Abstract
Helicobacter pylori (H. pylori)
er en gram-negative, spiralformet bakterie som smitter mer enn halvparten av verdens befolkning, og er en viktig årsak til adenokarsinom i ventrikkel. Mekanismene som lenker
H. pylori
smitte til magekreftutvikling er ikke godt forstått. I den foreliggende undersøkelse rapporterer vi at Raf-kinase inhibitor protein (RKIP) har en rolle i induksjon av apoptose ved
H. pylori
i mage epitelceller. Western blot og luciferase transkripsjon reporter analyser viser at patogenitet øya
H. pylori
fosforylerer hurtig RKIP, som deretter lokaliserer til kjernen hvor den aktiverer sin egen transkripsjon og induserer apoptose. Tvunget overekspresjon av RKIP forbedrer apoptose i
H. pylori
-infected celler, mens RKIP RNA hemming undertrykker induksjon av apoptose av
H. pylori
infeksjon. Mens indusere fosforylering av RKIP,
H. pylori
rettet samtidig ikke-fosforylert RKIP for proteasome-mediert degradering. Økningen i RKIP transkripsjon og fosforylering blir opphevet ved mutere RKIP serin 153 til valin, viser at regulering av RKIP aktivitet ved
H. pylori
er avhengig RKIP sin S153 rester. I tillegg
H. pylori
infeksjon øker uttrykket av sneglen, en transkripsjons repressor av RKIP. Våre resultater tyder på at
H. pylori
benytter en tumor suppressor protein, RKIP, for å fremme apoptose i magekreftceller
Citation. Moen EL, Wen S, Anwar T, Cross-Knorr S, Brilliant K, Birnbaum F et al . (2012) Regulering av RKIP Funksjon av
Helicobacter pylori
i magekreft. PLoS ONE 7 (5): e37819. doi: 10,1371 /journal.pone.0037819
Redaktør: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), USA
mottatt: 30 desember 2011; Godkjent: 24 april 2012; Publisert: May 25, 2012 |
Copyright: © 2012 Moen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health i henhold Award Antall P20GM103421 (DC); den forrige delen av dette prosjektet ble støttet av National Center for Forskning Resources (NCRR) under P20 RR 017695 (DC), R01 CA111533 (SFM) og R21 CA133601 (JMS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde mest diagnostisert kreft i verden. I 2007, omtrent en million nye magekrefttilfeller fører til ca 800 000 dødsfall ble registrert, og er den nest vanligste årsaken til død av kreft [1]. Magekreft er i dag den syvende største årsaken til kreft dødsfall i USA, med om lag 21 500 nye tilfeller diagnostisert i 2011 (https://www.cancer.gov/cancertopics/types/stomach). Den gram-negative, spiralformet bakterie
Helicobacter pylori (H. pylori)
smitter mer enn halvparten av verdens befolkning og har blitt identifisert som en viktig risikofaktor i magekreftutvikling [2]. Verdens helseorganisasjon og International Agency for Research on Cancer utpekt det som en klasse jeg karsinogen i 1994 [3]. Vår nåværende forståelse av
H. pylori
indusert karsinogenese er at bakterien og den tilhørende kroniske inflammatoriske respons fremme gastrisk epitelisk celledød ved apoptose [4], med påfølgende hyper-proliferasjon [5], og fri-radikal produksjon [6] som alle bidrar til en langsom og progressiv sekvens av forandringer i den gastriske slimhinne som til slutt favoriserer progresjon mot kreft. Denne modellen er konsistent med rapporter om at pro-inflammatorisk cytokin genet polymorfismer som øker intensiteten av den inflammatoriske respons er relatert til økt magekreft [7].
H. pylori
følger nøye til mage epitelceller og kan indusere apoptose direkte [8]. CAG (cytotoksiske-forbundet genet) patogenitet øya (CAG PAI) av
H. pylori
er et 40 kB segment av DNA som inneholder gener som koder for komponenter av et type IV bakterie sekresjon system [9]. Innenfor denne regionen er
CagA
genet som koder CagA, en immunodominant protein av 121-145 kDa [9].
H. pylori
stammer med og uttrykker CAG PAI er oftere assosiert med magesår sykdom og magekreft i vestlige populasjoner enn stammer som ikke [9]. Ved dets injeksjon via type IV-sekresjon system i verts gastriske epitelceller, kan CagA senere bli fosforylert av Src-familie-tyrosin-kinaser ved sin C-terminale ende [10], som fører CagA til å binde og aktivere SHP2 og signal via ERK [11]. Viktigere er CagA også ansvarlig for aktivering av signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3)
in vitro Hotell og
in vivo product: [12], selv om dette ikke nødvendigvis være avhengig CagA fosforylering [11]
STAT proteiner er konstitutivt uttrykt i flere svulster, inkludert mage, bryst, hode og nakke, og prostata kreft [13] -. [16]. Ved fosforylering av tyrosin-705-rest og acetylering ved lysin 685, STAT3 dimerizes og går inn i kjernen hvor den fungerer til transkripsjonelt regulere en rekke gener [17], [18]. Konstitutiv aktivering av STAT3 protein har vist seg å forhindre apoptose og økt celleproliferasjon og metastase i en rekke kreftformer, inkludert magekreft [19], [20].
Et av kjennetegnene ved gastrisk tumorprogresjon er erverv av mer invasive og trekk fenotyper under epiteliale-mesenchymale overgang (EMT). Under EMT, mage-epitelceller gjennomgå fenotypiske forandringer kjennetegnet ved tap av celleadhesjonsmolekyler, særlig epiteliale cadherin (E-cadherin) [21]. Den transkripsjonsfaktor snegl, en sink-finger-protein, er blitt karakterisert tidligere som en viktig regulator av EMT på grunn av sin aktivering via nukleær faktor kappa Beta (NF-kB) [22] og etterfølgende undertrykkelse av E-cadherin i epitel-tumorceller [ ,,,0],23], [24]. I tillegg studerer ved hjelp av gain-of-funksjon og tap-av-funksjon tilnærminger har identifisert sneglen som en repressor av RKIP transkripsjon med metastatisk prostata kreft celler [25].
RKIP er medlem av fosfatidyletanolamin-bindende protein familie og en negativ regulator av ERK1 /2 (ekstracellulær Signal-regulert kinase) [26], NF-kB [27] og GRK (G protein-koblet reseptor kinase) [28] trasé. RKIP spiller således en viktig rolle i regulering av celleoverlevelse og apoptose, i tillegg til potensiering av virkningen av kjemoterapeutiske midler [29]. RKIP har også blitt identifisert som en metastase suppressor protein [30], og i adenokarsinom i ventrikkelen finnes det en positiv sammenheng mellom RKIP uttrykk og pasient overlevelse og en invers korrelasjon mellom uttrykk for RKIP og STAT3 [19]. RKIP ekspresjon og funksjon kan reguleres ved post-translasjonelle modifikasjoner. For eksempel, fosforylering av RKIP av proteinkinase C ved serin-153 hindrer RKIP evne til å binde til dets mål-molekyl, og dermed å inaktivere RKIP funksjon [31]. Videre kan RKIP undertrykkelse via promoter metylering overvinnes ved metylering og histondeacetylase hemmere [25].
På grunn av de viktige rollene RKIP, STAT3 og
H. pylori
i patogenesen av magekreft, undersøkte vi om
H. pylori
signaler gjennom RKIP. Våre studier tyder på at et komplekst samspill mellom
H. pylori er cagPAI
, RKIP, STAT3, og virker slik at sneglen dysregulate gastrisk epitelial celle apoptose ved å modulere RKIP funksjon, en mekanisme som definerer en sentral rolle for RKIP i
H. pylori
-associated magekreftutvikling.
Materialer og metoder
Reagenser
Alle reagenser og kjemikalier ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri) med mindre annet er angitt. MG-132 ble innkjøpt fra Calbiochem (Gibbstown, NJ) ble oppløst i DMSO og anvendt i en konsentrasjon på 10 mM. Interleukin-6 (IL-6) ble kjøpt fra BD Biosciences (San Diego, California). Protein kvantifisering reagenser ble oppnådd fra Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). Forbedrede Chemiluminescence reagenser og muse og kanin pepperrotperoksidase-konjugert for Western blot analyse var fra GE Healthcare (Piscataway, NJ). Den aktin-HRP, fosforylert-RKIP (pRKIP) og Stat3 antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biothechnology (Santa Cruz, California). Antistoffene til STAT3 pS727 og pY705 og PARP ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA) og antistoff mot RKIP fra Millipore, Billerica, MA. Antistoffet til sneglen ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, MA).
Cells og Plasmider
Den menneskelige magekreft cellelinje AGS (CRL-1739) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manasas , VA). MKN28 celler ble donert av Dr. Richard Peek, Vanderbilt University, Nashville, TN og ble opprinnelig kjøpt fra Riken Cell Bank, Ibaraki, Japan. Plasmidene av pcDNA3, c-myc STAT3, CMV-HA-RKIP (HA-RKIP) og CMV-HA tom vektor (EV) er blitt beskrevet [18], [26]. Den RKIP S153V plasmid ble gitt av Dr. Marsha Rosner, University of Chicago, Chicago, IL.
H. pylori
Stammer og kultur betingelser
Wild typen
H. pylori
stammer eller isogen
H. pylori
mutanter ble ko-dyrket med AGS eller MKN gastriske cellelinjer som tidligere beskrevet [32] ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 100:1 i alle forsøk, med mindre annet er angitt.
Transfeksjon av AGS Cells
AGS celler ble transient transfektert med GenJet plasmid transfeksjon reagens (Signagen Laboratories, Gaithersburg, MD) i henhold til produsentens protokoll for en seks-brønns plate format. Total DNA-mengder på mellom 1 og 2 ug transfektert per prøve. Transfeksjon forhold ble vurdert og optimalisert ved analyse av celler transfektert med et grønt fluorescerende protein (GFP) -expressing RKIP plasmid. Transfeksjonseffektiviteter var konsekvent i området fra 75-85%.
Protein Extraction og Western blot-analyse
Totale celleekstrakter og subcellulære fraksjoner ble fremstilt og immunoblottet som tidligere beskrevet [29], [32 ]. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved hjelp av BCA Protein Assay (Thermo Scientific). Densitometry av Western blot ble utført i henhold til protokollen oppført på følgende nettsted. https://lukemiller.org/journal/2007/
Realtime PCR
To mikrogram av RNA ble konvertert til cDNA ved hjelp RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Kvantitativ real-time PCR ble utført ved bruk av 2 × Qiagen QuantiFast SYBR Grønn I (Roche). De primere for sneglen var frem: AGCTCTCTGAGGCCAAGGATCT, omvendt: TGTGGCTTCGGATGTGCAT og beta-aktin: fremover: CTGGCACCACACCTTCTACAA, omvendt: CAGCCTGGATAGCAACGTACA. De følgende typiske profiltider som ble brukt var i 40 sykluser: et første trinn ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Den relative Ekspresjonsnivået ble beregnet ved bruk av 2-ΔΔCT metode som tidligere beskrevet [33].
STAT3 og RKIP luciferaserapportørplasmid Analyser
Celler (2 x 10
5 celler /brønn i 6-brønners plater) ble transient transfektert med 0,1 ug (STAT3, RKIP) eller 0,05 ug (NF-kB) av en reporter plasmid inneholdende enten den STAT3 bindingen SIE-fragment av promoter-regionen til mus IRF1 genet (p2xSIE-Luc) eller den RKIP promoter-regionen pluss de angitte plasmidene som tidligere beskrevet [18]. Omtrent 24 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med den angitte medikament eller infisert med
H. pylori
over natten eller venstre ubehandlet. Luciferaseaktiviteten i cytosoliske supernatanten ble evaluert ved bruk av luciferase reporter Assay (Promega) og målt ved anvendelse av et luminometer for å estimere transkripsjonen aktivitet [18].
apoptose Assays
Apoptose ble kvantifisert i separate analyser ved strømningscytometri og DNA-fragmentering ELISA. For strømningscytometri var andelen av apoptotiske celler (sub-G
O) ble bestemt ved strømningscytometrisk analyse av propidiumjodid farget celler [29]. Cytoplasmatiske histon-assosierte DNA-fragmentering ble målt med celledød Detection ELISA Plus kit (Roche, Indianapolis, IN) i henhold til produsentens instruksjoner.
Cytoplasmatiske histon-assosierte DNA-fragmentering ble målt med celledød Detection ELISA Plus kit (Roche, Indianapolis, IN) i henhold til produsentens instruksjoner. Forsøkene ble gjentatt 3 ganger og utført i duplikat.
Lentivirus-mediert knockdown av RKIP
Lentivirus konstruerer.
pLKO.1 puro-motstand lentiviral konstruere RHS3979-97070798 og RHS3979-98492779 ble kjøpt fra Open Biosystems (Huntsville, AL). Konstruksjonene inneholdt puromycin en seleksjonsmarkør og ble dyrket i Luria-medium inneholdende ampicillin ved 37 ° C. Suppen ble sentrifugert ved 10000 x
g
i 10 min. og supernatanten kastes. DNA fra pelletene ble renset ved anvendelse av QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit.
Lentivirus produksjon.
293T emballasje-celler ble sådd ut i lav-antibiotikum vekstmedium (DMEM, 10% varmeinaktivert FBS, 0,1 × Penicillin /Strepomycin /Glutamin). Celler ble inkubert i 24 timer (37 ° C, 5% CO
2), eller inntil de var ca. ~70% sammenflytende. Mediene på 293T emballasje celler ble erstattet med høy vekstmedier som inneholder DMEM. En blanding av transfeksjons-plasmider ble fremstilt som følger: a. Innpakning plasmid (ΔVpr.89), konvolutt plasmid (VSV-G), hårnål-pLKO.1 og tom vektor
Fugene transfeksjon-reagens ble fremstilt i DMEM ifølge til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble de 3 plasmidene tilsatt dråpevis til Fugene og DMEM og blandet. Blandingen ble deretter inkubert i 20-30 min. ved romtemperatur. Transfeksjon blandingen ble deretter forsiktig tilsatt til pakkingscellene. Cellene ble inkubert i tilnærmet 18 timer. Transfeksjonsmetoden media ble deretter kastet påfølgende morgen, og erstattet med høy vekstmedier. Celler ble inkubert i 24 timer. Lentivirus som inneholder media ble høstet containingand ekstra høy vekstmedier til. Celler ble inkubert i 24 timer og mediene høstet. Typisk samlingen var for 2-3 tidspunkter. Alle virus avlinger ble slått sammen.
Lentivirus infeksjon av AGS celler.
AGS celler ble dyrket til ca 50% samløpet. De virale supernatantene ble tilsatt polybrene. Tolv timer etter infeksjon, ble det virale mediet kassert og erstattet med virale media og inkubert i ytterligere 12 timer. Mediene ble forkastet og erstattet med Hams F12 medium. Celler ble inkubert i 24 timer. Cellene ble delt opp i seleksjonsmedium innehold av puromycin og fikk inkubere i 24 timer.
statistiske metoder
Alle cellekultur Forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger, med mindre annet er angitt, og paret t- tester ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans.
Resultater
H. pylori
Infeksjon Øker Fosforylering av RKIP
RKIP hemmer flere celleoverlevelses veier, inkludert de mediert gjennom NF-kB og Jak /STAT [22]. For å belyse effekten av
H. pylori
infeksjon på RKIP i mage celler, ble AGS celler infisert med
H. pylori Hotell og høstet 2 timer og 6 timer senere. Som vist på fig. 1A, ble nivåer av fosforylert RKIP (pRKIP) forhøyet etter 2 h (3,126 ganger) og 6 h (2,9-fold) etter
H. pylori
infeksjon mens total RKIP protein uttrykk økt 1,4 ganger etter 2 timer og 1,75 ganger etter 6 timer på
H. pylori
infeksjon. Lignende resultater ble også oppnådd med MKN magecancerceller (se figur S1).
(A) Western blot-analyse av AGS-celler ko-dyrket med
H. pylori product: (HP) på MOI av 100:1 for 2 og 6 timer og undersøkt for pRKIP, RKIP, og aktin uttrykk. Tetthetsmåling ble utført på tre uavhengige eksperimenter og båndintensitetene som er normalisert i forhold til Actin for hvert tidspunkt. Våre resultater viste en 3,126 ganger økning (gjennomsnittlig intensitet 0,44 vs 1,376) av pRKIP etter 2 timer og 1,384 ganger økning (gjennomsnittlig intensitet 0,6774 vs 0,938) av RKIP etter 2 h
H. pylori
infeksjon. (B) AGS-celler ko-dyrket i 6 timer i nærvær eller fravær av den PKC-inhibitoren Bisindolylmaleimide (Bis), ble undersøkt for ekspresjon av pRKIP, ble RKIP og actin.All behandlinger utført i 1% DMSO som vehikkelkontroll ( bis).
H. pylori
indusert fosforylering av RKIP er PKC-avhengig
fosforylering av RKIP på serin 153 av protein kinase C (PKC) opphever dens evne til å binde til Raf og inhibere nedstrøms MAP kinase signalering [31]. Vi undersøkte om fosforylering av RKIP av
H. pylori
var PKC avhengig. AGS celler ble infisert med
H. pylori
i 6 timer, i nærvær eller fravær av 40 pM Bisindolylmaleimide (Bis, en PKC-inhibitor). Våre resultater tyder på at nivået av fosforylert RKIP ble hemmet 3,9-fold og RKIP 1,36 ganger etter
H. pylori
infeksjon i nærvær av PKC-inhibitoren, noe som tyder på at fosforylering av RKIP
H. pylori
innebærer, men kan ikke være helt avhengig av, den PKC-regulert vei (Fig. 1B).
IL-6 induserer fosforylering av RKIP og
H. pylori-
aktiverer STAT3
Siden det er en invers sammenheng mellom RKIP og STAT3 uttrykk i magekreftprøver [19], evaluert vi enten STAT3 og styrings regulator IL-6 [17] påvirker pRKIP uttrykk. IL-6-behandling med en dose på 25 eller 50 ng /ml økte nivåer av pRKIP protein 1,8 og 1,35 ganger i henholdsvis og total RKIP proteinekspresjon nedsatt 0,8 og økt 1,05 ganger i henholdsvis (figur 2A.). Fosforyleringen av RKIP i respons til IL-6 ble PKC-avhengig (data ikke vist). Disse data indikerer at IL-6 kan også indusere fosforylering av RKIP i mage-celler som kan oppstå, delvis til en PKC-avhengig reaksjonsvei.
(A) Western blot-analyse av AGS celler behandlet med de angitte konsentrasjoner av IL-6 og i 6 timer. Tetthetsmåling ble utført og for pRKIP ekspresjon, Våre resultater tyder på en 1,8 gangers incerase av pRKIP (gjennomsnittlig intensitet 0,59 vs 1,051) i celler behandlet med 25 ng /ml IL-6 og en 1,35 gangers økning (gjennomsnittlig intensitet 0,59 vs 0,772) i celler behandlet med 50 ng /ml IL-6. For RKIP ekspresjon, Våre resultater tyder på en 0,8 gangers incerase av pRKIP (gjennomsnittlig intensitet 0,69 vs 0,563) i celler behandlet med 25 ng /ml IL-6 og en 1,05 gangers økning (gjennomsnittlig intensitet 0,69 vs 0,745) i celler behandlet med 50 ng /ml IL-6 når normalisert til aktin ved hvert tidspunkt. (B) Western blot analyse av AGS co-dyrket med
H. pylori Hotell og undersøkt for pY705 STAT3 i de angitte tidsrom; (C) STAT3 luciferase reporter transcriptional analysen av AGS celler co-dyrket med
H. pylori
på indikerte MOI; (D) STAT3 luciferase reporter analysen av AGS celler transient transfektert med STAT3 i 24 timer og co-dyrket med
H. pylori
og /eller behandlet med IL-6 i 6 timer. En paret t-test ble utført for å analysere økningen eller reduksjonen i STAT3 transkripsjon av eksperimentelle prøver sammenlignet med tom vektor (EV): * IL-6, s 0,0003; ** STAT3, p 0,009; ***
H. pylori
p 0,0005; **** STAT3 og
H. pylori
p. 0.0000023
makrofager utslipp cytokiner, inkludert IL-6 under
H. pylori-infeksjon
[34] som fører til aktivering STAT3 [17]. For å undersøke effekten av
H. pylori
infeksjon på aktivering av STAT3 ble AGS celler transient transfektert med en IRF-en reporter konstruere [18] og co-kultivert med
H. pylori
ved den angitte rekke multiplisitet av infeksjon (MOI) i 24 timer. Våre resultater viste at ved en MOI mellom 10-200:1,
H. pylori
var i stand til å indusere transkripsjon STAT3 (fig. 2C) og STAT3 pY705 fosforylering (fig. 2B) i løpet av 6 timer etter infeksjon. Vi neste fastslått om IL-6 kan også stimulere STAT3 transkripsjon i AGS celler. AGS-celler ble transient transfektert med IRF-1 og med EV og eller c-myc-merket STAT3 og deretter etter 24 timer celler behandlet med enten IL-6 (50 ng /ml) eller ko-dyrket med
H. pylori
på MOI av 100:1. Resultatene, vist på fig. 2D, viser at IL-6 (p 0,0003) og
H. pylori product: (p 0,0005) ble hver stand til å betydelig stimulere STAT3 transkripsjon, en effekt som ble forsterket da AGS celler ble transfektert med STAT3 og infisert med
H. pylori product: (p 0,0000023). Forbedring av STAT3 Aktiveringen ble signifikant øket når AGS-celler ble ko-behandlet med IL-6 og
H. pylori
sammenlignet med behandling med IL-6 (p 0,000028) eller
H. pylori product: (p 0,0003). alene
Fosforylert RKIP induserer sin egen transkripsjon
Vi brukte en RKIP luciferase reporter analysen for å undersøke effektene av
H. pylori
infeksjon på RKIP transkripsjonen aktivitet.
H. pylori
betydelig økt RKIP transkripsjon (p 0,002) med en større enn 10-dobling oppstår med RKIP overekspresjon og større enn 16 ganger økning med kombinasjonen av
H. pylori
og RKIP (p 0,0003) (figur 3A.) sammenlignet med ubehandlede AGS-celler transfektert med tom vektor. Det var en betydelig økning (p 0,0001) i RKIP transkripsjon med
H. pylori-infeksjon og
RKIP overekspresjon når sammenlignet med celler transfektert med RKIP uten infeksjon (fig. 3A). Vi gjentok disse forsøk, i nærvær av Bis for å hemme PKC-aktivitet for å bestemme økningen i RKIP transkripsjon var på grunn av fosforylering. I nærvær av den PKC-inhibitoren,
H. pylori
økt RKIP transkripsjon og RKIP overekspresjon også resulterte i forbedring av RKIP promoter aktivitet. Bis redusert RKIP transkripsjon indusert av RKIP overekspresjon og
H. pylori-infeksjon
større enn 4 ganger, sammenlignet med celler i RKIP med overekspresjon og antyder at disse effektene var avhengig RKIP fosforylering (fig. 3A). Vi undersøkte lokalisering av RKIP etter
H. pylori
infeksjon. Immunoblotting subcellulære fraksjoner AGS celler demonstrerte at pRKIP er lokalisert til kjernen, mens RKIP forblir hovedsakelig i cytosol etter infeksjon (fig. 3B). Sammen utgjør disse dataene antyder at
H. pylori
kan fremme translokasjon av pRKIP inn i kjernen, hvor det kan aktivere transkripsjon RKIP.
(A) RKIP transkripsjon reporter analysen av AGS-celler forbigående transfektert med luciferase RKIP konstruksjon og HA-RKIP i 24 timer, da co-dyrket med
H. pylori
i 12 timer i nærvær eller fravær av den PKC-inhibitor. Sammenlignet med tom vektorkontroll ble det relative transkripsjonen aktivitet signifikant økt for *
H. pylori
, p 0,002; og **
H. pylori
+ RKIP, P 0,0003. Sammenligning av tap av relativ luciferaseaktivitet av
H. pylori Hotell og RKIP sammenlignet med
H. pylori
, RKIP og Bis, p 0,0004. Data representerer middelverdi +/- standardavvik (SD) av de gangers økning i forhold til tom vektorkontroll i 2 uavhengige eksperimenter utført i duplikat. (B) Western blot analyse av kjernefysiske og cytosoliske fraksjoner av AGS celler co-dyrket med
H. pylori
i 4 timer for ekspresjon av pRKIP og total RKIP. Actin og lamina gi verifisering av vellykkede cytoplasma og kjernefysisk brøkdel separasjon.
H. pylori
indusert RKIP Fosforylering Avhenger
H. pylori er CAG
patogenitet Island og RKIP Serine 153
For å vurdere rollen til spesifikke
H. pylori
faktorer i fosforylering av RKIP, villtype
H. pylori Hotell og isogene mutanter mangler hele CAG
PAI eller
oipA
genet var co-dyrket med AGS celler i 6 timer.
H. pylori
mutant mangler CAG
PAI
var ute av stand til å indusere RKIP fosforylering, mens villtype flekken og
oipA
mutant sterkt indusert RKIP fosforylering (fig. 4A). Den samme tendensen ble observert på STAT3 pY705. Disse resultatene tyder på at gener innenfor
H. pylori er
cagPAI er nødvendig for induksjon av RKIP og STAT3 fosforylering.
Western blot analyse av (A) AGS celler co-dyrket med
H. pylori
stammer for 6 timer og undersøkt for de angitte proteiner. C = kontroll (infisert), WT = AGS celler infisert med villtype
H. pylori
for 6 timer
PAI Y – og
oipA Anmeldelser – representerer isogene mutanter mangler disse genene. (B) AGS celler transient transfektert i 24 timer med RKIP S153 cDNA eller 24 timer og co-kultivert med
H. pylori
i 6 timer. (C) RKIP luciferase reporter-analyse av AGS-celler transient transfektert med S153V RKIP i nærvær eller fravær av
H. pylori
infeksjon. Sammenlignet med tom vektorkontroll, ble den relative aktivitet av RKIP transkripsjon økes ved: *
H. pylori
, p 0,002; ** RKIP, p 0,002; *** S153V, p 0,03, ****
H. pylori Hotell og RKIP, p 0,0005; *****
H. pylori Hotell og S153V, p 0,003. **, RKIP transkripsjonen aktivitet ble betydelig redusert med den S153V sammenlignet med villtypen RKIP konstruere som reaksjon på
H. pylori, #
, p 0,0003. Dataene representerer gjennomsnittet +/- SD av 2 uavhengige eksperimenter utført i duplikat.
For å undersøke om mutasjon av serin 153 påvirker
H. pylori
formidlet RKIP fosforylering og transkripsjonen aktivering, AGS celler ble transient transfektert med en RKIP konstruere der serin ble byttet ut med valin i posisjon 153 (S153V) og deretter co-dyrket med
H. pylori
. Nok en gang vi observert en større enn 16 ganger økning i RKIP promoter aktivitet i celler med RKIP overekspresjon og
H. pylori
infeksjon (p 0,0005). Men i celler transfektert med RKIP S153V før
H. pylori
infeksjon, var det en 2,5 ganger reduksjon i transkripsjonen aktivitet (p 0,0003) sammenlignet med
H. pylori
infeksjon i villtype RKIP overekspresjon celler (fig. 4C). I tillegg overekspresjon av S153V RKIP hemmet
H. pylori
formidlet RKIP fosforylering (Fig. 4B). Tatt sammen indikerer disse resultatene at fosforylering og transkripsjonelle aktivering av RKIP er avhengig
H. pylori er
cagPAI og også på fosforylering av RKIP på S153.
H. pylori
infeksjon resulterer i RKIP Nedbrytning og Induksjon av Snail
Fordi økt RKIP transkripsjon indusert av
H. pylori
infeksjon ble ikke assosiert med økt steady state total RKIP protein uttrykk, undersøkte vi om
H. pylori
kan samtidig øke nedbrytningshastigheten av RKIP protein gjennom proteasom-mediert degradering, som tidligere er foreslått [35]. MG132 økte RKIP proteinnivåer i nærvær eller fravær av
H. pylori
infeksjon, i samsvar med
H. pylori
økende proteasomal RKIP degradering (Fig. 5A).
AGS celler (A) behandlet med MG132 og undersøkt for de angitte proteinene via Western blot analyse. V betegner bærer (DMSO) kontroll. (B, C) Celler ble ko-dyrket med
H. pylori
for de angitte tider og undersøkt for ekspresjon av Snail eller (D) målt for sneglen mRNA ved real-time PCR på de angitte ganger etter
H. pylori
infeksjon.
En annen mekanisme som kan forklare den manglende endring i RKIP protein eller mRNA uttrykk ville være transcriptional undertrykkelse av RKIP etter
H. pylori
infeksjon. Sneglen er en transkripsjonsfaktor som spiller en viktig rolle i EMT [23] samt å være et kjent transcriptional repressor av RKIP i prostatakreftceller [25]. For å undersøke effekten av
H. pylori
infeksjon på uttrykk for sneglen og RKIP, AGS celler ble dyrket med
H. pylori
ved en MOI på 100. Snail mRNA uttrykk ble sterkt indusert etter 2-4 timer for infeksjon (Fig. 5D) Western blot analyse viste at
H. pylori
infeksjon resulterte i en tid og doseavhengig økning i sneglen protein nivåer (Fig. 5B /C). Dette resultatet er ikke forenlig med våre data på RKIP transkripsjon etter
H. pylori
infeksjon (Fig. 3) og antyder at
H. pylori-infeksjon
kan ved induksjon av protein (er) som kan oppheve virkningen av sneglen på RKIP transkripsjon. Vi undersøker denne muligheten ved Mass spectometry analyse ved hjelp av foreldre og RKIP knockdown celler (Fig. 6).
(A) Western blot analyse av AGS transient transfektert med RKIP i 24 timer og deretter smittet med
H . pylori
i 6 timer. Densitometry analyse for gjennomsnittet av 2 uavhengige eksperimenter indikerte en 1,53 ganger økning i apoptose (middels intensitet på 0,19 vs 0,295) i
H. pylori
infiserte celler; 2,1 ganger økning (gjennomsnittlig intensitet på 0,19 vs 0,403) i celler transfektert med RKIP; en 2,6 ganger økning (gjennomsnittlig intensitet på 0,19 vs 0,495) i celler infisert med
H. pylori
og transient transfektert med RKIP når normalisert til aktin. Parallelt Apoptose ble målt ved (B) flowcytometri. C) En ELISA-basert DNA-fragmentering analyse ble anvendt for å måle apoptose. Sammenlignet med tom vektor kontroll i (B) apoptose ble økt med
* H. pylori
, p 0,0008; ** RKIP, p 0,003; ***
H. pylori Hotell og RKIP, p 0,0005. I (C) sammenlignet med tomme vektor kontroller, ble apoptose betydelig økt etter: *
H. pylori
, p 0.000063; ** RKIP, p 0,006;
*** H. pylori Hotell og RKIP, p 0,0007. Dataene for B og C representerer den midlere +/- SD av 2 uavhengige eksperimenter utført i duplikat. (D) Western blot analyse av AGS celler infisert med Lentivirus å slå ned RKIP uttrykk før 6 timer infeksjon med
H. pylori
. CTR = uinfiserte AGS celler, HP = AGS celler infisert med
H. pylori
, KD = AGS celler infisert med lentivirus til knockdown RKIP, KD + RKIP AGS celler infisert med lentivirus til knockdown RKIP og infisert med
H. pylori
i 16 timer. (E) Apoptose (ved DNA-fragmentering ELISA) ble målt etter 16 h fra
H. pylori
infeksjon. Apoptose ble betydelig økt med
H. pylori
i AGS celler * p 0,0007; og i AGS celler med RKIP knockdown, ** p 0,003 og ble redusert sammenlikne
H. pylori
-infected RKIP knockdown AGS celler med
H. pylori
-infected foreldre AGS celler, # p 0,0006. Dataene som vises representerer gjennomsnittet +/- SD av 2 eksperimenter utført i tre eksemplarer.
RKIP Forbedrer
H. pylori
formidlet apoptose
H. pylori
induserer gastrisk epitelial celle apoptose [8]. Siden RKIP kan fremme apoptose [29], undersøkte vi om induksjon av pRKIP etter
H. Som vist på fig.
