Abstract
Å bryte balansen mellom spredning og differensiering i dyreceller kan føre til kreft, men mekanismene opprett denne balansen fortsatt i stor grad udefinert. Kalsium aktivert klorid kanal A1 (CLCA1) er et medlem av kalsium sensitive klorid ledningsevne familie av proteiner og uttrykkes hovedsakelig i tykktarmen, tynntarmen og vedlegg. Vi viser at CLCA1 spiller en funksjonell rolle i differensiering og proliferasjon av Caco-2-celler og av tarmvevet. Caco-2-celler spontant skille enten i sammenflytende kultur eller når de ble behandlet med butyrat, et molekyl til stede naturlig i dietten. Her har vi sammenlignet CLCA1 uttrykks nivåer mellom pasienter med og uten kolorektal kreft (CRC) og bestemmes den funksjonelle rolle av CLCA1 i differensiering og proliferasjon av Caco-2-celler. Vi viste at: 1) CLCA1 og CLCA4 uttrykk ble nedregulert betydelig i CRC pasienter; 2) CLCA1 ekspresjon ble oppregulert i Caco-2-celler indusert til å differensiere ved sammenflytende kultur eller ved behandling med natrium-butyrat (NaBT); 3) knockdown av CLCA1 med siRNA signifikant hemmet celledifferensiering og celleproliferasjon fremmet i Caco-2 konfluerende kulturer, og 4) I Caco-2 3D-kultur, undertrykkelse av CLCA1 betydelig økt celleproliferasjon og kompromittert NaBT-indusert hemming av proliferasjon. Som konklusjon kan CLCA1 bidra til å fremme spontan differensiering og redusere proliferasjon av Caco-2 celler, og kan være et mål for NaBT-indusert hemming av proliferasjon og derfor en potensiell diagnostisk markør for CRC prognose
relasjon:. Yang B Cao L, Liu B, McCaig CD, Pu J (2013) Overgangen fra spredning til differensiering i tykktarmskreft er regulert av kalsium Aktivert Chloride Channel A1. PLoS ONE 8 (4): e60861. doi: 10,1371 /journal.pone.0060861
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan
mottatt: 14 desember 2012; Godkjent: 03.03.2013; Publisert: 12. april 2013
Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av NHS Endowment Fund (12/50) til LC, JP og CDM, og venner av Anchor til JP og CDM. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
I pattedyr tarmen enterocyttene fornyes kontinuerlig hver 4-8 dager. Dette skjer gjennom en koordinert serie av hendelser som involverer spredning, differensiering, og migrasjon fra tarm krypter oppover mot lumen [1]. Forstyrrelse av balansen mellom celledeling og differensiering kan føre til sykdomstilstander som kreft [2]. Endringer i tett regulert balanse mellom de svært proliferative /mindre differensierte enterocytes og ikke-proliferative /svært differensiert tilstand kan føre til hyperplasi, godartede (polypper) eller ondartede svulster [3]. Wnt signalveien er den primære mekanismen kontrollere spredning av enterocyttene i tarm krypter [4].
ionekanaler bidra til tumorer ved å regulere de grunnleggende cellulære prosesser av proliferasjon, differensiering og apoptose [5]. For eksempel er KCNK9 (kaliumkanal-underfamilien K elementet 9) overuttrykt og bidrar til tumorgenese ved å fremme kreftcelleoverlevelse i brystkreft [6]. GIRK1 (G-protein innvendig he kalium kanal 1) uttrykk økt i 50/72 ikke-småcellet lungekreft pasienter og tilstedeværelsen av denne mRNA var forbundet med betydelig redusert fem-års overlevelse [7]. I tillegg TRPM8 kanal proteinet (Transient reseptor potensiell kationet kanal-underfamilien M medlem 8) en prostata-spesifikk markør var oppregulert i tumorvevet [8]. Studier som beskriver forekomsten av de enkelte ionekanaler i tumorceller og deres funksjonelle konsekvenser for vekst, migrering, eller invasjon øker [9].
I tykktarmen, klorkanaler (CLCs) danner en stor familie med funksjonell strukturelt forskjellige medlemmer som spiller en viktig rolle i reguleringen av epiteliale væske og elektrolytt transport [10]. Aktivering av kloridet strøm gjennom spesialvolum-regulerte anion kanaler (VRACs) i respons til cellesvelling (I
Cl, svelle) er en av de viktigste mekanismer ved hvilke celler gjenopprette deres volum følgende hypo-osmotisk stress (RVD) [ ,,,0],11]. Dette er viktig fordi det er en direkte kobling mellom apoptotisk Resistens med antiapoptotic BCL-2 protein og styrking av RVD evne skyldes oppregulering av I
Cl, hovne [12]. I tillegg er det klorid kanal 3 (CLC3) protein blant prostata-spesifikke VRACs og er oppregulert i androgen-uavhengig prostatacancerceller [13]. Kalsium-aktiverte klorid kanaler (CLCAs) også kommer til uttrykk i bovin [14], mus [15] og human [16] enterocytter og det er en invers korrelasjon mellom nivåene av klorid kanal (CLCA1 og CLCA2) ekspresjon og tumorigenisitet, noe som indikerer at de fungerer som undertrykkere av brystkreft og tykktarmskreft [17], [18], [19]. Imidlertid gjenstår det detaljerte biologiske funksjon av CLCAs som skal bestemmes. Derfor, undersøkte vi hvorvidt CLCA1 bidrar til tumorgenese ved å regulere balansen mellom proliferasjon og differensiering i enterocyttene.
human intestinal kreft cellelinje Caco-2 er en veletablert modell system for å studere cellulær differensiering av humane enterocytter siden det skiller spontant inn i polariserte celler med morfologiske og biokjemiske funksjoner i tynntarms enterocytes [20]. I tillegg, Caco-2-cellene også differensiere når de utsettes for det fysiologisk relevante kortkjedet fettsyre, butyrat [19]. Kortkjedede fettsyrer (SCFA), hovedsakelig butyrat, propionat og acetat, er produsert i tarmen gjennom fermenteringen av kostfiber ved kolonfloraen [21]. Butyrat i særdeleshet er den foretrukne energikilde for cellene i tarmslimhinnen og utøver forskjellige biologiske virkninger på dyrkede pattedyrceller, inkludert hemming av celleproliferasjon, apoptose og induksjon av differensiering [22], [23]. På grunn av dette har sin terapeutiske potensial i tykktarmskreft foreslått [23]. Caco-2 celler, når dyrket som en konfluent monolag eller utsatt for natriumbutyrat (NaBT) behandling, differensiere å etterligne fenotypisk og funksjonelt modne kolonepitelet og er en nyttig modell for å undersøke de molekylære mekanismene for differensiering i barnekonvensjonen. Her viser vi at CLCA1 (Calcium-aktiverte klorid kanal familiemedlem 1) spiller en funksjonell rolle i regulering av differensiering og spredning av Caco-2 celler.
Resultater
nedregulering av CLCA1 Expression i tykktarmskreft (CRC) Pasienter
Først undersøkte vi uttrykket nivå i mennesker av klorid kanaler i normale og tumorvev ved hjelp av microarray database med NCBI (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov /geo /). Uttrykket nivåer av CLCN2, CLCN3, CLCA1, CLCA4 og CFTR i tidlig CRC pasient ble betydelig redusert 31%, 59%, 74%, 41% og 58% sammenlignet med normal tarmslimhinnen (Fig. 1a). For ytterligere å bekrefte at nedregulering av CLCA1 i CRC pasienter, brukte vi immunofluorescerende farging for å påvise CLCA1 ekspresjon i både CRC og normale tarmvevet, og funnet å uttrykke CLCA1 betydelig redusert i CRC-intestinale vev (Fig. 1B). En av funksjonene i tumorigenesis er den høye spredning /lav differensiering rate av celler. Kanskje CLCA1 bidrar til tumorigenesis ved å regulere balansen mellom spredning og differensiering i enterocytes.
A. Normaliserte rå uttrykk verdier av klorid kanal familiemedlemmer ble analysert i menneskets tarmslimhinnen og tidlige CRC vev fra Gene Expression Omnibus (referanseserie er GSE4017). CLCA1, CLCA4, CLCN2, CLCN3 og CFTR ble nedregulert betydelig i tidlige pasienter CRC. Verdier er gjennomsnitt verdier ± S.E.M., *
p
0,01. B. Analyse av immunfluorescens viste at ekspresjon av CLCA1 ble redusert i CRC vev i motsetning til normal tarmslimhinnen. Bar = 50 mikrometer.
Up-regulering av CLCA1 indusert av natriumbutyrat i Caco-2 celler
En pro-differensierende effekten av natrium butyrate (NaBT) har blitt studert inngå forskjellige ondartede cellelinjer [24], [25]. Vi analyserte Ca
2 + -avhengige klorid kanal uttrykk mønstre i Caco-2 celler ved hjelp av kvantitativ RT-PCR-analyse (qPCR). Vi fant at uttrykket nivåer av CLCA1 og CLCA3 ble oppregulert 35 ganger og over 100 ganger etter henholdsvis 2 mM NaBT behandling for (2A Fig.) 24 timer. Western blot i tillegg viste at CLCA1 protein økningen var tidsavhengig. Når Caco-2-celler ble behandlet med NaBT i 24 timer, ble CLCA1 uttrykk oppregulert i betydelig grad sammenlignet med ingen behandling gruppen (fig. 2B). Men det var lite eller ingen ekspresjon av CLCA1 følgende kortere eksponering (8 og 12 timer behandlinger, fig. 2B). Ekspresjon av CLCA1 i monolag som ikke var behandlet med NaBT viste også en signifikant økning i 24 timer (sammenlignet med 8 og 12 timer kulturer) på grunn av den spontane differensiering av Caco-2-celler i konfluerende kulturer (fig. 2B). NaBT også forhøyet ekspresjon av intestinal alkalisk fosfatase (ALPI) og β-catenin i Caco-2-celler (Fig. 2C). Begge er markører for enterocyte differensiering og oppregulert i differensierte celler. Våre data tyder på at CLCA1 kan megle celledifferensiering indusert av konfluent kultur og ved NaBT i Caco-2 celler.
A. MRNA-ekspresjon av CLCA1, A2, A3 og A4 ble målt ved hjelp av kvantitativ RT-PCR. CLCA1 og CLCA3 ble oppregulert på henholdsvis i Caco-2-celler etter behandling med 2 mM NaBT i 24 timer. Data er presentert som gjennomsnitt verdier ± S.E.M. fra tre uavhengige eksperimenter, *
p
0,01. B. Caco-2 enkeltlag ble dyrket i forskjellige tidsperioder med /uten 2 mM NaBT behandling. Uttrykk for CLCA1 ble oppdaget av western blot. I 8 og 12 timer konfluent kultur, verken kontroll eller NaBT økt uttrykk for CLCA1. Når Caco-2-monolag dyrket i 24 timer, både kontroll og NaBT oppregulert CLCA1 uttrykk, men NaBT forsterket CLCA1 ekspresjon mye mer enn det som ble sett i kontrollene. C. NaBT forhøyet ALPI og β-catenin uttrykk (differensiering markører) i løpende kulturer av Caco-2 celler. Histogrammene i B og C viser den relative intensiteten til CLCA1 90 KD, ALPI og β-catenin uttrykt som et forhold i forhold til GAPDH kontroll. Alle resultatene var fra tre uavhengige eksperimenter.
CLCA1 er oppregulert på et tidlig tidspunkt i løpet av Spontan Differensiering av Caco-2 celler i Confluent Kultur
Kultur til samløpet induserer spontan differensiering av Caco -2-celler [19], [24], [25], [26]. Ved hjelp av denne modellen, spurte vi om CLCA1 bidratt til differensiering av Caco-2 celler. Det første vi oppdaget uttrykk for CLCA1 og to differensiering markører ALPI og sukrase-isomaltase (SI) i konfluent kultur. Vi har funnet at ekspresjonen av CLCA1 (inkludert de to forskjellige celleoverflatetilknyttet subenheter 38 KD og 90 KD [16]) ble påvist ved meget lave nivåer ved begynnelsen av kulturen. Men som kulturer ble sammenflytende, begynte CLCA1 uttrykk til å øke i en tidsavhengig måte. Denne økningen i ekspresjon var tydelig i løpet av en dag (Fig. 3A, 3B). Uttrykk for ALPI og SI viste også en betydelig tidsavhengig oppregulering, men dette skjedde ikke før dag fire, senest for CLCA1 uttrykk (Fig. 3C, 3D). I tillegg har vi oppdaget også ekspresjonen av β-catenin på forskjellige dager med Caco-2 cellesammenflytende kultur. Vi fant at den β-catenin økte noe i Caco-2 sammenflytende monolag (fig. 3E). Subcellulære fraksjoneringsstudier viste at økningen av β-catenin skyldtes en økning i membranfraksjonen av β-catenin, mens cytosoliske nivåer forble uendret (fig. 4B) [27]. Disse dataene tyder på at ekspresjon av CLCA1 kan bidra til spontan differensiering av Caco-2-celler.
A og B. Ekspresjon av CLCA1 subenheter (38 KD og 90 KD) ble oppregulert etter 24 timers av sammenflytende kultur og nådde en topp ved 10 dagers dyrking. C. ALPI som en markør av Caco-2-celledifferensiering ble oppregulert signifikant etter 4 dager med sammenflytende kultur. D. Ekspresjon av sukraseisomaltase-(SI), en annen celledifferensiering markør, ble også øket betydelig etter 4 dager med sammenflytende kultur. E. Ekspresjon av β-catenin ble forbedret litt over tid i kultur. Histogrammene i A til E viser den relative intensiteten til CLCA1, ALPI, SI og β-catenin uttrykt som et forhold i forhold til GAPDH kontroll. Alle resultater ble analysert fra tre uavhengige eksperimenter.
A. Caco-2-celler ble transfektert transient med 0, 50, 100, 150 og nM siRNA
clca1 200 og blottet for CLCA1. siRNA
clca1 på 100 nM eller ovenfor effektivt hemmet CLCA1 og downregulated uttrykk for ALPI og β-catenin. B. Immunofluorescent farging viste ekspresjon av β-catenin i konfluerende kulturer av Caco-2-celler. β-catenin ble plassert hovedsakelig i kjernen av cellene ved tidlige stadier av kulturen (2 dager). Etter 10 dagers dyrking, hadde β-catenin translokert til cellemembranen. Knockdown av CLCA1 redusert fordeling av β-catenin på membranen. C. Caco-2-celler ble behandlet med enten siRNA negativ kontroll eller siRNA
clca1 og deretter ble dyrket i 72 timer. Cellelysater ble samlet for påvisning av ALP aktivitet ved hjelp av alkalisk fosfatase Detection Kit eller for ALP uttrykk ved western blot. Resultatet viser at både ALP aktivitet og ekspresjon ble betydelig redusert i CLCA1 knockdown-celler. Histogrammene i A viser den relative intensiteten av CLCA1 38 KD, 90 KD, ALPI og β-catenin uttrykt som et forhold i forhold til GAPDH kontroll. Alle resultatene var fra tre uavhengige eksperimenter. **
p
. 0,01
CLCA1 er nødvendig for Spontan Differensiering av Caco-2 celler
For å bestemme den funksjonelle rollen CLCA1 i Caco-2 celledifferensiering, brukte vi et skjult kort-interfering RNA (siRNA
clca1) for å slå ned et uttrykk for cLCA1 i Caco-2 celler. Etter 72 timers transfeksjon, ble cellene undersøkt for ekspresjon av CLCA1, ALPI og β-catenin ved western blot (Fig. 4A). Våre data viser at CLCA1 ekspresjon ble nedregulert på en doseavhengig måte i respons til økende konsentrasjoner av transfeksjon siRNA
clca1. For å unngå off-target effekter ved høyere konsentrasjon av siRNA, valgte vi 100 nM siRNA
clca1 som en optimal konsentrasjon for etterfølgende eksperimenter.
ALPI og β-catenin uttrykk ble redusert betydelig på CLCA1 knockdown. Videre konfokal avbildning viste en redusert cellemembran farging av β-catenin i siRNA
clca1 knockdown-celler (Fig. 4B). For å bekrefte pro-differensiering rolle CLCA1 i Caco-2 celler videre, vi har oppdaget ALP aktivitet ved hjelp av en celledifferensiering deteksjon kit i Caco-2 celler. Våre data viser at ALP-aktivitet ble inhibert signifikant på CLCA1 knockdown-celler (fig. 4C). Resultatene indikerte at CLCA1 spiller en sentral rolle i reguleringen av spontan differensiering av Caco-2 celler.
CLCA1 Spiller en anti-proliferativ rolle i Caco-2 celler
antiproliferative effekt av NaBT har blitt studert inngå i forskjellige ondartede cellelinjer [25]. For å verifisere om CLCA1 presenterte en anti-proliferativ effekt på Caco-2 celler, dyrket vi celler i 3D Matrigel i 5 dager for å danne kolonier. Vi fant at den gjennomsnittlige kolonistørrelse i Caco-2 celler CLCA1KD økte signifikant sammenlignet med vill-type-celler (p 0,01, n = 50 hver). Når cellene ble behandlet med 2 mM NaBT, ble kolonistørrelse inhiberte signifikant i Caco-2-celler, men i CLCA1KD celler med behandling av NaBT den kolonistørrelse var ikke signifikant redusert (
p
0,05, n = 50 hver) (fig. 5A). Disse resultatene indikerer at den antiproliferative virkningen av NaBT kan være mediert ved CLCA1. For ytterligere å bekrefte effekten av CLCA1 på spredning, vi vurdert dette via ethynyldeoxyuridine (Edu) innlemmelse i Caco-2 celler. Vi fant at spredning av Caco-2-celler ble redusert i 3 dagers konfluente kulturer. Men spredning av Caco-2 celler ble forfremmet betydelig i siRNA
clca1 behandlede celler sammenlignet med en siRNA negative kontrollceller (
p
0,01, n = 100 hver) (figur 5B.). Sammen med 3D-kultur, viser disse resultater at ekspresjonen av CLCA1 bidrar til regulering av proliferasjon i Caco-2 celler.
A. Caco-2-celler, enten behandlet ved siRNA negativ kontroll, eller med CLCA1 siRNA alene, eller sammen med det tilsatt NaBT ble sådd ut i 25% Matrigel og holdt i 5% CO
2 og 37 ° C i 5 dager. Diameteren av cyster ble målt og analysert ved hjelp av Metamoph programvare. Gjennomsnittlig kolonistørrelse i Caco-2 CLCA1 knockdown celler økte signifikant sammenlignet med kontrollceller. NaBT inhiberte signifikant kolonistørrelse, men knockdown av CLCA1 kompromittert NaBT-indusert reduksjon av kolonistørrelse. Forstørrelse av mål er 10 ×. 50 cyster ble målt i hver gruppe i ett eksperiment. B. Caco-2 celler ble behandlet med negativ kontroll eller CLCA1 siRNA og dyrket i de dagene som vises. Celleproliferasjon ble oppdaget med Edu innlemmelse analysen. Edu ble visualisert ved hjelp av Alexa Fluor 594 (rød) og DNA for DAPI (blå). Histogrammet viser Edu positive% av celler i ulike grupper og viser at knockdown av CLCA1 betydelig økt celledeling.
P
verdier er vist på histogrammet. N = 100 i hver gruppe i ett eksperiment. Scale bar = 100 mikrometer i A, 50 mikrometer i B. Resultatene er vist som et gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
Spredning til differensiering overgang (PDT ) er et kritisk punkt i kontinuerlig fornyelse av en normal tarmepitelet [1] og tykktarms epitelceller er blant de mest studerte modeller av tumorigenesis siden deres konstant fornyelse krever tett regulering av PDT [3], [28]. Mange genetiske skader, inkludert mutasjon av APC og p53, produsere neoplastisk transformasjon av tykktarmen enterocyte. I tillegg, under organogenese, stamceller utføre ved å stanse all spredning gener og aktivering av differensiering gener i en trinnvis tidsmessig måte. Viktig innsikt om molekyler som kan tjene som mål for terapi ville bli oppnådd fra en full forståelse av de molekylære mekanismer for disse prosessene. Her fant vi at kalsium aktivert klorid kanal CLCA1 spiller en avgjørende rolle i regulering og vedlikehold av PDT i tykktarm enterocyte, siden tap av CLCA1 førte til hjemfall av celler til en lav-differensiert status.
CLCA1 Regulerer PDT i intestinale epitelceller
PDT av enkeltstamcelle er tett regulert av morphogens, vekstfaktorer og hormoner [29] og molekylære forandringer spesifikke komponenter av de signalveier som brukes av disse forskjellige klasser av molekylet er viktig under utvikling av kreft [30]. Av disse endringene, oppregulering av CDK-hemmere (CKI) p21
Cip1 /WAF1 og p27
Kip1 i mange terminalt differensierende celler [31], Wnt /β-catenin signal indusere muskelcelledifferensiering [32], SOX9 avhengig PKCα undertrykkelse favoriserer spredning og hemme differensiering [33] har blitt rapportert. Vår tidligere studie har vist at CLC-2, CLC-4 (klorid kanal 2 og 4) og CFTR (cystisk fibrose transmembran-regulator, et klorid kanal) ble uttrykt ved vesentlig høyere nivå i nylig isolerte humane hornhinnevevet enn i dyrkede epitelceller ( primær kultur eller cellelinje) [34]. Ettersom antallet celle-sjikt øker, ble det genekspresjon nivå og proteinfargeintensitet av CLCA2 (kalsium-aktiverte klorid kanalelement 2) økte signifikant [35]. Dette indikerer at CLCs (kloridkanalene) kan bidra til regulering av differensiering i utviklingen av epitelvev. I tillegg aktiviteten av Cl
– kanaler varierer med cellesyklusen, og tap av kalsium-aktiverte klorid kanaler vil gi en betydelig vekst fordel til tumorceller [14], [15], [35], [36], [37]. I CRC, ble CLCA1 og CLCA2 downregulated betydelig i ca 80% av pasientene [19]. Tap av ekspresjon av både mCLCA1 og mCLCA2 under tumorigenesis antydet at sterk aktivering av enten kan hindre overlevelse av tumorceller [16]. CLCA2 er nødvendig for epitelial differensiering, og dens tap i løpet av tumorprogresjon bidrar til metastase [38]. Prolifererende Caco-2-celler spontant initiere differensieringsprosessen når cellene har nådd konfluens. Dette cellular differentiation program blir startet ved celle-celle-kontakt og bryteren fra proliferasjon til differensiering kan utløses av spesifikke biokjemiske hendelser, inkludert E-cadherin mediert celle-celle adhesjon [20]. Klorid kanaler er membranprotein, og kan spille en viktig rolle i celle-celle-kommunikasjon etter celle-celle adhesjon. Samlet innebærer dette at de CLCAs kan spille en funksjonell rolle i tumordannelse gjennom å kontrollere spredning og differensiering balanse.
CLCA1 forløper er omtrent 900 aminosyrer lange med en proteolytisk spalting området etter den amino-terminal signalsekvens. Til slutt, to produkter av et 90-kDa og 30-40 kDa spille funksjonelle roller [15], [16], [36], [37]. CLCA1 er nært korrelert med transkripsjon av c-
myc,
en proto-onkogen hvis produktet er nært involvert i regulering av celleproliferasjon og apoptose [39]. I denne studien fant vi at du bruker microarray som uttrykk for CLC2, CLC3, CLCA1, CLCA4 og CFTR ble nedregulert betydelig i tidlige pasienter CRC og dette redusert uttrykk for CLCA1 ble bekreftet ved immunfluorescens farging av vev fra CRC pasienter (Fig. 1 ). I tillegg
in vitro
vi viste at CLCA1 var involvert i regulering av differensiering og spredning av Caco-2 celler. Når CLCA1 i Caco-2-celler ble inhibert med siRNA
clca1, både NaBT-indusert og spontan differensiering ble redusert signifikant (fig. 4), mens proliferasjon økte signifikant (fig. 5). Disse data antyder at aktivering av CLCA1 kan være avgjørende for å opprettholde balansen mellom differensiering og proliferasjon av enterocyttene.
I tillegg er den høye vevsspesifisitet av transkripsjon av noen CLCs [40], først foreslått at påvisning av deres mRNA i bestemte vev kan være nyttig for tidlig diagnose, molekylær iscenesettelse, og postoperativ overvåking [19]. Viktigere, våre data viser at upassende transkripsjon av klorid kanaler ikke bare tatt CLCA1, men også CLC2, CLC3, CLCA4 og CFTR, noe som indikerer at feil av klorid transport eller klorid strøm kan spille en nøkkelrolle i CRC. Aktivering av klorid strøm gjennom spesialvolum-regulerte anion kanaler (VRACs) er en av de viktigste mekanismer ved hvilke celler gjenopprette deres volum følgende hypo-osmotisk stress (RVD) [11], mens den transepitelial transport av klorid bidrar også til transepitelial potensialet forskjellen (TEP) i tarmen [41]. TEP er en iboende egenskap ved transport av epitel og oppstår fra gradienter av ioner transporteres retnings over epiteliale cellelagene. På tvers av tarmen, er det en TEP på -25 ± 7 mV, lumen negativ. Det vil være interessant å teste den nye oppfatningen at TEP kan spille regulatoriske roller i å kontrollere PDT og tumourgenesis av tarmen.
β-catenin er involvert i CLCA1 drevet celleproliferasjon og differensiering
Wnt veien er sterkt bevart gjennom dyrenes verden [4]. β-catenin er en sentral molekyl i kanonisk Wnt bane som regulerer tarm epitelial differensiering [4], [42], [43]. I tillegg β-catenin /TCF (T-celle-faktor) reaksjonsveien regulerer også colonic epitelcelleproliferasjon [33]. I mus myoblast celler C2C12, kan Wnt signalisering via β-catenin fungere som en molekylær bryter som regulerer overgangen fra celleproliferasjon til myogenisk differensiering [44]. I tillegg er de fleste tilfeller av CRC oppstå ved inaktivering av mutasjoner i adenomatøs polypose coli (
APC
) genet, som styrer β-catenin degradering [28], [45], [46]. Samlet tilsier dette at β-catenin pathway spiller en nøkkelrolle i PDT. I Caco-2 konfluerende kulturer, som de differensiere, β-catenin viste en tidsavhengig økning på cellemembranen (fig. 3) [27], og når CLCA1 ble slått ned, β-catenin ble nedregulert dramatisk på cellemembranen (fig. 4). Våre data antyder at β-catenin er involvert i kaskade av hendelser som fører til differensiering og dette er drevet av CLCA1 aktivering i Caco-2 celler.
CLCA1 som et mål av Smørsyre i Pro-differensiering og Anti-spredning
Smørsyre syre~~POS=HEADCOMP er en av de mest tallrike kort kjetting fettsyrer (SCFAs) og spiller en nøkkelrolle i kolonepitelet homeostase. Det oksyderes til acetyl CoA i mitochondria og utgjør hoveddrivstoffet for normale enterocyttene [47], [48], så vel som for tykktarmskreftceller [49]. I humane tarmkreftceller, butyrat hemmer cellevekst [49], [50], [51] og fremmer celledifferensiering [52]. I tillegg butyrat-indusert differensiering av PC12-celler til kromaffinceller innebærer tett celleadhesjon og induksjon av ekstracellulære celle adhesjonsproteiner [53]. Anticarcinogenic effekter av smørsyre har blitt observert ved bruk av carcinoma cellelinjer
in vitro
. I disse modellene fører butyrat til inhibering av proliferasjon, induksjon av apoptose, eller differensiering av tumorceller [54], [55], [56], [57]. Videre har mange mekanismer av butyrat største antikarsinogene effekter blitt rapportert, for eksempel det er en histondeacetylase-inhibitor [58], [59], [60], [61], øker p21 (
WAF1
) og genekspresjon induserer G1 cellesyklus arrest [62]. Butyrat også nedregulerer nøkkelen apoptotiske og angiogenese regulator neuropilin-1 (NRP-1) for å hemme tumorcellemigrering og overlevelse i tykktarmskreft [63]. I tillegg dysregulates butryrate BCL2 familieproteiner [64], [65], induserer GPR109A ekspresjon og aktivering av reseptoren for å forårsake tumor celle-spesifikk apoptose [66], og modulerer kanonisk Wnt signalering [67]. Smørsyre øker også differensiering av menneskelige LIM2537 tykktarm kreft celler, reduserer GSK-3β aktivitet og øker nivåene av både membranbundne og Apc /Axin /GSK-3P komplekse-forbundet bassenger av β-catenin [39]. Smørsyre er anerkjent for sitt potensial til å handle på annenhånds chemoprevention [68]. Våre resultater indikerer at CLCA1 som et mål av smørsyre, effektivt regulere pro-differensiering og anti-spredning i Caco-2 celler (fig. 2 og 5).
I sammendraget, avslører vi en ny mekanisme som CLCA1 regulerer Wnt /β-catenin drevet spontan og smørsyre-indusert differensiering av enterocytes. Dette indikerer at CLCA1 kan styre PDT av enterocyte og dermed fungere som en tumor suppressor i kolorektal tumorigenesis. Tap av CLCA1 uttrykk hemmer enterocyte differensiering og kan føre til tykktarmskreftutvikling. Således kan bedre forståelse av CLCA1 fenotype i kolonepitelet og mekanismene bak tap av ekspresjon i karsinomer tilveiebringe et middel for terapeutisk intervensjon ved reversering av progresjonen av human kolorektal kreftutvikling.
Materialer og metoder
Etikk Uttalelse
tykktarm og endetarm vev ble oppnådd fra kirurgi for pasienter ved Institutt for generell kirurgi, den tre hundre og niende Hospital of PLA, Beijing, Kina. Etisk godkjenning for studien ble gitt av tre hundre og niende Sykehuset PLA Ethics Committee. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle deltakerne i studien.
Cell Kultur
Caco-2 celler (ATCC, HTB-37) ble dyrket i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) (Invitrogen , UK), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, ikke-essensielle aminosyrer, 50 U /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator. Natriumbutyrat ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, UK.
knockdown av CLCA1 med siRNA
knockdown av CLCA1 ble utført ved hjelp BLOCK-iT ™ RNAi Express søkemotor (Invitrogen, UK). Stealth RNAi ™ siRNA duplex med sense-strand sekvenser 5’CAAUGCUACCCUGCCUCCAAUUACA-3 «ble sendt inn i en BLAST søk på menneske EST biblioteker for å sikre at andre menneskelige gener ble ikke målrettet. I korte trekk ble cellene dyrket i DMEM inneholdende 10% FBS uten antibiotika én dag før transfeksjon. Caco-2-celler deretter ble transfektert med CLCA1 spesifikke sirnas ved hjelp av lipofektamin 2000 fortynnet i Opti-MEM I-medium i henhold til produsentens protokoll (Invitrogen, UK) med en endelig siRNA-konsentrasjon 50-200 nM for optimalisering av siRNA transfeksjon. Ikke-målsøkende negativ kontroll siRNA ble anvendt for ikke-sekvensspesifikke effekter av disse molekylene. For 10 dagers monolagskulturer, 5 x 10
4-celler ble sådd inn i kollagen-for-belegg dekkglass eller 12-brønners plater. 100 nM av siRNA duplex ble transfektert på to
nd og 6
th dag med kultur. Etter 10 dager i kultur ble cellene på dekkglass fiksert og celler i 12-brønns plate ble lysert for western blot-analyse.
Kvantitativ PCR
Caco-2-celler ble dyrket i DMEM med /uten 2 mM NaBT behandling i 24 timer ved 37 ° C med 5% CO
2. Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av TRIzol® reagens (Invitrogen, UK). cDNA ble syntetisert med Superscript ™ III Celler direkte cDNA Synthesis System (Invitrogen, UK). Ekspresjonsnivået av CLCA1, CLCA2, CLCA3 og CLCA4 mRNA ble bestemt ved bruk av kvantitativ sanntid polymerase kjedereaksjon (qPCR). PCR-primere ble utformet ved hjelp Primer3 online [34]. Menneskelig CLCA1, CLCA2, CLCA3 og CLCA4 mRNA sekvenser ble lastet ned fra National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank. Regioner som passet konsensus sekvens for CLCA1, CLCA2, CLCA3 og CLCA4 ble valgt for PCR primere (tabell 1). Primere ble valgt til å være 20 bp i lengde, med et GC-innhold på 55% og ingen lange ganger i en enkelt base. 01:05 fortynnet cDNA ble brukt til å kjøre qPCR (SYBR grønn, Roche, Sveits) på LightCycler®
480
System.
