Abstract
Mål
Evnen til å forutsi respons på kjemoterapi for serøs ovarialcancer (EOC) vil være verdifull fordi egentlig kjemoresistent EOC pasienter (vedvarende eller tilbakevendende sykdom innen 6 måneder) gevinst liten nytte av standard kjemoterapi. Hensikten med denne studien var å skjerme og identifisere karakteristiske biomarkører i ascites av serøs EOC forbundet med iboende chemoresistance.
Metoder
Proteinprøver fra ascites av 12 kjemosensitiv og 7 egen kjemoresistent serøs EOC pasienter analysert ved hjelp av todimensjonal fluorescens forskjell i gelelektroforese (2-D DIGE) som er forbundet med matriks-assistert laserdesorpsjon /ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF /TOF MS). Videre ble de identifiserte proteinene validert av ELISA i ascites prøver fra 19 kjemosensitiv og 9 egen kjemoresistent EOC pasienter.
Resultater
Antall plasser påvist i alle 2-D Dige gels varierte fra 1523 -1711 bruker DeCyder programvare analyse. Tretti-fire flekker ble uttrykt forskjellig basert på kriteriene for en gjennomsnittlig ratio på mer enn 1,5 og en student t-test
P
verdi 0,05. Etter MALDI-TOF /TOF MS analyse, 11 differensielt uttrykte proteiner, inkludert tre oppregulert og 8 nedregulert proteiner, i ascites av kjemoresistent svulster ble vellykket identifisert. Av de fire utvalgte proteiner (ceruloplasmin, apolipoprotein A-IV, transthyretin og haptoglobin) i ascites testet av ELISA, bare ceruloplasmin var tilstede på signifikant forskjellige nivåer mellom kjemoresistent og kjemosensitiv ascites prøver med gjennomsnittskonsentrasjoner av 192,2 mikrogram /ml og 157,5 mikrogram /ml, henholdsvis (
P
= 0,001).
Konklusjon
den betydelig opp-regulert nivå av ceruloplasmin i ascitesvæske av indre kjemoresistent serøse EOC pasienter antyder sitt potensial som en prognostisk biomarkør for tiltak mot cellegift. Dette funnet ber videre undersøkelser med en større studie for å validere den kliniske nytten av ceruloplasmin
Citation. Huang H, Li Y, Liu J, Zheng M, Feng Y, Hu K, et al. (2012) Screening og identifisering av biomarkører i Ascites Relatert til Intrinsic Chemoresistance av Serous epithelial eggstokkreft. PLoS ONE 7 (12): e51256. doi: 10,1371 /journal.pone.0051256
Redaktør: Alexander James Roy Bishop, University of Texas Health Science Center i San Antonio, USA
mottatt: 15 juni 2012; Godkjent: 30 oktober 2012; Publisert: 10.12.2012
Copyright: © 2012 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr 7001535) Natural. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Platinum-basert kombinasjonskjemoterapi er standard førstelinjebehandling ved avansert stadium epitelial ovarialcancer (EOC). Svulstene blir betraktet som «platina følsom» dersom den kliniske progresjonsfrie intervall er mer enn 6 måneder, men omtrent 20% til 30% av pasientene fremgang eller deres tumorer raskt bli resistente mot denne behandling [1]. Disse pasientene med iboende chemoresistance som opplever et tilbakefall innen 6 måneder får lite nytte av standard behandling. Det er også holdepunkter for at jo lenger intervall før tilbakefall, jo bedre svarprosenten til påfølgende kjemoterapi [2]. Derfor kan chemoresistance for eggstokkreft være til stede ved starten av behandlingen (indre motstand) eller kan utvikles under behandling (ervervet resistens).
Foreløpig kan chemoresistance av EOC bare bestemmes med tilbakevirkende kraft etter at pasienter har fått byrden og toksisitet av ineffektiv behandling. Derfor, identifisering av karakteristiske molekylære biomarkører knyttet til iboende chemoresistance i EOC kan føre til individuelt tilpassede behandlingsformer og forbedring av resultatene siden standard kjemoterapi gir dem svært liten nytte.
Flere nyere studier har brukt genet mikromatriser å identifisere distinkte genekspresjon i indre kjemoresistent eggstokkreft pasienter på ulike plattformer, for eksempel nylon cDNA arrays, Affymetrix chips og Agilent oligonukleotid mikromatriser [3], [4]. Disse studiene har identifisert ulike prognostiske og Predictor gener som kan skille tidlig fra slutten av tilbakefall eller sykdomsprogresjon. Imidlertid transkripsjon av en mål-genet i tumoren kan ikke være en god indikator av legemiddelresistens og prognose for ovarian cancer. For eksempel kan mRNA overflod ikke korrelerer med tilsvarende protein ekspresjon og funksjon. Videre, for noen primære eller tilbakevendende kreftpasienter på eggstokkene, vevsprøver er ikke alltid tilgjengelig for genet profilering.
I motsetning til andre bekken /mage ondartet metastase, massiv ascites er en særegen klinisk manifestasjon i avansert EOC, med mer enn 80% av disse pasienter som har utbredt metastasering til de serøse overflater og tilhørende peritoneal og /eller pleural effusjon [5]. Kroppsvæsker har vist seg å være gode medier for biomarkører i kreft, og ascitesvæske inneholder ondartede epitelceller og aktiverte mesothelial celler som kan produsere cytokiner, vekstfaktorer og invasjonsfremmende komponenter er forbundet med invasjon og metastase [6]. Denne væsken inneholder derfor secretome av eggstokkreft celler og skyldes andre microenvironmental faktorer av malignitet.
således å anvende den stadig fremrykkende teknikk Proteomforskningen til analyse av ascites kan lette oppdagelsen av nye biomarkører som er mer følsomme og spesifikk enn de som i dag er tilgjengelig. Målet med vår studie var å skjerme og identifisere karakteristiske biomarkører i ascites av eggstokkreft i forbindelse med egenverdi chemoresistance av todimensjonal fluorescens forskjell i gel elektroforese (2D-DIGE) teknologi, som vil bidra til å identifisere disse pasientene med dårlig prognose og forbedre deres kliniske utfallet med alternative behandlingsformer.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av etisk komité Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center Institutional Review Board. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient.
Pasienter og Prøvepreparering
I alt 19 ascites prøver for 2D-DIGE og 28 tilfeller av ascites for ELISA validering ble samlet i løpet av februar . 1, 2009 til 31. desember 2010 fra intakte serøs EOC pasienter som gjennomgikk tilfredsstill cytoreduserende kirurgi. Kvinner med tidligere kreft historie og de som fikk neoadjuvant kjemoterapi ble ekskludert. Cytoreduserende operasjonen ble utført via en underlivs midtlinjesnitt. Prøver av 5 ml ascites ble innhentet og lagret ved 80 ° C i flytende nitrogen før total hysterektomi, bilateral salpingo-ooforektomi, Omentektomi og reseksjon av alt synlig og følbar klumpete svulst og lymphadenectomy, ifølge National Comprehensive Cancer Network (NCCN) retningslinjer . Informasjon om behandling og respons ble oppnådd ved pasientens diagrammet anmeldelse.
Etter debulking fikk pasientene seks sykluser av platinumbasert kombinasjonskjemoterapi. De cytostatika inkludert paclitaxel (135-175 mg /m
2), karboplatin (areal under kurven [AUC] 5-6), doxepaclitaxel (70 mg /m
2) og cisplatin (65-75 mg /m
2). Basert på NCCN retningslinjer, egen kjemoresistent svulster ble definert som de med vedvarende eller tilbakevendende sykdom innen 6 måneder etter oppstart av førstelinje platinumbasert kombinasjonskjemoterapi. Kjemosensitiv tumorer ble klassifisert som de med en komplett respons på kjemoterapi og en platina-fritt intervall på . 6 måneder
Ascites ble sentrifugert ved 2000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C for å separere fluid fra cellulære komponenter . Suspensjonen ble sonikert kort, og avfallet ble sentrifugert ved 14000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Supernatanten ble på nytt oppslemmet og vasket tre ganger i iskald Tris-bufret sukrose-oppløsning (10 mM Tris, 250 mM sukkrose, pH 7,0) og så skrapet og lysert i iskald lyseringsbuffer (30 mM Tris-HCl, 7 M urea , 2 M tiourea, 4% w /v CHAPS, pH 8,5).
Ascites prøver ble behandlet med ProteoPrep Blå albumin Nedbryting Kit (Sigma, St. Louis, MO, USA) som selektivt fjerner albumin og IgG i henhold til produsentens instruksjoner. For å rense proteinet utvinning og bestemme den endelige proteinkonsentrasjonen, ble det 2-D Clean-up Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) og 2-D Quant Kit (GE Healthcare) brukes sekvensielt.
Studiedesign og Protein Sample merking med CyDye
Tolv chemosensitve prøvene ble delt likt inn i to undergrupper med seks prøver hver, og syv chemoresistance prøver ble også tildelt i to undergrupper med fire eller tre prøver hver. Like mengder av de proteinprøvene i samme undergruppe ble blandet og delt inn i fire like porsjoner (50 ug hver). To av de kjemosensitiv proteinprøve aliquoter ble merket med Cy3, og to av de kjemoresistent prøve prøver ble merket med Cy5. De resterende to kjemosensitiv prøver ble deretter merket med Cy5 og de to andre prøver med kjemoresistent Cy3. En prøve bestående av like mengder av alle prøvene ble anvendt som den samlede indre standard (50 ug) og merket med 200 pmol av Cy2. Derfor ble en kjemosensitiv pasient basseng (Cy3 eller Cy5), en kjemoresistent pasient basseng (Cy5 eller Cy3) og en intern standard (Cy2) kjøres i hver gel, med fire gels totalt basert på vår design. Dette fargestoffet bytte strategi ble vedtatt for å unngå fargestoff skjevhet og lov for lik fordeling av Cy fargestoffer i begge pasientgrupper.
Protein merking ble gjennomført med CyDye DIGE Fluors (GE Healthcare) som beskrevet i Ettan DIGE bruksanvisningen. I korthet, etter inkubering på is i 30 min i mørket, 1 ml 10 mM lysin ble tilsatt for å stoppe reaksjonen. For hver gel, Cy2-, Cy3- og Cy5-merkede proteiner (50 ug hver) ble blandet og justert til 450 pl med rehydratisering buffer [7 M urea, 2 M tiourea, 4% (vekt /volum) CHAPS, 40 mM DTT , 1% IPG buffer (pH 4-7), 0,002% (w /v) bromfenolblått].
2D-DIGE
. Etter utvanning ble merket protein blanding for hver gel brukes på en Immobiline DryStrip (24 cm, pH 4-7, GE Healthcare). Isoelektrisk fokusering (IEF) ble utført med en Ettan IPGphor II apparat (GE Healthcare) som følger: 30 V for 12 timer, 500 V for en time, 1000 V i 1 time og 10 000 V for opp til totalt 85 000 Volt-timers . Etter IEF ble proteinene redusert og alkylert ved suksessive 15 min behandlinger med ekvilibreringsbuffer inneholdende 2% (vekt /volum) DTT, etterfulgt av 2,5% (vekt /volum) jodacetamid. Proteinene ble deretter løst i 12,5% SDS-PAGE-geler ved hjelp av en Ettan DALTsix instrument (GE Healthcare). For å lette MS analyse ble en umerket basseng proteinprøven (500 mikrogram) kjøres parallelt på en preparativ gel og farget med Deep Purple Total protein Stain (GE Healthcare) i henhold til produsentens instruksjoner.
Gel bilde Oppkjøp og analyse
Gel bildene ble kjøpt på et Typhoon 9400 skanner (Amersham Biosciences) og analysert ved hjelp av DeCyder programvare (V6.0, GE Healthcare) som beskrevet tidligere [7]. De CY2, Cy3 og Cy5 signaler ble individuelt avbildes med eksitasjon /utslipp bølgelengder av 488/520, 532/580 og 633/670 nm, henholdsvis. Fremstillings gels (Deep Purple Total Protein Stain) ble skannet med eksitasjon /utslipp bølgelengder av 532/560 nm i henhold til brukerveiledningen. Proteiner i kjemosensitiv ascites prøver ble sammenlignet med dem i kjemoresistent seg. Økninger eller reduksjoner på protein overflod av mer enn 1,5 ganger (t-test og ANOVA,
P
0,01) ble vurdert som vesentlige endringer. De tilsvarende protein flekker ble valgt i beiset preparativ gel for spot plukking.
Protein Spot Håndtering
De valgte protein flekker i fremstillings gels ble automatisk plukket og håndtert på en Ettan Spot Håndtering arbeidsstasjon ( GE Healthcare). De utvalgte protein flekker ble vasket med 15 mM ammoniumbikarbonat og 50% metanol og deretter spaltet på 0.02 ug /mL sekvense karakter trypsin-oppløsning (Promega, Madison, WI, USA) ved 37 ° C i 2 timer. De tryptiske peptider ble ekstrahert med 50% (v /v) acetonitril (ACN) og 0,5% (v /v) trifluoreddiksyre (TFA), oppløst i 5 mg /ml R-cyano-4-hydroxycinnamic syre (Amersham Bioscience) i 50% (v /v) ACN og 0,1% (v /v) TFA og deretter oppdaget på MS prøven plate.
Matrix-assistert Laser desorpsjon /ionisering Time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF /TOF MS) Analyse
Protein identifikasjon ble utført med ABI 4800 Proteomics MALDI-TOF /TOF Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i positiv ion reflektor modus. Monoisotopic peak massene ble kjøpt i en rekke 900-4,000 Da med en signal-til-støy-forholdet (S /N) 200. Trypsin autolyse peptider av massene 842.5 og 2211,1 ble brukt som interne standarder. Fem av de mest intense ion signalene ble automatisk valgt som forløpere for MS /MS oppkjøp, unntatt trypsin autolyse topper og matrise ion-signaler. Den peptid masse fingeravtrykk (PMF) kombinert MS /MS spektra ble søkt mot NCBInr databasen ved hjelp av GPS Explorer ™ programvaren (versjon 3.6, Applied Biosystems) og MASCOT versjon 2.1 (Matrix Science). Søke parametere ble satt som følger:
Homo sapiens
, trypsin cleavage (One Missed cleavage tillatt), carbamidomethylation som fast modifikasjon, metionin oksidasjon som variabel modifikasjon, peptid masse toleranse satt til 75 ppm og fragment toleranse satt til 0,2 da. En betydelig høy MASCOT poengsum som resulterte i en trygg intervall (CI) som er større enn 95% for PMF eller MS /MS-data for en flekk ble ansett som en troverdig identifisert protein. De andre kriterier inkludert minst fire peptider treff i PMF databasert identifikasjon og minst to peptider med forskjellige sekvenser identifisert i MS /MS-analyse.
ELISA Validering
Ascites prøver (5 ml ) ble sentrifugert ved 2000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C for å separere væske fra cellulære komponenter. Suspensjonen ble sonikert kort, og avfallet ble sentrifugert ved 14000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Supernatanten ble resuspendert og lagret ved -80 ° C.
ELISA-analysesett for hver av de som er valgt for videre analyse analytter ble anskaffet fra Abcam. Disse analytter var som følger: apolipoprotein A-IV (Apo-AIV), ceruloplasmin, haptoglobin og transthyretin. Analysene ble utført ved å følge instruksjonene i settet. I korte trekk ble den fargeforandring på grunn av det enzym-substrat reaksjon av hver brønn i mikrotiterplaten måles spektrofotometrisk ved en bølgelengde på 450 nm. Konsentrasjonen av hver testet protein i prøven ble deretter bestemt ved å sammenligne den optiske tetthet (OD) til den av standardkurven.
t-test ble utført for å sammenligne forskjellene mellom serumproteinverdier. SPSS 16.0 programvarepakke (SPSS, Chicago, IL, USA) ble brukt til å utføre de statistiske analysene, og en to-tailed
P
verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
resultater
klinisk Pasientinformasjon
Nitten ascites prøver av serøs EOC pasienter ble analysert ved hjelp av 2D-DIGE til skjermen potensielle biomarkører forbundet med differensial svar på kjemoterapi. Prøver fra en egen kohort av 28 pasienter med serøs EOC ble brukt til validering av 2D-Dige resultatene etter ELISA. Alle pasientene hadde fått tilfredsstillende cytoreduserende kirurgi. Det var ingen signifikante forskjeller i alder ved diagnose, tumor differensiering og International Federation of gynekologi og fødselshjelp (FIGO) staging mellom pasientene i kjemosensitiv og kjemoresistent grupper. Demografiske og kliniske funksjoner av tilfellene er vist i tabell 1.
I tillegg overlevelse av de 28 pasientene som ble testet ved ELISA ble sammenlignet i henhold til deres ulike reaksjoner på kjemoterapi. Innen mars 2012, fire av de ni pasienter (44,4%) i kjemoresistent gruppe og tre av nitten pasienter (15,8%) var død i kjemosensitivitet gruppen. Median overlevelse av de ni kjemoresistent eggstokkreft pasienter i vår studie var 18,9 måneder. Men en lengre periode med oppfølging var nødvendig for å bestemme en nøyaktig median overlevelse av kjemosensitiv pasienter, som var mer enn 18,9 måneder. Basert på observasjonsperioden i denne studien, forskjellen i overlevelse mellom de to gruppene som er observert ved bruk av Kaplan-Meier estimater var signifikant (
P
= 0,007), favoriserer de med bedre respons på kjemoterapi (Fig. 1) .
En vesentlig forskjell (
P
= 0,007) ble observert i overlevelse, noe som favoriserte pasienter med kjemosensitiv svulster.
2D-DIGE Analyse og MS /MS Identifikasjon
Ifølge vår forsøksplanlegging beskrevet i Materialer og metoder, fire 2D-Dige gels totalt ble satt opp for proteomikk analyse av kjemoresistent versus kjemoresistent pasient ascites. For hver gel et sammenslåtte bildet ble generert fra tre bilder av kjemosensitiv, kjemoresistent og interne standard prøver. En representant DIGE gel som viser overlapping av Cy2, Cy3 og Cy5 merket bilder er vist i figur 2.
En representant 2D-DIGE bilde (sammenslåtte bildet) som viser protein profilen til ascites av kjemosensitiv og kjemoresistent eggstokkreft pasienter merket med Cy5 (røde flekker) og Cy3 (grønne flekker), henholdsvis, med en intern standard merket med Cy2. IPG strimler (24 cm, pH 4-7) ble anvendt for IEF før standard SDS-PAGE (12,5% polyakrylamid) for den andre dimensjon. Molekylvektområdet i den vertikale dimensjon er omtrent fra 150 til 10 kD. Proteiner identifisert som uttrykt forskjellig, er markert med gule piler med tildelte tall fra DeCyder analyse. Tallene i figuren tilsvarer de som presentert i tabell 2; (Nederst) MALDI-TOF-MS massespektrummet flekk 1543 identifisert som ceruloplasmin i henhold til de matchet toppene.
ble oppdaget Totalt 1523 til 1711 plasser i forskjellige Differential In-gel Analysis (DIA) arbeidsområder i alle gels bruker DeCyder programvare. I den biologiske variasjonen Analysis (CDG) modul, ble Cy3 bildet fra gelen nummer fire valgt som master gel som den hadde det maksimale antall flekker. Tretti-fire flekker ble funnet å være forskjellig uttrykt basert på kriteriene for å ha en gjennomsnittlig ratio på mer enn 1,5 eller mindre enn -1,5 og en student t-test
P
verdi 0,05. Blant dem ble 14 flekker funnet å være nedregulert i kjemoresistent ascites, og 27 ble oppregulert i forhold til kjemosensitiv pasientene.
Noen av differensial flekker oppdaget av DeCyder programvare kan ikke bli visualisert i preparativ gel farget med kolloidalt Coomassie sannsynlig på grunn av lav overflod. Etter visuell vurdering, ble 20 protein spots som viser høy overflod og betydelig endret uttrykk i kjemoresistent versus kjemosensitiv pasienter valgt for MALDI-TOF /TOF MS analyse. I alt 11 forskjellig uttrykt proteiner, inkludert tre oppregulert og 8 nedregulert proteiner, i ascites av kjemoresistent svulster sammenlignet med kjemosensitiv svulster ble vellykket identifisert. Peptid telling av de identifiserte proteinene varierte fra 4 til 33. Fold endringer i nivåene av de 11 identifiserte proteiner i de to gruppene sammen med de detaljerte Mascot søkeresultatene er gitt i Tabell 2.
Flere proteiner ble identifisert i flere flekker. For eksempel minutt: 1421, 1593, og 1598 ble alle identifisert som transthyretin protein, som er en transport- og akutt fase-protein, eller en av variantene. Tilsvarende ble flekker 1614 og 1626 identifisert som haptoglobin, mens flekker 1536 og 1543 ble bestemt å være ceruloplasmin og dens proteolytisk fragment. De identifiserte proteiner er involvert i fire forskjellige aspekter av cellefunksjon og er relatert til tumorprogresjon og metastase (en cytoskeletal protein, tre energi /lipid metabolisme proteiner, tre bærerproteiner og fire akuttfaseproteiner).
ELISA Validering av Apo-AIV, ceruloplasmin, transthyretin og haptoglobin
for å validere resultatene av proteomikk analyse, vi fast bestemt på nivåene av fire proteiner inkludert Apo-AIV, ceruloplasmin, transthyretin og haptoglobin i ascites prøver fra 19 kjemosensitiv og 9 egen kjemoresistent EOC pasienter ved ELISA. Basert på tidligere proteomikk profiler og vurderer våre formål screening unike biomarkører i ascites ble cytoskeletal protein (ACTB) ekskludert fra denne analysen.
ELISA Resultatene bekreftet våre MALDI-TOF /TOF MS funn i at nivået av ceruloplasmin var signifikant høyere i kjemoresistent enn i kjemosensitiv ascites. Den gjennomsnittlige konsentrasjonen av ceruloplasmin var 157,5 mikrogram /ml i kjemosensitiv gruppen og 192,2 mikrogram /ml i kjemoresistent gruppe (
P
= 0,001), mens nivåene av Apo-AIV, transthyretin og haptoglobin var ikke signifikant forskjellig mellom de to gruppene. Disse resultater er oppsummert i tabell 3.
diskusjon
Prognosen for ovariekreft er kjent for å være sterkt assosiert med lengden av den platina-frie intervallet fra den primære første-linje platina-basert kjemoterapi behandling til tilbakefall. Jo lengre dette intervallet varer, jo bedre svarprosenten til påfølgende kjemoterapi [8]. Dermed er standard kjemoterapi i stor grad ikke-gunstig for egen kjemoresistent kreftpasienter på eggstokkene (med vedvarende eller tilbakevendende sykdom innen 6 måneder). Evnen til å forutsi respons på standard kjemoterapi hos disse pasientene ville være svært verdifull i å la tidlig bruk av individualiserte therapeutics å forlenge overlevelsen og unngå unødvendige bivirkninger av ineffektive behandlinger.
Vi har merket oss at mange avansert stadium eggstokkkreftpasienter stede med rask vekst av tumorer intraperitoneale sammen med abdominal oppblåsthet som et resultat av akkumulering av ascites fluid i det peritoneale hulrom. Mekanistisk oppstår ascites formasjon som maligne celler utskiller proteiner, vekstfaktorer og cytokiner som forårsaker neovaskularisering, angiogenese, økt væskefiltrering og /eller lymfatisk hindring, noe som resulterer i oppbygging av serum-lignende væske i bukhulen [9], [10]. Den rike medium gir støtte for maligne celler til å proliferere og ytterligere metastasere til tross for mangelen på matrisen substrater, slik at disse cellene til å overvinne den apoptose forbundet med tap av vedlegg. Dette innebærer at ondartede celler og mesothelial celler i ascites oppregulerer overlevelsessignaler for å vedvare i hypoksisk men ellers rike væskemiljøet [11]. Således er ascites en utmerket reservoar for identifisering av nyttige kreft biomarkører, spesielt hos pasienter som EOC [12].
I en studie av Kislinger gruppe, ble ascites separert i cellulære og flytende fraksjoner, etterfulgt av massespektrometri-analyse av hver fraksjon [13]. Mens mer enn 2500 proteiner i ascites ble identifisert, ble bare 229-proteiner som finnes i fluidfraksjonen. Etter integrert beregnings analyse av ascites proteomet kombinert med proteomikk data fra humant plasma og urin microarray datasettene og protein-protein Interaksjon Database I2D, 80 kandidat serologiske eggstokkreft biomarkører ble valgt for videre validering. Kuk og kolleger også utført proteomikk analyse av ascites fluid basert på flere separasjons- og fraksjoneringsteknikker [14]. Totalt 52 proteiner ble valgt ut fra 445 unike proteiner i ascitesvæske som gode kandidater for eggstokkreft biomarkører i fremtidige undersøkelser. Disse forfatterne alle funnet proteomikk analyse for å være en betydelig ressurs for eggstokkreft forskning og et rammeverk for biomarkører.
Så vidt vi vet, proteomikk studier av eggstokkreft ascites er begrenset, og en sammenlignende studie mellom iboende kjemoresistent og kjemosensitiv eggstokkreft ascites av DIGE teknologi har ikke tidligere blitt rapportert. Funnene i vår studie kan hjelpe til prediksjon av behandlingstiltak og sykdom prognose for eggstokkreft pasienter. Vårt første mål var å finne unike biomarkører bare i ascites fluid, og ikke i den cellefraksjon som i Kislinger undersøkelse [13]. Således separeres vi fluidfraksjon fra cellulære komponenter for 2D-DIGE ved sentrifugering. Som biomarkører kan være til stede ved lave konsentrasjoner i kroppsvæsker som serum og ascites, en stor utfordring å gjennomføre dyptgående analyse av proteom av massespektrometri er tilstedeværelsen av svært rikelig proteiner som albumin og immunglobuliner, som utgjør 65-97% av serumproteiner [15]. Disse tallrike proteiner begrenser ioniseringen effektivitet i løpet av MS-analysen, og hindrer identifisering av lav overflod proteiner. Derfor tappe de svært rike proteiner ved hjelp av en 2D-rydde opp kit var nødvendig før vår analyse for å avdekke ydmyk rikelig biomarkører.
I vår studie, totalt 11 differensielt proteiner ble identifisert mellom kjemosensitiv og kjemoresistent eggstokkreft ascites. Det var ikke uventet at noen proteiner ble identifisert i flere flekker, fordi mange proteiner i ascites er kjent for å eksistere som isoformer. For eksempel ble haptoglobin og transthyretin representert med to og tre flekker, henholdsvis, og i begge tilfeller, er de enkelte flekker ble likeledes nedregulert. I tillegg er det samme protein som er til stede i flere forskjellige steder kan ha representert biologisk relevante endringer eller proteolytiske fragmenter (f.eks, ceruloplasmin).
Endringen i serumkonsentrasjon av ceruloplasmin, sammen med mange andre akuttfaseproteiner identifisert blant differensielt uttrykte proteiner implikert nærvær av immun- og inflammatoriske responser forårsaket tumoren. Resultatene var ikke uventet siden ulike inflammatoriske mediatorer, som spiller ulike roller som indusere angiogenese, invasjon, autokrine vekst sløyfer og motstand mot apoptose, er forhøyet i ovarialcancer [16]. Mange akuttfaseproteiner som haptoglobin og transthyretin har også nylig blitt karakterisert som ovariekreft biomarkører for tidlig deteksjon [17]. Videre, i en tidligere gen profilering undersøkelse, Bachvarov og kolleger at ned-regulerte gener i kjemosensitiv serøse EOC tumorer inkludert tallrike gener involvert i lipidmetabolisme og transport, inflammasjon, så vel som gener som er kjent for å øke tumorprogresjon og invasjon [18]. Disse funnene innblandet akuttfaseproteiner som kandidat biomarkører av interesse for videre etterforskning.
ceruloplasmin, en plasma glykoprotein som transporterer kobber i hele kroppen, var det eneste proteinet bekreftet av ELISA i denne studien å være forskjellig uttrykt i ascites mellom kjemoresistent og kjemosensitiv pasientene i denne studien. Interessant nok har høye serumnivåer av ceruloplasmin er vist i forskjellige kreftformer som skjoldbruskkjertelen, prostatakreft og tykktarmskreft [19], og microarray analyse har knyttet dette genet til tumorinvasjon og metastase i brystkreft [20]. Altered serum ceruloplasmin etter behandling (cellegift eller stråling) er observert hos mange pasienter med ondartet kreft som strupehodet, cervical og brystkreft. Tydeligvis er en mer signifikant reduksjon av serumnivået ceruloplasmin etter behandling forbundet med en bedre respons på behandling, da disse forandringer kan påvirke sykdomsforløp [21], [22]. Disse tidligere observasjoner støtter våre funn at konsentrasjonen av ceruloplasmin var betydelig lavere i ascitesvæsker av kjemosensitiv kreftpasienter på eggstokkene.
roller for ceruloplasmin har blitt foreslått i kreftrelaterte prosesser, herunder angiogenese og neovascularization. Proteinet fungerer også som en surrogatmarkør for hele kroppen kobber. Derfor kan lavere serum ceruloplasmin nivå i vårt studium være sekundær til mangel på hele kroppen kobber assosiert med tumor suppresjon. I en studie av Cox et al., Tetrathiomolybdate (TM), ble en kobber chelator brukes til å redusere kroppens lagre av kobber i en murine modell på hode og hals plateepitelkarsinom (SCC) etablert ved hjelp av svært aggressive SCC VII /SF cellelinje [23]. Forfatterne fant at når den totale kropps kobber ble redusert med TM, ble serum ceruloplasmin nivå proporsjonalt redusert, med referansenivå avtar fra by28%. Som undertrykte betydelig nivåer av både vekst av SCC og tumor vaskularitet ble identifisert, resultatene antydet en mulig effekt av TM i behandling av kreft via dens virkning på angiogenese og neovaskularisering. Lignende resultater ble sett i en fase II-forsøk med avansert nyrekreftpasienter hvor anti-tumor-effekter av TM (redusert vaskularitet og tumormasse) ble forbundet med lavere serum kobber og ceruloplasmin [24].
Således endringen i serumkonsentrasjonen av ceruloplasmin kan tyde på at det er en akutt fase-protein utskilles i respons til oksidativt stress i inflammasjon assosiert med tumoren og /eller at det er sekundært til mangel av total kropps kobber. Vår analyse var basert på primær serøs EOC svulster uten blandede histotypes av ovarietumorer eller tilbakevendende og metastatiske svulster. Så vidt vi vet, er dette det første rapporterte proteomikk analyse av 2D-DIGE analyse av ascites fra pasienter med iboende kjemoresistent og kjemosensitiv eggstokkreft. I tillegg kan resultatene hjelpe til å forutsi terapeutisk respons og gi sykdomsprognosen så vel som nye spor inn i mekanismen av chemoresistance for ovarian cancer. Det er imidlertid mulig skjevheter i vår studie. Som nevnt før, kan ekspresjonen av ceruloplasmin være assosiert med tumorprogresjon. Derfor kan det høye nivå ceruloplasmin i ascites i vårt studium være forårsaket av forholdsvis avansert tumormetastase forbundet med dårligere prognose. I tillegg kan forspenner være forårsaket av serumkomponenter i ascites fluid eller til og med fra vårt utelukkelse av ascites prøvene blandet med blod på grunn av tumor blødning.
I vår undersøkelse antallet pasienter var begrenset av lengden tiden som kreves for samling av prøver.
