Abstract
MED30 er et viktig medlem av megler kompleks som danner et knutepunkt mellom transkripsjonsaktivatorer og RNA polymerase II. Imidlertid har uttrykk og roller MED30 vært dårlig karakterisert ved kreft. I denne studien undersøkte vi de funksjonelle rollene MED30 under magekreft progresjon. Det ble funnet at MED30 ble overuttrykt i magekreft vev og cellelinjer. Videre MED30 overekspresjon økt spredning, migrasjon og invasjon av magekreftceller, mens MED30 knockdown hemmet disse effektene. Videre knockdown betydelig hemmet tumorigenicity i SCID-mus. MED30 også fremmet uttrykk for gener relatert til epitel-mesenchymale overgang og induserte en fibroblast-lignende morfologi. Denne studien viser MED30 har patofysiologiske roller i spredning, migrasjon og invasjon av mage kreftceller og antyder at MED30 bør sees på som en potent terapeutisk mål for ondartet magekreft
Citation: Lee YJ, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh SO (2015) MED30 Regulerer spredning og motilitet av magekreft celler. PLoS ONE 10 (6): e0130826. doi: 10,1371 /journal.pone.0130826
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 22 september 2014; Godkjent: 26 mai 2015; Publisert: 25 juni 2015
Copyright: © 2015 Lee et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Bio Medisinsk teknologi Development Program (2012M3A9C6050213) og Basic Science Research Foundation (2012R1A1A3010521) av National Research Foundation (NRF) finansiert av den koreanske regjeringen (MEST) og et stipend fra National R D Program for Cancer Control, departementet for helse, velferd og familiedepartementet, republikken Korea (0920050). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de viktigste årsakene til kreft død på verdensbasis [1, 2]. Omtrent 95% av mage kreft er adenokarsinomer og i epidemiologiske studier magekreft har blitt klassifisert av anatomisk sted som Cardia /proksimale eller noncardia /distal [3] og ved histologisk fenotype som intestinal, diffuse, eller blandet /unclassifiable som beskrevet av Lauren [4 ]. Videre pasienter med proksimale magekreft har dårligere overlevelse uavhengig av TNM stadium [5].
Helicobacter pylori-infeksjon
har vist seg å være en etiologisk middel av gastrisk kreft, spesielt kreft som finnes i de distale magen hos eldre menn, som vanligvis er av tarmtypen. Mer nylig har flere molekylære klassifiseringer av magekreft blitt foreslått basert på resultatene av hel-genom genuttrykkstudier og /eller genkopitallet studier [6-10].
Transkripsjonell forskriften er et viktig skritt som styrer celleidentitet, vekst, differensiering og utvikling. Menneskelig mellommann (MED) kompleks, som inneholder ~ 30 proteiner, er en viktig coactivator /aktivator av uttrykkene av RNA polymerase II (Pol II) -transcribed gener [11]. MED kompleks letter forhånds initieringskomplekset (PIC) montering ved interaksjon med Pol II og gen-spesifikke transkripsjonsfaktorer (TFS), for eksempel, TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, og TFIIH [12, 13]. MED Komplekset består av tre forskjellige strukturelle submoduler (hode, middels og hale). Hodet modulen kommuniserer direkte med Pol II, mens den langstrakte hale modulen samhandler med gen-spesifikke regulatoriske proteiner [12, 13], og midt-modulen fungerer i reguleringssignaloverføring på en post-bindende stadium [13]. Selv om mekanismen ikke er fullt ut forstått, MED komplekset binder seg tett til Pol II, forandrer sin konformasjon og påvirker transkripsjonen initiering prosessen [14, 15]. Siden MED komplekset er en viktig del av transkripsjon maskiner, er de fleste av subenheter i kjernen av MED nødvendig for embryonal vekst og celle levedyktighet [16].
Kreft genomsekvense studier har rapportert mutasjoner eller endringer i RNA transkripsjon maskinkomponenter som finnes i mED underenheter, og korrelasjoner mellom noen av disse endringene i mED subenheter, (MED1, MED12, MED19, MED23, MED28, CDK8, og cyclin C) og kreft progresjon er rapportert for ulike kreftformer, selv om mekanismene som er ansvarlig for disse korrelasjoner er ukjent [17].
Nylig ble det rapportert at et MED19 kan delta i magekreft progresjon, som sin knockdown signifikant hemmet celleproliferasjon og kolonidannelse kapasitet, og induserte G1 fasecellesyklus-stans i to menneskelige mage kreft cellelinjer (SGC7901 og MGC803) [18]. Men de funksjonelle roller og patologisk relevansen av andre MED subenheter i magekreft fortsatt uklare.
I denne studien, for å avsløre den funksjonelle betydningen av MED30 under magekreft progresjon, undersøkte vi sine roller i spredning, migrasjon, invasjon og tumorigenicity av mage kreftceller. Før den funksjonelle undersøkelse, sjekket vi uttrykket mønster av MED30 i mage kreft celler og vev.
Materialer og metoder
Cellekulturer og transfeksjon
magekreft cellelinjer (SNU1 , SNU16, SNU216, SNU620, SNU638, og N87) ble kjøpt fra den koreanske cellelinje Bank (Seoul). Celler ble dyrket i RPMI1640 supplert med 25 mM HEPES, 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 pg /ml penicillin /streptomycin (1 x P /S) i 5% CO
2/95% luft ved 37 ° C. Cellene ble transfektert med siRNA hjelp DharmaFECT reagens 1 eller 3 (Dharmacon, Lafayette, CO), i henhold til produsentens instruksjoner. Sekvensene av siRNA ble brukt var som følger: MED30 siRNA (Bioneer, Daejeon, Korea), 5′-CGA GCA ACU UAU UCC AUA U (dTdT) -3 «, 5»-GCU GCC AAA UGG Ugu CAC U (dTdT) – 3 «, og 5′-CGA GAA AUU GCU GAA GUA A (dTdT) -3»; egge (SCR) siRNA (Dharmacon, Lafayette, CO), 5’GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3 «.
MED30 overekspresjon
For å konstruere MED30- løpet uttrykk vektor, brukte vi pLenti6.3-V5 /MÅL lentiviral vektor (Invitrogen, Carlsbad, California). Kort fortalt ble MED30 cDNA klonet inn pLenti6.3-V5 /MÅL vektor med
in vivo
rekombinasjon basert Gateway kloning system (Invitrogen). Donor vektor (pDONR221) som inneholder den kodende sekvensen av MED30 (MED30 cDNA) ble kjøpt fra Ultimate
TM ORF Clones (Invitrogen), og saman med kontra valgbar
CCDB
gen av Gateway reisemålet vektor pLenti6.3-V5 /MÅL bruker LR clonase enzymblanding (Invitrogen). Den tomme vektor pLenti6.3 /V5-MÅL ble brukt som en mock kontroll. Rekombinante lentiviruses ble produsert i 293ft celler, og brukes til å infisere SNU638 celler i henhold til produsentens instruksjoner (ViraPower Lentiviral Expression System, Invitrogen). Stabile cellelinjer ble etablert av valget med blasticidin (7,5 mikrogram /ml) (Invitrogen).
Real-Time PCR
magekreft vev ble oppnådd etter å ha innhentet skriftlig informert samtykke fra pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon ved Pusan National University Hospital eller Pusan National University Yangsan Hospital. Studien ble godkjent av Pusan National University Hospital-Institutional Review Board (PNUH-IRB) og Pusan National University Yangsan Hospital-Institutional Review Board (PNUYH-IRB). Total RNA ble ekstrahert fra vev eller celler ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen) eller RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert ved anvendelse av MMLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI), dNTP, og oligo-dT primere. Sekvensene til primerne som ble brukt var som følger: MED30, 5′-ACC GGT TAA CAA AGC TAC AGG A 3 «(sense) og 5′-TAA GTT GCT CGA CTG GAA TGG G-3» (antisense); CDH1, 5’TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC -3 «og 5’CTC AGC CCG AGT GGA AAT GG -3»; CDH2, 5’CAC TGT GGA GCC TGA TGC CA -3 «og 5’TCC CCA ATG TCT CCA GGG TG -3»; CDH3, 5’CCC CCA GAA GTA CGA GGC CC -3 «og 5’ACG CCA CGC TGG TGA GTT GG -3»; TWIST1, 5’CGG GAG TCC GCA GTC TTA -3 «og 5’TGG ATC TTG CTC AGC TTG TC -3»; TWIST2, 5’CTT ATG TTT GGG GGG AGG TT -3 «og 5’Tags CCA AGC AAT CAC GGA GA -3»; VIM, 5’TGA GTA CCG GAG ACA GGT GCA G -3 «og 5’Tags CAG CTT CAA CGG CAA AGT TC -3»; SNAI1, 5’GAG GCG GTG GCA GAC TAG -3 «og 5’GAC ACA TCG GTC AGA CCA G -3»; SNAI2, 5’Tags GAA GAG ATC TGC CAG AC -3 «og 5’CCC CAA GGC ACA TAC TGT TA -3»; GAPDH, 5’GCA GCC TCC CGC TTC GCT CT -3 «og 5’TGG TGA CCA GGC GCC CAA TAC G -3». Real-time PCR ble utført ved hjelp av en LightCycler
TM 96 Real-time PCR system (Roche, Nutley, NJ, USA) med Faststart Essential DNA Grønn Master (Roche), i henhold til produsentens instruksjoner. GAPDH ble benyttet som intern kontroll.
Western blot-analyse
Celler ble lysert med RIPA-buffer, protease-inhibitor cocktail ble tilsatt, og proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved bruk av Bio-Rad proteinanalysesett ( Bio-Rad, Hercules, CA). Prøver (80 pg /brønn) ble underkastet SDS-PAGE og deretter overført til PVDF-membraner. Anti-MED30 (1: 500, Protein Tech # 16787-1-AP, Chicago, IL), anti-E-cadherin (1: 1000, BD Bioscience # 610181, San Jose, CA), anti-N-cadherin (1 : 1000, BD Bioscience # 610920), anti-P-cadherin (1: 1000, BD Bioscience # 610227), anti-Twist1 /2 (1: 750, Santa Cruz Biotechnology # sc-15393, Santa Cruz, CA), anti -vimentin (1: 1000, DAKO # M7020, Carpentaria, CA) og anti-β-aktin (1: 2000, Santa Cruz Biotechnology # sc-47778) antistoffer ble fortynnet i 5% skummet melk og inkubert med membraner ved 4 ° C over natten. Den passende sekundært antistoff ble påført (1: 2000, pepperrot-peroksidase-konjugert anti-mus eller anti-kanin) ved romtemperatur i 1 time. Chemiluminescence deteksjon (GE Health Care, Little Chalfont, Storbritannia) ble brukt til å visualisere MED30, E-cadherin, N-cadherin, P-cadherin, Twist1, vimentin, og β-aktin. Western blot analyse ble utført i tre eksemplarer.
Immunohistochemistry
Tissue microarray seksjoner som inneholder mage kreft vev fra pasienter ble hentet fra SuperBiochip (Seoul). Histopatologiske diagnoser ble utført ved Avdeling for patologi, Pusan National University Hospital, og clinicopathologic iscenesettelse ble utført ved hjelp av TNM-klassifikasjon (AJCC, 7. utg.). Alle pasienter hadde histologisk bekreftet magekreft, og tumorprøver ble sjekket for å sikre at svulstvevet består mer enn 80% av prøvene. For immunhistokjemi, ble slides deparaffinized og rehydrert, behandlet med 0,3% hydrogenperoksid i 30 minutter for å stanse endogen peroksidase-aktivitet, og blokkert med 10% normalt esel serum (NDS) og 1% BSA i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Platene ble deretter inkubert over natten ved 4 ° C i blokkeringsbuffer inneholdende primære antistoff (anti-human MED30, 01:50, Proteintech). Sekundært antistoff (HRP-konjugert) binding ble utført ved en fortynning på 1: 200 i blokkeringsbuffer i 2 timer ved RT. Objektglass ble deretter farget for HRP (Vector Laboratories) og motfarget med hematoksylin farging buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 1 min. Prosenter av celler som farget for MED30 i seksjonene ble bestemt og delene ble deretter gradert bruker en 1-4 skala (1, 24%, 2, 25-49%, 3, 50-74%, 4, 75-100% ). Intensiteter av tumorcelle-farging ble gradert som 0, 1, 2 eller 3, som tilsvarte basal, svak, moderat og sterk respektivt. Samlet farging ble deretter representert ved sammensatte scorene som ble beregnet ved å multiplisere disse to karakterene. Følgelig samlet farget ble gradert fra 0 til 12.
Celleproliferering analysen
For å undersøke effekten av siRNA på spredning av magekreftceller, ble kulturmedier erstattet med 1% FBS medium en dag etter den siRNA transfeksjon. Fem dager etter transfeksjon, ble 10 ul Ez-Cytox (ITSBIO, Seoul) tilsatt og cellene ble inkubert i 0,5 til 2 timer under vanlige kulturbetingelser. Deretter ble absorbansen ble målt ved 450 nm ved anvendelse av en ELISA-leser (TECAN, Mannedorf, Sveits). For å undersøke effekten av MED30 overekspresjon, ble cellene sådd ut i 1% FBS medium. Tre dager etter såing 10 ul Ez-Cytox ble lagt.
Boyden kammeret analysen
Den nederste kammer av en transwell kammeret ble fylt med medium som inneholdt 10% FBS. En dag etter transfeksjon med egge (SCR) eller MED30 siRNA, ble magekreftceller podet inn i det øvre kammer ved en tetthet på 5 x 10
5 celler /ml i 50 ul serumfritt medium. For å undersøke effekten av MED30 overekspresjon, ble celler (mock og MED30-eldre) sådd ut i en tetthet 1 × 10
5 celler /ml. For å eliminere spredning forbundet effekter, mitomycin C (0,01 ng /ml, Sigma-Aldrich) tilsatt. Celler ble tillatt å migrere til fire eller seks timer. Membranene ble deretter fiksert og farget ved hjelp av Diff-quik løsning (Sysmex, Kobe, Japan) og vasket med destillert vann. Celle tall i 10 tilfeldig utvalgte felt ble telt ved hjelp av et lysmikroskop.
Matrigel invasjonen assay
Evnen til mage kreft celler til å invadere ble undersøkt ved hjelp av 24-brønns BioCoat
TM Matrigel
TM kammerinnsatser (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Den øvre overflate av innstikk i invasjons kamre ble belagt med 0,5 mg /ml vekstfaktor-redusert Matrigel (BD Bioscience) og bunnflaten med 0,5 mg /ml fibronektin (Sigma-Aldrich). En dag etter transfeksjon med SCR eller MED30 siRNA, ble cellene sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /ml i serumfritt medium i 8-um porøse BioCoat Matrigel chamber innlegg, og plassert i brønner fylt med 750 ul av medium supplert med 10% FBS som et kjemotiltrekkende. For å undersøke effekten av MED30 overekspresjon, celler (mock og MED30-overekspresjon celler) ble sådd ut i en tetthet 1 × 10
4 celler /ml. For å fjerne spredning assosierte effekter, mitomycin C (0,01 ng /ml, Sigma-Aldrich) ble tilsatt. Etter inkubasjon i 24 timer, ble ikke-invaderende celler på toppen flater av membraner fjernes ved skraping. Invaderende celler på bunnflater ble fikset, og farget med Diff-quik løsning. Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer, og minst 5 felt ble telt per eksperiment.
Xenotransplantat analysen
SNU638 celler ble transfektert med SCR eller MED30 siRNA. Etter 2 dager ble cellene oppsamlet ved trypsinering, vasket to ganger med PBS, og ble injisert subkutant (1 x 10
6-celler i 100 ul PBS) inn i alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus. Tumorvolumer ble beregnet hver uke fra uke tre til uke syv etter injeksjon ved hjelp av følgende formel: tumor volum (mm
3) = (
en
×
b
2 ) /2, der
en
= lengde i mm og
b
= bredde i mm. På syv uker, ble musene avlivet og tumorvolum og vekt ble registrert. Dette eksperimentet ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr utstedt av National Institute of Health. Den Pusan National University Institutional Animal Care og bruk Committee (PNUIACUC) godkjente forsøksprotokoll.
Statistisk analyse
Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SDS. Den parametriske Mann-Whitney U-test eller t-test (uparede) ble anvendt for å bestemme de betydninger av forskjeller mellom gjennomsnittsverdiene til to grupper, og en-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Tukey største multiple sammenligninger ble brukt å analysere tre eller flere grupper. * Indikerer en
P
verdien av 0,05. Overlevelsestiden ble definert som den tid som er gått mellom behandling og død eller inntil den siste målet oppfølgingsinformasjon ble oppnådd. Kaplan-Meier-metoden ble brukt for å bestemme forholdet mellom overlevelse og MED30 uttrykk. Kurver ble sammenlignet med log-rank test på et signifikansnivå på 95%.
P
verdier av 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Data ble analysert ved hjelp av SPSS programvare versjon 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Resultater
Overuttrykte MED30 i mage kreft vev
For å undersøke roller ved MED30 i magekreft, vi først undersøkte uttrykk statusen MED30 i tumorvev av 23 mage kreftpasienter. MED30 protein ble funnet å være mye overuttrykt i kreftvev regioner (fig 1A-1D), og er åpenbart overuttrykkes i invaderende magecancerceller (figur 1C) og i metastatiske kreftceller inne påvirkede lymfeknuter (Fig 1 D). For å validere våre immunhistokjemi resultater, utførte vi kvantitativ real-time PCR på mage kreft vev ved hjelp MED30-spesifikke primere. Som vist i figur 1F, ble DPY30 overuttrykt i 10 tilfeller (10/23, 43%). Vi har også undersøkt uttrykk mønster av MED30 i magekreft cellelinjer ved real-time PCR, og fant det å være overuttrykt i fem av mage kreft cellelinjer som ble testet (unntatt SNU1) versus normale mage vev (Fig 1E). For å undersøke sammenhengen mellom MED30 uttrykk og kliniske kjennetegn, utførte vi immunhistokjemi bruker 41 mage kreft vevsprøver (tabell 1). Interessant, ekspresjonen av MED30 positivt korrelert med N trinn (figur 1G), men ikke med pasientoverlevelse (data ikke vist).
(AD) Immunhistokjemisk farging viste at overekspresjon av MED30 i magekreft vev (BD) versus normale gastriske slimhinne (A). Dens overekspresjon ble observert i invadere kreftceller (C) og metastatisk kreft celler nærliggende lymfeknuter (D) i tillegg til den primære kreft området (B). (E) overekspresjon av MED30 i magekreftceller ble bestemt ved real-time PCR med spesifikke primere (NT; normalt vev). GAPDH ble brukt til å normalisere alle opplysninger. Verdier er gjennomsnitt ± SDS av de tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *,
p
0.01 (Student
t
test, kontra NT). (F) overekspresjon av MED30 i mage kreft vev ble undersøkt ved real-time PCR med spesifikke primere. GAPDH ble brukt til å normalisere alle opplysninger. Verdier er gjennomsnitt ± SDS av de tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *,
p
0,01; **,
p
0.05 (Student
t
test, mot normale mage vev). (G) MED30 protein ekspresjon i høyere N stadier (N trinnene 2 og 3) var signifikant større enn i lavere N stadier (N stadium 0, 1) (N = 41,
p
0,05, mann- Whitney U-test).
roller av MED30 i spredning, migrasjon og invasjon av magekreftceller
for å undersøke roller MED30 i magekreftutvikling, vi undersøkte effekter av MED30 knockdown eller overekspresjon på spredning, migrasjon og invasjon av de seks magekreft cellelinjer (SNU1, SNUI16, SNU216, SNU620, SNU638, og NCI-N87 celler). Real-time PCR og Western blot ble brukt til å analysere knockdown og overekspresjon av MED30 i SNU216 og SNU638 celler (figur 2A-2C). Når disse cellene ble transfektert med MED30 siRNA (100 nM), MED30 ekspresjon redusert på protein og mRNA-nivåer med ca. 80% to dager senere, sammenlignet med SCR siRNA, og MED30 overekspresjon av cDNA-transfeksjon økt MED30 mRNA og proteinnivåene sammenlignet med tom kontroll vektor- transfekterte celler (mock-celler) med mer enn tre ganger.
Gastric kreftceller (SNU216 og SNU638) ble tilført med MED30 siRNA (100 nM) eller kryptert (SCR) siRNA. MED30 knockdown effektivitet ble bestemt ved western blot (A) og real-time PCR (C) ved 48 timer etter transfeksjon. MED30 uttrykk ble også undersøkt i celler som stabilt overuttrykker MED30 (MED30-over) og i tomme kontroll vektor-transfektert (Mock) celler. (B) MED30 protein nivå i forhold til p-aktin ble kvantifisert ved hjelp av Multi Gauge V3.1 programvare. Verdier indikerer MED30 til p-aktin bånd intensitetsforhold og er i gjennomsnitt ± SDS av tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *,
p
0.01 (Student
t
test, versus SCR eller Mock). (D) Effekt av MED30 knockdown eller overekspresjon på spredning av magekreftceller (SNU16, SNU216, SNU620, og SNU638). For å sjekke effekten av MED30 knockdown, fem dager etter transfeksjon med 100 nM MED30 siRNA eller SCR siRNA, ble celleviabilitet analyser utført, og for å undersøke effekten av MED30 overekspresjon, ble celleviabilitet analyser utført etter 3 dagers inkubasjon. Verdiene er gjennomsnitt ± SDS av tre uavhengige eksperimenter utført i fire paralleller. *,
p
0.01 (Student
t
test, versus SCR eller Mock).
Vi neste undersøkt hvilken rolle MED30 i spredning av kreftceller. Proliferasjonsanalyser ble utført 5 dager etter transfeksjon med SCR eller MED30 siRNA. Knockdown av MED30 hemmet de proliferations av alle gastrisk kreftceller som ble testet (SNU16, SNU216, SNU620, og SNU638) versus SCR med 18%, 68%, 98% og 42%, respektivt (figur 2D). Lignende resultater ble observert når vi utførte proliferasjonsanalyser to eller tre dager etter transfeksjon (data ikke vist). Konsekvent, MED30 overekspresjon forbedret vekster SNU216 og SNU638 celler med 1,9 og 2,2 ganger, sammenlignet mock celler.
For å finne ut hvilken rolle MED30 i migrasjon av magekreftceller, brukte vi en Boyden kammer analyse. Knockdown av MED30 redusert FBS-induserte overføringer av SNU216 og SNU638 celler ved 90% og 52%, respektivt, sammenlignet med SCR-transfekterte celler (figur 3A og 3C). Videre MED30 overekspresjon økte FBS-indusert migrering av SNU216 og SNU638 celler med 3,2 og 2,8 ganger, sammenlignet mock celler (figur 3B og 3C). Disse resultatene førte oss til å undersøke hvilken rolle MED30 i invasjonen av mage kreftceller. I en Matrigel invasjonen assay, MED30 siRNA hemmet FBS-indusert invasjoner av SNU216 og SNU638 celler versus SCR siRNA med 64% og 47%, henholdsvis (figur 4A og 4C), og MED30 overekspresjon akselerert de FBS-indusert invasjoner av SNU216 og SNU638 celler versus mock celler ved 2,5 og 2,2 ganger i henholdsvis (figur 4B og 4C).
Cellemigrering migrering~~POS=HEADCOMP ble evaluert ved anvendelse av en Boyden kammer analyse som beskrevet i «Materialer og metoder». (A) MED30 knockdown med MED30 siRNA vesentlig hemmet FBS-indusert migrering av SNU216 og SNU638 celler sammenlignet med SCR siRNA. (B) MED30 overekspresjon (MED30-over) betydelig økt migrasjon i forhold til mock-kontroll. (C) migrerte celler ble talt opp og resultatene er presentert som et søylediagram. Verdiene er gjennomsnitt ± SDS av tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *,
p
0.01 (Student
t
test, versus SCR eller Mock). Bar; 100 mikrometer.
Cell invasjonen ble undersøkt ved hjelp av en Matrigel invasjonen assay. (A) knockdown av MED30 vesentlig hemmet FBS-indusert invasjoner av SNU216 og SNU638 celler sammenlignet med SCR siRNA. (B) MED30 overekspresjon (MED30-over) forbedret celle invasjon sammenlignet med mock kontroll. (C) invaderte celler ble tellet, og resultatene er presentert som et søylediagram. Verdiene er gjennomsnitt ± SDS av tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *,
p
0.01 (Student
t
test, versus SCR eller Mock). Bar; 100 mikrometer.
Effekt av MED30 knockdown på
in vivo
tumorigenicity
For å undersøke effekten av MED30 på tumorvekst, vi subkutant injisert SNU638 celler transfektert med SCR eller MED30 siRNA inn i SCID-mus, og deretter overvåket tumorvekst i syv uker (fig 5A). Håndgripelig svulster ble oppdaget i løpet av tre uker i SCR kontroll sider. Men kreftceller transfektert med MED30 siRNA viste lavere vekst. Syv uker etter injeksjon ble musene avlivet, og tumorvolumer og vekter ble målt (figur 5B og 5C). Resultatene viste MED30 knockdown betydelig redusert tumorvolum og vekter.
(A) SNU638 celler ble transfektert med MED30 eller SCR siRNA og deretter injisert subkutant i to områder per mus. Tumor volum ble målt ukentlig fra uke 3-7 etter injeksjonen. Ved uke syv, ble musene avlivet og tumorvolumene (B) og vekter (C) ble målt. Verdiene er gjennomsnitt ± SDS av tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *,
p
0,01, **
p
0.05 (Student
t
test eller enveis ANOVA, versus SCR eller Mock celler).
Regulering av EMT veien ved MED30
For å finne mekanismen bak den fremming av magekreftutvikling ved MED30, undersøkte vi de uttrykk mønstre av gener involvert i epitel-mesenchymale overgang (EMT: en viktig prosess i metastase og invasjon) ved real-time PCR. Knockdown av MED30 noe økt nivå av E-cadherin (CDH1) mRNA i SNU638 celler versus SCR transfeksjon, men redusert uttrykk for N-cadherin (CDH2), P-cadherin (CDH3) og vimentin (VIM) med 42%, 36% og 41%, respektivt (figur 6A). Konsekvent, redusert MED30 overekspresjon CDH1 mRNA nivåer med 35% i forhold til mock-celler, men økte uttrykk for N-cadherin (CDH2), P-cadherin (CDH3), vri familie bHLH transkripsjonsfaktor 1 og 2 (TWIST1 /2), og vimentin (VIM) med 2,9, 3,3, 3,4, 2,4, 2,2, og 4,2 ganger i henholdsvis (figur 6A). MRNA nivåene av snegle familie sink finger 1 og 2 (SNAI1 /2) var uendret. Vi bekreftet at MED30 overekspresjon også økt proteinnivå E-cadherin, N-cadherin, P-cadherin, Twist1, og vimentin (fig 6B). En undersøkelse av morfologien av SNU638 celler viste at MED30 overekspresjon utløste en overgang fra et brostein-lignende til en langstrakt fibroblast-lignende morfologi (figur 6C), mens MED30 knockdown ikke endret morfologi (data ikke vist). Disse resultatene tyder på at MED30 positivt regulerer EMT.
Real-time PCR (A) og western blot analyse (B) av E-cadherin (CDH1), N-cadherin (CDH2), P-cadherin (CDH3) , vri familie bHLH transkripsjonsfaktor 1 (TWIST1 /2), vimentin (VIM), og sneglen familie sink finger 1 og 2 (SNAI1 /2) ble utført etter knockdown eller overekspresjon av MED30 i SNU638 celler. GAPDH og β-actin ble brukt som henholdsvis intern kontroll for real-time PCR og Western blot analyse. Verdiene er gjennomsnitt ± SDS av tre uavhengige eksperimenter utført i fire paralleller. *,
p
0,01, **
p
0.05 (Student
t
test, versus Mock). (C) SNU638 celler (MED30 over og mock) ble dyrket i medium som inneholdt 10% FBS. Etter 2 dager med kultur, ble morfologi av mock og MED30-overekspresjon celler observert av lyse felt mikroskopi.
Diskusjoner
De funksjonelle roller MED subenheten MED30 (også kjent som TRAP25) er dårlig forstått. I en fersk rapport, ble MED30 funnet å spille en betydelig rolle i å regulere mitokondrie funksjoner og integritet i homozygot mus [19]. I denne studien undersøkte vi de funksjonelle rollene MED30 under magekreft progresjon. Det ble funnet MED30 regulert spredning, migrasjon og invasjon av mage kreftceller og deres
in vivo
tumorigenicity. Etter å sikre knockdown og overekspresjon effektiviteten av kvantitativ real-time PCR og Western blot analyse (figur 2), fant vi at MED30 knockdown bemerkelsesverdig undertrykt spredning, migrasjon og invasjon av magekreftceller, og at MED30 overekspresjon hadde motsatt effekt (figurene 2-4). Videre MED30 knockdown redusert
in vivo
tumorigenicity (fig 5). Videre fant vi også at MED30 ble overuttrykt i mage kreft vev og mage kreft cellelinjer (fig 1). Disse resultatene tyder på at MED30 kan spille viktige roller under patofysiologiske magekreftutvikling.
Siden spesifikke MED-subenheter er forbundet med signal-aktiverte transkripsjonsfaktorer og RNA polymerase II (Pol II) [20] og fungerer som ledninger og integratorer for kanalisering forskjellige signalbaner, for eksempel, den nukleære hormonreseptorer svei (via MED1) [21], TGF-β-signalveien (via MED12 eller MED15) [22, 23], Wnt-signalveien (via MED12) [ ,,,0],24], og Ras-MAPK signalveien (via MED23) [25-27]. Det ble foreslått at disse signalveier kan indusere EMT [28-32], som er kjent for å være assosiert med metastase, invasjon, proliferasjon, og chemoresistance av epitelial kreft [29, 33, 34]. Derfor spurte vi om MED30 utløser EMT. MED30 induserte uttrykket av EMT-relaterte gener (N-cadherin, CDH2, P-cadherin, CDH3, vri relatert protein 1 og 2; TWIST1 /2, vimentin, VIM), men hemmet ekspresjon av E-cadherin (CDH1) en kjent tumor suppressor (fig 6A og 6B). Videre MED30 overekspresjon induserte en fibroblast-lignende morfologi (Fig 6C), noe som antyder MED30 utløser EMT i magekreftceller.
Oppsummering, denne studien støtter forestillingen om at MED30 fungerer som et onkogen under magekreftutvikling og foreslår MED30 kan regulere EMT i magekreft. Selv om videre studier er nødvendig for å fastslå hvordan MED30 utløser EMT, våre resultater tyder på at MED30 anses som en roman molekylære mål for behandling av magekreft.
Takk
Dette arbeidet ble støttet av Bio Medisinsk teknologi Development Program (2012M3A9C6050213) og Basic Science Research Foundation (2012R1A1A3010521) av National Research Foundation (NRF) finansiert av den koreanske regjeringen (MEST), og med et stipend fra National R D Program for Cancer Control, departementet for helse Velferd og familiedepartementet, republikken Korea (0.920.050).
