttilfellene fra røykerne var høyere enn det som ble observert hos ikke-røykere (5,2 vs 1,65 ganger i henholdsvis; p 0,01). Sammen er disse dataene bekreftet foreløpige eksperimenter som viser høyere nivåer av MIR-31 uttrykk i lungekreftceller i forhold til dyrket normal luft epitel (figur 1A), og foreslo at aktivering av MIR-31 kan være en biologisk relevant fenomen i løpet av menneskelig lunge kreftutvikling.
Effekter av MIR-31 på antagonister av WNT signal
Programvare-guidet analyse viste at flere antagonister av Wnt signal inkludert Dkk-1 [32] og DACT3 [33] var potensial MIR-31 mål. For å bekrefte disse resultatene, SAEC, HBEC, Calu-6, og H841 celler ble transient transfektert med MIR-31. Kvantitativ RT-PCR eksperimenter viste ~12 fold økning i MIR-31 uttrykk i MIR-31-transfekterte celler i forhold til vektor kontroller (figur 2A). Over-ekspresjon av MIR-31 ble redusert DKK-1, så vel som DACT3 (~5-8 fold og ~1.5-7 fold, henholdsvis, i forhold til kontrollene) i disse fire cellelinjer (fig 2B). Disse effektene dukket opp noe mer uttalt i normal SAEC og udødelig HBEC, muligens på grunn av lavere nivåer av endogen MIR-31 og høyere nivåer av Dkk-1 og DACT3 i disse cellene i forhold til Calu-6 og H841 lungekreftceller.
A) MIR-31 var over-uttrykt i SAEC, HBEC, Calu-6, og H841 celler via transient transfeksjon av primære MIR-31 konstruksjoner. QRT-PCR-analyse bekreftet høyt nivå Mir-31 uttrykk i MIR-31-transfektert i forhold til kontrollceller. B) QRT-PCR analyse av Dkk-1 og DACT3 uttrykk nivåer i SAEC, HBEC, Calu-6, og H841 celler med eller uten over-uttrykk for MIR-31. Over-uttrykk for MIR-31 redusert Dkk-1 og DACT3 i alle fire cellelinjer. C) QRT-PCR-analyse demonstrere redusert nivå av endogen MIR-31 i SAEC, HBEC, Calu-6, og H841 celler etter transient transfeksjon av antisense-MIR-31 (Zip-MIR-31) konstruerer i forhold til kontrollene. D) QRT-PCR-analyse av DKK-1 og DACT3 uttrykk nivåer i SAEC, HBEC, Calu-6 og H841-celler med eller uten nedregulering av MIR-31. Knock-down av MIR-31 forbedrer basale nivåer av Dkk-1 og DACT3 i disse cellene. E) QRT-PCR-analyse som viser at knockdown av MIR-31 delvis blokkerer CSC-mediert nedgang på DKK-en og DACT3 i SAEC. F) Western blot analyse av Dkk-1 og DACT3 uttrykk i foreldre og vektor kontroll SAEC og Calu-6 celler, samt SAEC og Calu-6 celler som utviser konstituerende overuttrykk eller slå ned av MIR-31. Densitometry verdier er normalisert til b-aktin kontroll. Dkk-1 og DACT3 nivå ble redusert, eller noe forbedret i disse cellene følgende over-uttrykk, eller knock-down av MIR-31, henholdsvis.
Senere forsøk ble gjennomført for å avgjøre om uttømming av endogen MIR-31 påvirket uttrykk for Dkk-1 og DACT3 i dyrkede luftveis epitelceller. Som vist i figur 2C, ble Mir-31 uttrykk nivåer redusert ~7-10 fold i SAEC, HBEC, Calu-6, og H841 celler transient transfektert med antisense-MIR-31 (Zip-MIR-31) konstruerer forhold til vektor kontroller . Reduksjon av MIR-31 ekspresjon økes DKK-1, så vel som DACT3 ekspresjon i disse cellelinjene (~1.47-8 folde og brette ~4.7-9 henholdsvis figur 2D). Senere forsøk viste at knockdown av MIR-31 betydelig svekkede CSC-mediert reduksjon i Dkk-1 og DACT3 i SAEC samt H841 celler (figur 2E). I samsvar med ovennevnte resultater, western blot analyse viste at DKK-en og DACT3 proteinnivåer i SAEC og Calu-6 celler ble redusert med over-uttrykk for MIR-31 (figur 2F). I kontrast, knock-down av endogen MIR-31 så ut til å øke DKK-en og DACT3 proteinnivået i SAEC og Calu-6 celler, selv om disse endringene ikke korrelerer nettopp med endringer i mRNA uttrykk, muligens på grunn, delvis, til protein stabilitet og antistoff slektskap. Kollektivt, disse eksperimentene sterkt anbefalt at Mir-31 modulerer Dkk-1 og DACT3 via post-transcriptional og translasjonell-hemmende mekanismer i dyrkede normale respiratoriske epitel og lungekreft celler.
Laveste matriser ble brukt for å ytterligere undersøke effekter av MIR-31 på Wnt signal i SAEC og Calu-6 celler. Denne analysen avslørte 7-14 fold nedregulering av Dkk-en, samt ytterligere antagonister av Wnt signal inkludert SFRP1, SFRP4, og WIF1, samt en 5 ganger økning i CTNNB1, TCF7 og Wnt-5a (data tilgjengelig på be om). Påfølgende QRT-PCR eksperimenter bekreftet undertrykkelse av SFRP1, SFRP4, og WIF-en, og opp-regulering av Wnt-5a i SAEC og Calu-6 celler over-uttrykker Mir-31 (figur S1 A). Sammen er disse data tyder på at Mir-31 aktiverer Wnt signal i helstøpt lungekreft og vanlige luftveis epitelceller.
Dkk-1 og DACT3 er direkte mål kandidater fra Mir-31
Flere forsøk ble forpliktet seg til å undersøke om Mir-31 samhandler direkte med 3 «UTR på DKK-en og DACT3. Kort fortalt ble RNA kryss-link immunoutfellingsstudier (CLIP) teknikker brukes til å oppdage samspill av MIR-31 med disse potensielle mål i SAEC celler [28]. Figur 3A viser de potensielle Mir-31 bindingssteder innenfor de 3 «UTR på DKK-en og DACT3 transkripsjoner. RT PCR-analyse viste at AGO familien antistoff utfelt DKK-en og DACT3 transkripsjoner i cytoplasma av ubehandlet SAEC (figur 3B). Åpen økninger i PCR-produkter som tilsvarer 3 «UTR på DKK-en og DACT3 ble observert i SAEC over-uttrykker Mir-31; Dette fenomenet ble ikke observert i MIR-31-utarmet SAEC celler. I disse forsøk β-actin tjente som den negative kontroll, siden ingen sekvenser kan bli målrettet ved å MIR-31 (figur 3B). Fordi MIR-21 har vist seg å direkte rettet mot 3 «UTR av PDCD4 menneskelig vev [34], immunopresipitert RNA fra SAEC celler over-uttrykker Mir-21 fungerte som en positiv kontroll for CLIP (data ikke vist). I samsvar med nevnte Wnt SuperArray resultater, flere CLIP eksperimenter demonstrerte samspill av MIR-31 med SFRP4 (figur S1B).
A) Antatte målse av MIR-31 i Dkk-1 3 «UTR (øverst) og DACT3 3 «UTR (nederst). B) miRNA rettede transkripter i RISC ble utfelt med AGO-familie antistoffer etter UV-indusert tverrbinding av RNA til deres bindingsproteiner, etterfulgt av RT-PCR amplifisering. Over-uttrykk for MIR-31 betydelig økt nedbør på DKK-1 og DACT3 mål transkripsjoner i SAEC celler. β-actin tjente som negativ kontroll siden ingen sekvenser i 3 «UTR som kan målrettes av MIR-31. C) luciferase analysene viser reduksjon i luciferase aktivitet i SAEC transfektert med pMiR-rapport vektorer med eller uten innsetting 3 «UTR eller mutert 3» UTR av Wnt signale antagonister.
Andre eksperimenter ble utført ved hjelp av pMiR- Rapporter vektorer med wt eller muterte 3 «UTR på DKK-en eller DACT3, forbigående ko-transfektert med MIR-31 primære konstruksjoner eller kontroll vektorer i SAEC. Som vist i figur 3C, luciferase-aktivitet av wt 3 «UTR ble på DKK-1 og DACT3 redusert ~70% sammenlignet med vektorkontrollen eller mutert 3» UTR, respektivt. Kollektivt, disse eksperimentene sterkt at Mir-31 samhandler direkte med 3 «UTR på DKK-en og DACT3.
epigenetiske forandringer sammenfallende med CSC-mediert aktivering av MIR-31
Nylig ChIP analyse av distribusjonsmønstre H3K4Me3, H3K9 /14Ac, og H2AZ foreslo at verts genet for MIR-31 er LOC554202 [35]. Som sådan, ytterligere forsøk ble utført for å undersøke om CSC modulert ekspresjon av LOC554202 i SAEC. I overensstemmelse med resultater som angår MIR-31 (figur 1A), 5-dagers CSC behandling induserte ekspresjon av LOC554202, som ble opprettholdt i 20 dager etter fjerning av CSC fra kulturmedium (figur 4A); Disse resultatene var i samsvar med de som er knyttet til CSC-mediert oppregulering av MIR-31 (figur 1). QRT-PCR eksperimenter viste at seks av syv primære lungekreft prøver å uttrykke ≥2 ganger høyere Mir-31 nivåer i forhold til paret normal lunge vev også utstilt over-uttrykk for LOC554202 (figur 4B).
A) RT- PCR-analyse demonstrere oppregulering av ekspresjon i LOC554202 SAEC etter 5 dagers eksponering CSC. I samsvar med data vedrørende oppregulering av MIR-31 ved CSC, ekspresjon av LOC554202 varte i 20 dager etter opphør av CSC eksponering. B) QRT-PCR-analyse viser uttrykket nivåer av LOC554202 i primære lunge kreft i forhold til tilstøtende normale lungevev. C) Skjematisk fremstilling av LOC554202, den antatte verten genet av MIR-31. A, B, C og D representerer posisjonene av parvise primerne anvendt for chip analyse. D) ChIP analyse viser H3K4Me3 og H3K9 /14 acetylering nivåer innen fire regioner i LOC554202 promoter (~ 1 kb, 2 kb, 3 kb, og, 5 kb fra TSS) i SAEC dyrket med eller uten CSC. Økt aktivering merkene ble observert i proksimale promoter regionen etter CSC eksponering.
Sekvensanalyse viste ingen klassiker CpG øy i promoter regionen LOC554202, noe som tyder på at denne verten genet ikke er regulert primært via DNA-metylering mekanismer (data ikke vist). Påfølgende chip eksperimenter vist økte nivåer av H3K4Me3 og H3K9 /14Ac aktiverings merkene i proksimale promoter-regionen (0 til -1,5 k) av LOC554202 (som antagelig inneholder de regulatoriske elementer for MIR-31) i SAEC følgende CSC eksponering (Tall 4C og D ). Interessant, disse aktiveringstegn i LOC554202 promoter-regionen i SAEC var fortsatt til stede 20 dager etter avsluttet CSC behandling. Disse funnene var i samsvar med RT-PCR resultatene vist i Figur 4A.
Rolle C /EBP-β i CSC-mediert aktivering av MIR-31
Andre eksperimenter ble utført for å ytterligere undersøke mekanismer der CSC medierer aktivering av LOC554202. Foreløpige programvare analyse viste ingen karakteristiske XRE sekvenser i løpet av 5 kb fra den antatte transkripsjonsstartsetet (TSS) for LOC554202, noe som tyder på at oppregulering av LOC554202 ved CSC ble ikke formidles primært via aryl-hydrokarbon-reseptor signale [36]. Imidlertid, som vist i figur 5A, denne analyse viste multiple potensielle bindingsseter for C /EBP-β, som har blitt vist tidligere å mediere oppregulering av Bcl-xL i brystcancerceller eksponert for sigarettrøyk [37]. Som sådan, ble ytterligere eksperimenter utført for å fastslå om denne transkripsjonsfaktor bidratt til CSC-mediert aktivering av MIR-31 i kultivert respiratorisk epitel.
