Abstract
Bakgrunn
prekliniske modeller for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) krever bedre klinisk relevans for å studere sykdomsmekanismer og innovative behandlingsformer. Vi ønsket å sammenligne og avgrense bioluminescent ortotopiske musemodeller for menneskelig lokaliserte NSCLC.
Metoder
atymiske
naken
mus gikk subkutan injeksjon (gruppe 1-SC, n = 15, kontroll), perkutan orthotopic injeksjon (gruppe 2-POI, n = 30), kirurgisk orthotopic implantasjon av subkutant dyrkede tumorer (gruppe 3-SOI, n = 25), eller transpleural orthotopic injeksjon (gruppe 4-TOI, n = 30) av A549-luciferase celler. Bioluminescent
in vivo
avbildning ble deretter utført ukentlig. Sirkulerende tumorceller (CTCs) ble søkt hjelp Cellsearch® system i SC og TØI-modeller.
Resultater
Gruppe 2-POI var assosiert med uventet direkte pleural spredning av mobilløsningen i 53% av tilfellene, og forbød ytterligere vurdering av eventuell lokalisert lunge svulst. Gruppe 3-SOI var preget av høy perioperativ dødelighet, først lokaliserte lungesvulster, og lokal utvikling. Gruppe 4-TOI ble forbundet med lav perioperativ dødelighet, først lokaliserte lungesvulster, loco regional utvidelse, og fjernmetastaser. CTCs ble påvist i 83% av
nakne
mus med subkutane eller ortotopiske NSCLC tumorer.
Konklusjoner
Transpleural orthotopic injeksjon av A549-luc celler i
naken
mus lunge induserer lokalisert tumor, etterfulgt av lymfatisk forlengelse og spesifikk dødelighet, og tillot første gang identifisering av CTCs i en NSCLC mus modell
Citation. Mordant P, Loriot Y, Lahon B, Castier Y, Lesèche G, Soria JC, et al. (2011) Bioluminescent ortotopiske musemodeller for menneskelig Lokalisert ikke-småcellet lungekreft: Mulighetsstudie og identifisering av sirkulerende Tumor celler. PLoS ONE 6 (10): e26073. doi: 10,1371 /journal.pone.0026073
Redaktør: Wafik S. El-Deiry, Penn State Hershey Cancer Institute, USA
mottatt: 24 Juni 2011; Godkjent: 19 september 2011; Publisert: 11 oktober 2011
Copyright: © 2011 Mordant et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. PM har vært støttet av den franske Society of Thoracic Surgery (SFCTCV). BL har vært støttet av den franske medisinske forskningsstiftelse (FRM) og Generation Thorax. Dette prosjektet er støttet av den franske Cancer Research Association (ARC til MCV og ED) og Gustave Roussy Foundation (Fondation Gustave Roussy til MCV og ED). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den ledende årsak til kreft relatert dødelighet på verdensbasis. Til tross for mange kliniske utprøvinger av preklinisk lovende narkotika, har ingen store utbrudd foretatt i NSCLC ledelsen i de siste tiårene. Selv om det er sterke bevis basert medisin som støtter klinisk bruk av cytotoksiske, rundt 3 typer agenter har vist jevn men begrenset effekt (platina, taxaner, gemcitabin). Mer nylig har målrettet terapi fravikes viktige forhåpninger gitt sin evne til å direkte treffe kreftcellespesifikke overlevelsesmekanismer. I skarp kontrast med robusthet av den underliggende biologisk rasjonelle, klinisk translasjonsforskning av denne kunnskapen i klinisk nytte er fremdeles utfordrende siden målrettet terapi viste bare en marginal overlevelsesfordel når de vurderer hele NSCLC pasienter befolkningen [1] – [4]. Etter disse innledende forsøkene, retrospektive molekylære analyser av tumorvev førte til definisjonen av undergrupper av pasienter som positivt reagerer på eksperimentelle behandlinger, med forvaltning av visse kreftformer som revolusjon [5]. Blant pasienter med NSCLC som får erlotinib, nærværet av en EGFR-mutasjon økt respons til agenten [6], [7], men angår bare 16% av pasientene [8]. Mer nylig, har inhibering av anaplasic lymfom kinase (ALK) er rapportert å resultere i tumorkrympning eller stabil sykdom hos de fleste pasienter med NSCLC husing EML4-ALK fusjonsgen, men angår bare 2 til 7% av NSCLC [9]. Men i mellomtiden betydelig innsats har vært brukt i kliniske studier testing aktive behandlinger på resistente svulster [2], [3], [10] – [12]
Avviket mellom verdiene av den kliniske. begrunnelsen, mengden av prekliniske data på den ene siden og den lave utgangen fra deres overføring i kliniske studier antyder at relevansen av prekliniske modeller kan settes spørsmålstegn ved. Spesielt bør preklinisk testing ha en mer entydig positiv versus negativ prediktiv verdi [13]. Nåværende in vivo prekliniske modeller er ikke gjenspeiler trinnene ondartet progresjon fra normalt vev til forstadier lesjon og deretter til kreft (lokalisert og deretter metastatisk). Ideell modell bør etterligne den naturlige historien til menneskelig kreft, for å forbedre vår forståelse av kreft patogenesen, forutsi effekten av den undersøkte behandling og identifisere hvilken behandling vil passe til hvilken pasient før utformingen av kliniske studier. I denne sammenheng xenoimplantater modeller forblir hjørnesteinene i prekliniske forsøkene og vil tjene på hvilke tekniske forbedringer, sammen med den siste utviklingen av dataassistert drug design, datamodellering, og genmodifiserte dyr [14]. Humane NSCLC-xenotransplantater kan implanteres i dyr med immunologiske forstyrrelser, enten subkutant (SC) eller orthotopically. I den ene hånden, SC xenografter av lungekreft er enkel å utføre og å følge, men mangler relevans om (i) den naturlige historie av kreft på grunn av fravær av lymfatisk eller metastaserende forlengelse, og (ii) prediksjon av legemidlets effekt i kliniske studier som bevitnet av den høye andelen av negative kliniske studier [13]. I den andre hånden, ortotopiske modeller av lungekreft er teknisk mer krevende, ikke alltid etterligne den naturlige historien til lungekreft, men øke betydelig håp om narkotika screening [15]. Den siste økningen i vår forståelse i krysstale av svulsten stroma [16] – [18] og sitt engasjement i legemiddelresistens, metastase, immun flukt, tyder angiogenese sterkt at ortotopiske modellene skal gi verdifull informasjon som man ikke kunne få fra sub -cutaneous modeller.
Vurderer thorax svulster, er den tekniske utfordringen å vokse «lunge kreftceller i brystet». Flere teknikker kan brukes til dette formål, inkludert intra tracheal administrering [19] eller perkutan injeksjon ortotopisk [20] av NSCLC-celler i oppløsning, og kirurgisk implantasjon av ortotopisk subkutant vokst tumor som stammer fra NSCLC-cellelinjen [21]. Intratrakeal administrering er assosiert med diffus innledende spredning av cellene til begge lungene, forstyrrer progresjon og lungemetastase prosess, derfor favorisere perkutane og kirurgiske modeller. Imidlertid har teknisk gjennomførbarhet og naturhistorie av disse to modellene aldri blitt sammenlignet. Denne studien søkt å sammenligne og avgrense disse to ortotopiske xenoimplantater modeller av lungekreft, med det endelige mål å reprodusere menneske NSCLC progresjon, fra opprinnelig lokalisert intraparenchymatous svulst, til metastaseutvikling og generell forverring. For dette formål har vi sammenlignet med fire xenoimplantater modeller, inkludert subkutan injeksjon anvendt som kontroll, perkutan ortotopisk injeksjon og kirurgisk implantering ortotopisk som tidligere beskrevet, og transpleural ortotopisk injeksjon som en ny modell. Å tillate langsgående oppfølging av tumorprogresjon og videre evaluering av behandlingseffekt, vi brukte en cellelinje transfektert med luciferase og utført
in vivo
bioluminescent imaging. Mulighets ble vurdert ved perioperativ dødelighet og engraftment rate. Klinisk relevans ble vurdert ved første intra parenchymatous beliggenhet, lokoregionalt forlengelse, metastatisk forlengelse, median overlevelse og histologisk aspekt. I en eksplorativ analyse, ble identifisering av sirkulerende tumorceller (CTCs) utføres ved hjelp av Cellsearch® analysen (Veridex LLC, USA).
Materialer og metoder
Cell linje
human A549 lunge adenokarsinom-cellelinje stabilt transfektert med luciferase (A549luc) ble innkjøpt fra Sylinder Lifesciences Corp Cellene ble dyrket i komplett medium, bestående av 10% (v /v) føtalt bovint serum, 2 mmol L-glutamin, og 50 enheter /ml penicillin-streptomycin i RPMI (alle fra Invitrogen). Celler ble dyrket ved 37 ° C og 5% CO2 i en inkubator, testet som mykoplasma gratis ved hjelp av en PCR-mykoplasma deteksjonssett (MycoProbe, R 0,05 ble betraktet som signifikant. Alle dataanalyser ble utført med den frie R programvare (https://www.r-project.org, R Foundation for Statistiske Computing, Wien, Østerrike).
Resultater
Mulighets
Mulighets ble vurdert ved fastsettelse av perioperativ dødelighet og engraftment rate. Perioperativ dødelighet var null i gruppe 1-SC anvendt som en kontroll, og signifikant høyere i gruppe 3-SOI (60%, p 0,001), men ikke i gruppe 2-POI (6%, p = 0,79), eller 4- TOI (3%, p = 0,72). Der effekten av en lærekurve på den perioperative dødeligheten av gruppe 3-SOI, observerte vi en ikke-signifikant reduksjon i dødelighet mellom de første 10 dyrene og de tidligere 15 dyr (dødelighet 80% vs 47% henholdsvis, p = 0,21 ). ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom gruppene 2-POI og 4-TOI om perioperativ dødelighet (p = 0,99, tabell 1). Engraftment hastighet var 100% i gruppe 1-SC brukt som en kontroll, og betydelig lavere i gruppe 2-POI (68%, p = 0,037), gruppe 3-SOI (60%, p = 0,034) og gruppe 4 -TOI (65%, p = 0,027). ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom de 3 forsøksgrupper om engraftment rate (p = 0,90, tabell 1).
Klinisk relevans
Klinisk relevans ble vurdert ved plasseringen av den opprinnelige svulst, avbildning av svulst forlengelse, overlevelsesanalyse og histologisk undersøkelse. Den opprinnelige tumor ble begrenset til SC vev i gruppe 1-SC og til lunge parenchyma i gruppe 3-SOI. I gruppe 2-POI, 53% av dyrene gikk pleural seeding i løpet av perkutan orthotopic injeksjon og utviklet innledende loco regional utvidelse til begge pleurae. Som Målet med denne studien var å få en intrapulmonal lokalisert NSCLC modell, denne umiddelbare pleural seeding diskvalifisert teknikken. I gruppe 4-TOI, tumoren ble opprinnelig begrenset til lunge parenchyma (tabell 1, figur 2a og 2b). Bioluminescent avbildning funnet uregelmessige kurver i gruppe 1-SC og 3-SOI, med høy blant enkelte og kronologiske variasjoner. Ingen dyr utviklet lokoregionalt eller metastaserende utvidelser under oppfølging. I gruppe 2-POI, ble ingen bioluminesens kurve plottet på grunn av perioperativ pleural seeding. Ett dyr utviklet bein metastasering. I gruppen 4-TOI, selvlysende avbildning funnet en vanlig, eksponensiell kurve etter dag 21. Seven prosentene av dyrene utviklet lokoregionalt utvidelse homolateral pleura som en videreutvikling av primærtumor. Ett dyr utviklet beinmetastaser (tabell 1, figur 2a). Overlevelsesanalyse viste at median overlevelse ikke ble oppnådd etter en oppfølging av 2 måneder i gruppe 1-SC og 3-SOI. I gruppe 2-POI, ble ingen overlevelse kurven plottet på grunn av perioperativ pleural seeding. I gruppen 4-TOI, median overlevelse var 40 dager (tabell 1, figur 2c). Histologisk undersøkelse viste SC runde svulster med en vanlig form, høy andel av udifferensiert karsinom, noen kapsel brudd, og få vaskulær eller lymfesystemet emboli i gruppe 1-SC. I gruppe 2-POI, jevn intraparenchymatous tumorer ble oppnådd, med en lav andel av udifferensiert karsinom, et høyt antall kapsulære brudd, og vaskulære eller lymfatiske emboli. I gruppe 3-SOI, uregelmessige intraparenchymatous tumorer ble oppnådd, med en lav andel av udifferensiert karsinom (+), kapsel brudd (++) og et høyt antall vaskulære eller lymfatiske emboli. Funnene var like i gruppe 4-TOI og gruppe 2-POI (figur 3, tabell 2).
a. Utviklingen av fotoner teller (uttrykt som 10
6 fotoner /s) over tid, fra dag 0 (implantasjon) til dag 63 (slutten av bioluminescent oppfølging). For hver gang, gjennomsnitt og standardavvik av dyrene i live blir rapportert. I gruppe 2-POI, perkutan injeksjon førte til pleural seeding i 53% av tilfellene, som postoperative røntgen viste kontrastmiddel i enten venstre pleural plass, rett pleurahulen (anatomiske kontinuum), eller begge deler. b. Representant utviklingen av bioluminescent signal, fra dag 14 til dag 42. I gruppe 2-POI, pleural seeding opprettet et signal plassert på høyre grunnlag av thorax, motsier med det primære målet for denne studien. Ingen senere oppfølging som er utført for denne gruppen. c. Overlevelse kurven fra tidspunktet for tumorimplantasjon til 2 måneder ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden og 95% konfidensintervall barer. Den to-måneders overlevelse er 100% i gruppe 1-SC, 40% i gruppe 3-SOI, og 65% i gruppe 4-TOI.
Operasjon orthotopic implantasjon (gruppe 3) resulterte i lokaliserte infiltrere svulster, mens perkutan orthotopic injeksjon (gruppe 2) og transpleural orthotopic injeksjon (gruppe 4) resulterte i lokaliserte avrundede knuter. Histologisk undersøkelse viste en høy andel av udifferensiert karsinom i gruppe 1-SC tumor, men en lav andel i 3 eksperimentelle grupper. Videre ble de 3 eksperimentelle grupper assosiert med mer kapsel ruptur og vaskulær emboli enn gruppe 1-SC.
Identifikasjon av CTCs
xenograft implantasjon priser var 100% i CTC gruppe 1 (SC, n = 6) og 60% i CTC gruppe 2 (TOI, n = 9). Tre Cellsearch® analyser ble utført i hver kontrollgruppe, og 6 Cellsearch® analyser ble utført i hver forsøksgruppe. Negative kontroller viste null eller en CD45-, DAPI +, CKPE + celle per analyse (data ikke vist). Positive kontroller viste en sammenheng mellom antall av tumorceller i oppløsning og den Cellsearch® CTC teller (figur 4a og 4b). I CTC gruppe 1-SC, 5-analyser (83%) var positive for CTCs deteksjon (CTCs nivå området 2-5, mener 2,5 ± 1,76). I CTC gruppe 2-TOI, 5 analyser var positive for CTCs deteksjon (CTCs nivåområde 2-21, mener 9,5 ± 9,35). Alle sammen, 3 uker etter tumor implantering, ble CTCs påvist i 83% av
nakne
mus med enten SC eller ortotopiske NSCLC tumorer (Figur 4c og 4d). Når man sammenligner grupper, forskjellen i CTC nivåer viste en trend mot statistisk signifikans (p = 0,058, figur 4c, tabell 2).
a. Representasjon av farging av sirkulerende celler ved hjelp av Cellsearch® analysen. CTC er definert som CD45-, DAPI +, og CKPE + celler. – Øvre linje: som en positiv kontroll, ble 50 og 500 A549luc celler analysert i en oppløsning inneholdende 600 ul av medium og 7 ml av friskt humant blod. Her, som et eksempel, både CD45-, DAPI +, CKPE + celler er tumorceller. – Bunnlinjen: representasjon av resultatene av de eksperimentelle gruppene. Her, som et eksempel, denne CD45-, DAPI +, CKPE + celle er en CTC. b. Korrelasjon mellom Cellsearch ® CTC telle og antallet tumorceller i oppløsning. Som kontroller, 0 (negativ kontroll), 50 og 500 (positive kontroller) A549luc celler ble analysert i en oppløsning inneholdende 600 ul av medium og 7 ml av friskt humant blod. Dette eksperimentet demonstrerte en korrelasjon mellom Cellsearch® CTC telling og antallet tumorceller i oppløsning (R «sup> 2 = 0,99857). c. Antall CTC henhold til den eksperimentelle gruppe, CTC gruppe 1 (SC) eller CTC gruppe 2 (ortotopisk). Den generelle positivitet av Cellsearch ® analysen er sammenlignbar i begge grupper (83%), med en tendens til at flere CTC på ortotopisk i stedet for i det subkutane modell. d. Representasjon av bioluminescent signal og antall CTC påvist i hver av de 12 dyrene.
Diskusjoner
Tumor implantasjonsstedet og metode konsekvenser svulst utvikling og kinetikk
Sammenligning SC, perkutan orthotopic injeksjon og kirurgiske ortotopiske implantasjon modeller med hensikt å avgrense oppfølging av tumorprogresjon å bruke selvlysende avbildning, møtte vi grensene for disse modellene, inkludert orgel avvik (SC), hyppig pleural seeding (perkutan orthotopic injeksjon) og høy perioperativ dødelighet (kirurgisk orthotopic implantasjon). Videre har ingen av disse modellene gi en pålitelig oppfølging av tumorprogresjon å bruke selvlysende bildebehandling. Derfor har vi utviklet en transpleural orthotopic injeksjon modell, som kombinerer lav perioperativ dødelighet, rimelig engraftment rente, knapphet på pleural seeding, og tumorprogresjon med metastaser som tumorprogresjon kan overvåkes ved bioluminescent bildebehandling. Videre gir denne studien identifisering av CTCs i murine modeller av NSCLC for første gang hittil. Vi mener at i tillegg funksjonell avbildning, vil programmet ved prekliniske in vivo stadium av CTCs bidra til å definere biomarkører av tumorbelastning og behandlingseffekt i senere kliniske studier.
SC xenoimplantater modeller
SC xenografter fra humane cellelinjer utvunnet i dyr med immunologiske forstyrrelser har vært gullstandarden prekliniske kreft eksperimenter i flere tiår [14]. Denne modellen presenteres flere fordeler, blant annet teknisk gjennomførbarhet (fravær av bedøvelse, enkle å utføre injeksjon) og tumor tilgjengelighet (direkte måling av SC svulsten slik at langsgående oppfølging). Imidlertid er SC modeller begrenset av uoverensstemmelse mellom xenograft sted vert microenvironnement, inkludert ekstracellulær matriks, parakrine signaler, og derfor ikke modell Pagefs «frø og jord» teori [22]. Dette avviket har blitt funnet å påvirke tumorrespons for cytotoksiske midler og strålebehandling [23], [24] og absolutt påvirke responsen fremstilling av nye anticancermidler. Dette avviket kan være av avgjørende betydning ved NSCLC var hypoksi og neoangiogenesis spille en viktig rolle i tumorprogresjon [25], og forekommer forskjellig i SC og intratorakale xenografter [26]. Sist, bare et mindretall av SC modeller formidle og fremgang til metastatisk scenen, fravær av progresjon fra lokalisert til metastatisk scenen gjennom lokoregionalt lymfeknute utvidelsen er derfor en stor begrensning av SC-modeller, mens den viktigste årsaken (2/3) av kreftdød er metastatisk sykdom.
Disse forskjellene har store implikasjoner tumorprogresjon, med få sirkulerende tumorceller og ingen metastaser i våre eksperimenter, peker en viktig grense for narkotika evaluering, med to risikoer. Den første Risikoen er til å skyve inn i klinikken et molekyl eller en medikamentkombinasjon med liten eller ingen effekt. Som et eksempel, har kombinasjonen av kjemoterapi og EGFR-hemmere bevist effekt i SC modeller av NSCLC [27], [28], men har aldri kommet betydelig effekt i kliniske studier inkludert uselekterte NSCLC pasienter ved EGFR status [3], [10] , [29]. Den andre risikoen er for å stoppe utviklingen av lovende narkotika. Som et eksempel, HIF-1alfa antagonist PX-478 viste ingen målbar aktivitet mot NSCLC SC xenotransplantater, men hemmet utviklingen og spredningen av ortotopisk human småcellet lungekreft og lunge adenokarsinom i mus, og til slutt testet i fase en prøve [30].
til sammen disse dataene tyder på at SC xenografter ikke er fullt tilstrekkelig for prekliniske studier av NSCLC, og bør bare brukes og analyseres nøye. Lignende konklusjoner har blitt trukket fra SCLC prekliniske narkotika testing [31].
Tidligere ortotopiske modeller
For å ta påvirkning av orgel spesifisitet og svulsten mikro environnement hensyn, ortotopiske modeller har blitt gradvis utviklet over de siste 20 årene, med det endelige målet å oppnå en enkelt intraparenchymatous lunge svulst som etterligner den kliniske situasjonen og tillate langsgående oppfølging. Intravenøs [32], intrabronkial [33] – [35] og intrapleural administrasjon [36], [37] av lungekreft cellelinjer resulterte i pleural lokalavansert eller flere synkrone svulster. Derfor kan disse modellene være interessant å studere disse spesielle situasjoner, men kan ikke bli utvidet til lokaliserte intrapulmonal NSCLC, som utgjør flertallet av NSCLC og grunnlaget for videre tumorprogresjon.
Genetisk modifiserte musemodeller (GEMMs) Det er også utviklet for å studere NSCLC i mus. Disse dyrene er vanligvis p53 mutert, favoriserer genetisk ustabilitet og tumordannelse, og utvikler lungesvulster drevet av EGFR [38], KRAS [39], PIK3CA [40], BRAF [41] onkogen aktivering eller nærvær av EML4-ALK-fusjons onkogenet [42]. KRAS muterte lungekreft kan observeres i musestammer bærer onkogene alleler av KRAS som kan aktiveres bare på en spontan rekombinasjon hendelse i hele dyret [43], eller etter KRAS sporadisk aktivisering gjennom Cre-lox mediert somatisk rekombinasjon etter adenovirus mediert levering av Cre recombinase i lunge epithelia [39]. Begge modellene tillate utvikling av KRAS-mutert lungekreft i en kort periode. Imidlertid er disse modellene begrenset av deres avstand til klinisk situasjon, som mutasjoner av en eller to onkogener eller tumorsuppressorgener er langt fra den flertrinns progresjon av lungekreft oppstår på underliggende kronisk betennelse. Videre GEMM modeller resultere i hundrevis av primær NSCLC i samme periode de er vanskelige å følge og å kvantifisere under preklinisk testing og ikke-invasiv bildediagnostikk. Til tross for disse ulempene, GEMM ha fordel å avgrense definisjonen av onkogener og ta immunrespons i betraktning. Nyere studier har rapportert at GEMM kan være av interesse når en skal studere effekten av felles NSCLC behandling [44].
Kirurgisk implantasjon av NSCLC fragment inn i lungene av immunsvikt mus via Thoracotomi ble først rapportert i 1992 [21], [45], [46].
