Abstract
plumbagin, en quinonoid funnet i planter av hinnebegerfamilien, besitter medisinske egenskaper. I denne studien undersøkte vi den anti-proliferative og apoptotiske aktivitet av plumbagin ved hjelp av to humane koloncancercellelinjer, HT29 og HCT15. IC50 av plumbagin for HCT15 og HT29-celler (22,5 pM og 62,5 pM henholdsvis) var signifikant forskjellig. For å undersøke responsen av kreftceller i løpet av behandlingsstrategier, ble cellene behandlet med to forskjellige konsentrasjoner, 15 uM, 30 uM for HCT15 og 50 uM, 75 uM for HT29-celler. Selv om aktivering av NFkB, Kaspaser-3, forhøyede nivåer av
TNF-α
, cytosolic Cytokrom C ble sett i begge HCT15 celler HT29 behandlet med plumbagin, avvikende apoptose med redusert nivå av pEGFR, Pakt, pGsk-3β, PCNA og Cyclin D1was kun observert på 15 mikrometer og 30 mikrometer plumbagin behandlet HCT15 og 75 mikrometer plumbagin behandlet HT29 celler. Dette tyder på at plumbagin induserer apoptose i både HCT15 HT29-celler og behandlet, mens, proliferasjon ble inhibert bare på 15 uM og 30 uM plumbagin behandlet HCT15 og 75 uM plumbagin behandlede HT29-celler, men ikke i 50 uM plumbagin behandlede HT29-celler. Ekspresjon av COX-2 ble redusert i 75 mM plumbagin behandlede HT29-celler når sammenlignet med 50 uM plumbagin behandlede HT29-celler, mens HCT15 cellene mangler COX. Derav den observerte motstand til induksjon av apoptose i 50 uM plumbagin behandlede HT29-celler er knyttet til ekspresjon av COX-2. I konklusjonen, induserer plumbagin apoptose i tykktarmskreftceller gjennom TNF-α mediert vei avhengig uttrykk for COX-2 uttrykk
Citation. Subramaniya BR, Srinivasan G, Mohammed Sadullah SS, Davis N, Baddi Reddi Subhadara L , Halagowder D, et al. (2011) apoptose induserende effekten av plumbagin på Kolon kreft celler Avhenger Uttrykk for COX-2. PLoS ONE 6 (4): e18695. doi: 10,1371 /journal.pone.0018695
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 17 desember 2010; Godkjent: 09.03.2011; Publisert: 29 april 2011
Copyright: © 2011 Subaramaniya et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en bevilgning fra National medisinplanter brett, Government of India, til Dr. S. Niranjali Devaraj. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en primær offentlig helse bekymring til menneskeheten, og er den tredje vanligste kreftformen i USA [1]. Nyere data om tykktarmskreft er alarmerende med anslagsvis 153,760 tilfeller av CRC inkludert 52,180 dødsfall i 2007 [1], [2]. Progresjon fra normale colonic epithelial celler inn i en kolorektal karsinom er en flertrinns prosess. Selv om det mange faktorer som, tap eller mutasjon i tumorsuppressorgener, epigenetiske forandringer kontrollerende celle overlevelse, celleproliferasjon og angiogenese, inflammasjon spiller en avgjørende rolle i CRC utvikling og progresjon [3] -. [8]
NF-kB er en viktig inflammatorisk megler involvert i initiering, progresjon og metastasering av CRC [9]. En rekke kreftfremkallende og tumorpromotorer har vist seg å aktivere NF-kB og konstitutiv ekspresjon av NF-kB er ofte funnet i tumorceller. Flere gener som er involvert i startfasen, forfremmelse, og metastase er regulert av NF-kB samt aktivering av NF-kB undertrykker apoptose og fremmer spredning. Derfor midler som kan ned-regulere aktiveringen av NF-kB og derfor vil ha potensiale til å hemme utvikling av kreft.
plumbagin (5-hydroksy-2-metyl-1,4-naftokinon), en quinonoid, som finnes i planter av hinnebegerfamilien, soldoggfamilien, Ancestrocladaceae, og dioncophyllaceae familier. Sjefen kilden plumbagin er roten til
Plumbago zeylanica
L. (også kjent som «Chitrak»). Plumbagin har vist seg å utøve anticarcinogenic, antiaterosklerotiske og antimikrobielle effekter [10] – [13]. Roten av
P. zeylanica
L. har vært brukt i indisk medisin for ~2,750 år og dens komponent besitter antiatherogenic, cardiotonic, hepatoprotektiv og nervecellene egenskaper [11].
Sugie et al. [14] har vist at plumbagin betydelig hemmet azoxymethane-indusert tarm karsinogenese hos rotter, noe som tyder på sin chemopreventive aktivitet. Plumbagin har også blitt vist å indusere S-G2 /M cellesyklus-stans gjennom induksjon av p21 (en inhibitor av cyklin-avhengig kinase) [15]. Nyere studier viser at plumbagin induserer apoptose gjennom hemming av NF-kB i ulike kreftcellelinjer inkludert menneskelige kronisk myelogen leukemi, menneskelig multippelt myelom, humane embryonale nyrekreft og brystkreft celler [16], [17]. I denne studien undersøkte vi den anti-proliferative og apoptotiske aktivitet av plumbagin av
in vitro
eksperimentelle modeller med to menneskelige colonic kreft cellelinjer, HT29 og HCT15. Videre mekanismen for anticancer aktivitet av plumbagin ble etablert ved å analysere cellesyklus regulering og signalmolekyler knyttet til celle overlevelse og apoptose.
Materialer og metoder
Cellekultur og vedlikehold
Menneske kolon tumorcellelinjer HT29 og HCT15 ble innhentet fra NCCer Pune. Celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, Gibco BRL, Tyskland) supplert med 10% FBS (Sigma, USA), 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 10-20 ug /ml fungisone (Himedia, India ), pH 7,4 i 25 cm
2, vevskulturflasker (Himedia, India) ved 37 ° C under 5% CO
2 og 95% luft.
Behandling
plumbagin ble kjøpt fra Sigma. En 100 mM løsning av plumbagin ble fremstilt i dimetylsulfoksyd (DMSO), lagret som små alikvoter ved -20 ° C og deretter fortynnet etter behov i cellekulturmedium. Dose-responsundersøkelser ble utført for å bestemme den passende dose for inhibering av cellevekst og induksjon av apoptose.
MTT-analysen
sensitivitet på HT29-celler og HCT15 til plumbagin ble bestemt ved MTT kolorimetrisk analyse [18]. -Celler (1 x 10
3 per brønn) ble sådd ut i en flatbunnet 96-brønns plate og inkubert i 24 timer ved 37 ° C og i 5% CO2. Begge cellelinjene ble utsatt for plumbagin (1, 2,5, og 5 uM i 24 timer). De løsningsmiddel-DMSO behandlede cellene tjente som kontroll. Cellene ble deretter behandlet med MTT-reagens (10 ul /brønn) i 4 timer ved 37 ° C og deretter isopropanol (100 ul) ble tilsatt til hver brønn for å oppløse de formazankrystaller. Den optiske tetthet (OD) ble målt ved 570 nm i en mikroplateleser. Andel av rest celle levedyktighet ble bestemt som [1- (OD av behandlede celler /OD av kontrollceller)] × 100.
Effekt av plumbagin på PBMC
PBMC ble isolert fra heparinisert veneblod oppnådd fra en frisk frivillig menneske ved hjelp av Ficoll-Paque (Histopaque 1077, Sigma Aldrich Inc., USA) tetthetsgradient-sentrifugering i henhold til standard prosedyre [19]. PBMC (1 x 105 celler /brønn) ble dyrket i komplett RPMI-1640 medium som vanlig og inkubert med plumbagin i 48 timer fulgt av MTT-analyse.
cellesyklusanalyse ved hjelp av strømningscytometri
Både HT29 og HCT15 celler ble sådd i en 6-brønn plate med en tetthet på 1 x 10
5 celler per brønn. Cellene ble trypsinert og høstet ved sentrifugering ved 1700
g
. Strømningscytometrisk analyse av cellesyklusen ble utført ved farging av permeabiliserte celler med propidiumjodid (PI) for DNA-innhold. Celler ble resuspendert i PBS, fiksert med 70% etanol, farget med PI-oppløsning (0,05 mg /ml PI, 2 mg /ml RNase A, 0,1% TritonX-100 i PBS) og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur (RT) i mørke. Fluorescensintensitet ble målt ved flow-cytometri (Becton-Dickinso) ved hjelp av eksitasjons- og emisjonsbølgelengder på 488 og 525 nm, respektivt. Alle forsøkene ble utført in triplo.
Comet assay
komet Analysen ble utført i henhold til metoden av Singh et al. (1988) [20] med mindre modifikasjoner. HT29 og HCT15 celler (5 x 10
5) ble utsådd i 24-brønners plater og utsatt for de ønskede konsentrasjoner av plumbagin (sluttkonsentrasjonen av DMSO ikke overstige 0,1%, ble kontroller samtidig behandlet med 0,1% DMSO) av spesifiserte tidsperioder. Etter behandling ble cellene pelletert ved sentrifugering ved 1500 rpm. Pelleten ble resuspendert i 60 ul PBS (pH 7,4). 10 ul av cellesuspensjonen ble blandet med 100 ul av 1% lavtsmeltende agarose og 75 ul av denne celle-agarose blanding ble spredd på mikroskopiske objektglass forbelagt med 1% agarose. Et tredje lag av 0,5% lavtsmeltende agarose (75 ul) ble påført over laget av agarose med cellesuspensjonen. Platene ble inkubert i 1 time i en lyseringsoppløsning (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X-100, 1% SDS, pH 10). Deretter ble cellene utsatt for en alkalisk buffer (300 mM NaOH, 1 mM dinatrium-EDTA) i 30 min. De mikroskopiske objektglass ble underkastet elektroforese på 0,8 V /cm-1 i 30 minutter, hvoretter objektglass ble neddykket i en nøytralisering buffer (0,4 M Tris, pH 7,5) i 15 min. Etter farging med etidiumbromid (20 ug /ml) ble objektglassene analysert under et fluorescens mikroskop (Nikon PCM-2000). Bilder av minst 50 celler fra tre lysbilder ble analysert ved hjelp Cometscore ™ programvare. For hver komet to områdene ble valgt: hele mobilnettet DNA og et område med bare hodet regionen av kometen. I hvert valg tettheter ble målt, og resultatene ble presentert som hale øyeblikk definert som resultat av prosentandelen av DNA i halen multiplisert med halelengden.
Isolering av RNA
For fremstillingen av total RNA, fenolen – ble guanidiniumtiocyanat basert Tri-reagens (Genei ™, Bangalore) anvendt. Til 10
7-celler, ble 1 ml tri-reagens ble tilsatt og lysert ved gjentatt pipettering og fikk stå i 5 minutter etterfulgt av tilsetning av 200 ul kloroform for faseseparasjon .Vigorously vortex-blandet i 15 sekunder og fikk stå i 15 min, fulgt av sentrifugering ved 12000 g i 15 min ved 4 ° C. Det øvre vandige lag inneholdende RNA ble overført til et friskt sterilt DEPC behandlet mikrosentrifugerør. Til dette ble 500 ul iskald isopropanol tilsatt, forsiktig blandet og fikk stå i 10 minutter og sentrifugert ved 12 000 g i 15 min ved 4 ° C. Supernatanten ble kastet, og den RNA-pelleten ble vasket med 1 ml 75% etanol i DEPC behandlet vann og igjen sentrifugert ved 14 000 g i 10 min ved 4 ° C for å få total RNA. Denne pellet ble oppløst i 25 ul sterilt RNase fritt vann ved oppvarming ved 55 ° C i 20 minutter og lagret ved -20 ° C inntil bruk.
Revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
for å syntetisere cDNA, en reverstranskripsjonsreaksjonsløsning inneholdende 1,0 ug total RNA i RNase /DNase-fri vann og 1,5 pl av tilfeldig heksamer primer (GeNeiTM, Bangalore) ble inkubert i 10 minutter ved 72 ° C og avkjølt umiddelbart. Til dette 5,0 mL ferdigblandet 10 mM dNTP løsning (GeNeiTM, Bangalore), 3,0 ul 10 × M-MLV revers transkriptase buffer (GeNeiTM, Bangalore), 1,0 mL (200 enheter /ul) M-MLV revers transkriptase (GeNeiTM, Bangalore) ble tilsatt og gjort opp til 50 fil ved hjelp av steril RNase /DNase-fritt vann.
for å forsterke cDNA, polymerase chain reaction (PCR) klar mix (GeNeiTM, Bangalore) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Alle PCR-prøver ble denaturert ved 94 ° C i 5 minutter før sykling og ble forlenget i 10 minutter ved 72 ° C etter sykling. PCR-analyse ved anvendelse av primere ble utført i 39 sykluser ved 94 ° C i 60 s, 60 ° C i 60 s, og 72 ° C i 60 sek. Primere for GAPDH, COX-2, TNF-α vist i tabell 1. primere ble utformet ved hjelp primer3 programvare tilgjengelig gratis på https://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm og nukleinsyre sekvensen ble vist fra https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fci?val=Reference ID Table. Primerne ble kjøpt fra Integrated DNA-teknologi, USA. Videre uttrykk for COX-2 og TNF-α ble analysert semi kvantitativt ved hjelp av FN SCAN IT-programvare.
Isolering av protein
Til 0,5 ml fenol-etanol supernatant, 3 volumer av aceton ble tilsatt for å felle proteiner. Prøvene ble blandet ved inversjon i 10-15 sekunder for å oppnå en homogen oppløsning og fikk stå i 10 minutter ved romtemperatur. Protein ble utfelt ved sentrifugering ved 12.000 g i 10 min ved 4 ° C. Supernatanten ble fjernet og pelleten dispergert i 0,5 ml av 0,3 M guanidin-hydroklorid i 95% etanol med 2,5% glycerol (V:V). Etter dispergering av pellet, ble en annen 0,5 ml aliquot av guanidinhydroklorid /etanol /glyserol vaskeløsning tilsatt til prøven og lagret i 10 min ved romtemperatur. Protein ble pelletert ved 8000 g i 5 min ved 4 ° C. Vaskeløsningen ble fjernet og ytterligere to vaskinger ble utført i 1 ml hver av guanidin /etanol /glyserol vaskeløsning. Siste vask ble utført med 1 ml etanol inneholdende 2,5% glycerol (V:V). Protein ble pelletert ved sentrifugering ved 8000 g i 10 min ved 4 ° C og lufttørket i 5 min. Etter en kort luft-tørking ble proteinet pelleten oppløst i 1% SDS. Proteinkonsentrasjoner av cellelysater ble estimert i henhold til Lowry et al., 1951 [21] og like konsentrasjoner av proteinfraksjonen ble kjørt på natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og immunobloted med spesifikke antistoffer.
siRNA transfeksjon
COX-2-genet ble brakt til taushet ved trans COX-2 siRNA. I en brønns vevskulturplate, 2 x 10
5 celler per brønn ble sådd ut i 2 ml antibiotika-fritt normal vekst-medium supplert med FBS. Celler ble inkubert ved 37 ° C i en CO
2 inkubator inntil cellene var 60-80% sammenflytende. Celleviabilitet ble vurdert før transfeksjon. Følgende ble fremstilt: Løsning A: For hver transfeksjon, fortynnet 6 mL av siRNA duplex (dvs. 0,25 til 1 mikrogram eller 20-80 pmols siRNA) i 100 ul siRNA Transfeksjon Medium (Santa Cruz, USA). Løsning B: For hver transfeksjon, fortynne 6 mL av siRNA Transfeksjon Reagens (Santa Cruz, USA) i 100 ul siRNA Transfeksjon Medium. siRNA duplex-løsning (løsning A) ble blandet med fortynnet Transfection Reagent (løsning B) og inkubere blandingen i 45 minutter ved romtemperatur. For hver transfeksjon, ble 0,8 ml siRNA Transfeksjon medium tilsatt til hvert rør inneholdende den siRNA Transfection Reagent blanding (løsning A + løsning B), blandet forsiktig lagt over vaskede celler og inkubert i 5-7 timer ved 37 ° C i en CO
2 inkubator. Etter inkubering ble 1 ml normal vekstmedium som inneholdt 2 ganger den normalt serum og antibiotika-konsentrasjon (2 x normal vekst medium) tilsettes uten å fjerne transfeksjon blandingen. Celler ble inkubert i ytterligere 18-24 timer. Mediet ble erstattet med 1 ml frisk 1 x normal vekstmedium og anvendt for ytterligere måling.
Statistisk analyse
Verdier ble nedtegnet som middelverdi x ± SD fra tre eksperimenter. Eksperimentelle resultater ble analysert ved t-test. P 0,00 ble ansett som nivået på høyt betydning og P . 0,05 ble ansett som betydning for verdiene oppnådd for behandlede grupper sammenlignet med kontrollgruppen
Resultater
plumbagin induserer cytotoksisitet i HCT15 og HT29 tykktarmskreftceller
Ansette HCT15 og HT29 tykktarmskreft cellelinjer, vi evaluert første effekten av cytotoksisitet av plumbagin ved MTT-analyse. I tillegg til aberrant Wnt signalering i begge cellelinjene, er HT29-celler er kjent for å uttrykke COX2, mens HCT15 cellene mangler COX2 uttrykk. Begge cellelinjer var følsomme for plumbagin, noe som indikerer at plumbagin kan indusere cytotoksisitet av både tarmkreftcellene uavhengig av COX2 status (fig. 1a og 1b). Imidlertid HCT15 cellene mer følsomme for plumbagin som IC
50 ved 24 timer var 22,5 uM, noe som er betydelig lavere enn den til IC
50 av plumbagin behandlet HT29, som er 62,5 uM. Bare ikke vesentlige endringer i levedyktigheten til PBMC-tallet (normale celler) ble observert selv IN100 iM plumbagin inkuberes cellene (Fig. 1c)
en. Cytotoksisitet effekten av ulike konsentrasjoner av plumbagin på HCT15 celler
. Doseavhengig cytotoksisitet effekter av plumbagin på HCT15 celler ble representert i diagrammet ovenfor. HCT15 celler var mer følsomme overfor plumbagin som IC
50 ved 24 timer var 22,5 mikrometer. Alle forsøkene ble utført in triplo og uttrykkes som gjennomsnitt ± SD. Betydning er indisert som *
p 0,001
.
b. Cytotoksisitet effekt av forskjellige konsentrasjoner av plumbagin på HT29-celler
. Doseavhengig cytotoksisitet effekter av plumbagin på HT29-celler ble representert i diagrammet ovenfor. HT29-celler var mer følsomme overfor plumbagin som IC
50 ved 24 timer var 62,5 mikrometer. Alle forsøkene ble utført in triplo og uttrykkes som gjennomsnitt ± SD. Betydning er indisert som *
p 0,001
.
c. Cytotoksisitet effekt av forskjellige konsentrasjoner av plumbagin på PBMC celler
. Doseavhengig cytotoksisitet effekter av plumbagin for PBMC-celler ble representert i diagrammet ovenfor. PBMC celler resistens mot plumbagin indusert cytotoksisitet selv ved 100 uM konsentrasjon. Alle forsøkene ble utført in triplo og uttrykkes som gjennomsnitt ± SD. Betydning er indisert som *
p. 0,001
plumbagin hemmer spredning av HCT15 og HT29 colonic kreftceller
Spredning av HCT15 celler behandlet med 15 mikrometer og 30 uM av plumbagin økte svakt ved 24 timer og redusert i betydelig grad ved 48 timer og 72 timer, mens ubehandlede kontrollceller ble opprettholdt i eksponensiell vekstfase. I motsetning til dette, HT29-celler ble behandlet med 50 uM plumbagin viste eksponentiell vekst, sammenlignes med ubehandlede kontrollceller, mens veksten av HT29-celler ble behandlet med 75 uM plumbagin økte svakt ved 24 timer og redusert i betydelig grad ved 48 timer og 72 timer (figur . 2a og 2b).
en. HCT15 celler. b. HT29 celler
. Proliferasjon av HCT15 celler behandlet med 15 uM og 30 uM av plumbagin og HT29-celler ble behandlet med 75 uM plumbagin økte signifikant ved 48 timer og 72 timer, mens 50 uM plumbagin behandlede HT29-celler har en tendens til å spre seg. Alle forsøkene ble utført in triplo og uttrykkes som gjennomsnitt ± SD. Betydning er indisert som *
p. 0,001
plumbagin induserer apoptose i HCT15 og HT29 tykktarmskreftceller
For å bestemme DNA-ødeleggende egenskaper plumbagin, HCT15 cellene ble inkubert med 15 uM og 30 uM plumbagin i 24 timer, mens, HT29-celler ble inkubert med 50 uM og 75 uM plumbagin i 24 timer. Utseendet av komet haler korresponderende med induksjon av DNA-skade var synlige (fig. 3). HCT15 celler behandlet med 30 uM plumbagin og HT29-celler ble behandlet med 75 uM plumbagin viste økt behold av DNA-skade. Spennet av komet halen var ti og seks ganger så stor som kontroll HCT15 cellene, og 15 uM plumbagin behandlet HCT15, henholdsvis, mens, 50 uM og 75 uM plumbagin – behandlede HT29-celler viser fire og to tidspunktet for tidsrommet av halen, henholdsvis, sammenlignet med kontroll HT29-celler. DNA-skader ble ikke observert, som glorie rundt cellekjerner var godt synlig i kontrollceller.
HCT15 celler behandlet med 30 mikrometer plumbagin og HT29 celler behandlet med 75 mikrometer plumbagin viste økt bevart av DNA-skader. Lengden av komet halen var ti og seks ganger større enn for kontroll og 15 uM plumbagin behandlet henholdsvis HCT15,, mens, 50 uM og 75 uM plumbagin – behandlede HT29-celler viser fire og to tidspunktet for tidsrommet av halen, henholdsvis, sammenlignet kontroll HT29 celler. DNA-skader ble ikke observert, som glorie rundt cellekjerner var godt synlig i kontrollceller.
Analyse av NFkB, Caspase-3-aktivering og cytokrom C utgivelse i plumbagin inkuberes HCT15 og HT29 celler
Aktivering av Caspase-3, NFKB (p65) og cytosoliske frigjøring av cytokrom C ble analysert ved western blotting (fig. 4a). Aktivering av NFkB (p65) ble en signifikant økning i både 15 uM og 30 uM plumbagin – behandlet HCT15, så vel som i 50 uM og 75 uM plumbagin – behandlede HT29-celler når sammenlignet med kontroll HCT15 og HT29-celler. Aktivering av Caspase-3 og nivåer av cytosoliske cytokrom C var betydelig høye, i begge 15 uM og 30 uM plumbagin – behandlede HCT15-celler, sammenlignet med ubehandlede celler HCT15. Imidlertid aktivering av Caspase-3 og nivåer av cytosoliske cytokrom C var høy bare i 75 uM plumbagin behandlede HT29-celler, men ikke i HT29-celler ble behandlet med 50 uM plumbagin.
en. Immunoblotting analyse av NFkB aktivisering, Caspase-3-aktivering og cytokrom C utgivelsen
. Lane 1- Kontroll HCT15; Lane 2- 15 mikrometer plumbagin behandlet HCT15; Lane 3- 30 mikrometer plumbagin behandlet HCT15; Lane 4- Kontroll HT29; Lane 5- 50 mikrometer plumbagin behandlet HT29; Lane 6- 75 mikrometer plumbagin behandlet HT29.
B.I. Cellesyklus analyser av kontroll og plumbagin behandling HCT15 og HT29 celler ved flowcytometri
. Sammenlignet med kontroll HCT15, HCT15 behandlet med plumbagin viser markert økning i sub-G1 brøkdel som tyder på at disse cellene gjennomgår apoptose. HT29-celler eksponert for 75 uM av plumbagin alene viste økning i sub-G1 fraksjon, mens HT29-celler eksponert for 50 uM av plumbagin sub-G1 fraksjon var mye mindre.
b.ii. Kvantitative data på cellesyklusanalyse
. Alle forsøkene ble utført in triplo og uttrykkes som gjennomsnitt ± SD. Betydning er indisert som *
p. 0,001
Cellesyklus analyse av kontroll og plumbagin behandlet HCT15 og HT29 celler
HCT15 celler eksponert for 15 og 30 mikrometer av plumbagin viste kontinuerlig økning i sub-G1 fraksjon som kan omfatte både apoptotiske og rusk fraksjon antyde sammen graden av celledød. Skadene var mer tydelig med 30 mikrometer av plumbagin. Under G1 fraksjon for kontrollen var 6,8%, mens det samme var 24,52 og 37,87% for 15 og 30 uM av plumbagin behandlede henholdsvis HCT15 celler (Fig 4b.i.). Dette indikerer en doseavhengig økning i apoptose på HCT15 celler ved plumbagin. Resultatene illustreres også i forbindelse akkumulering av celler i G0 /G1 fase, noe som indikerer inhibering av bevegelse av celler fra G0 /G1 fase til S-fasen, og dermed forsinke eller hemme inntrengning av dattercellene inn i mitotisk syklus.
Ved HT29-celler eksponert for 75 uM av plumbagin alene viste økning i sub-G1 fraksjon, mens HT29-celler eksponert for 50 uM av plumbagin sub-G1 fraksjon var mye mindre. Under G1 fraksjon for kontrollen var 4,39%, mens det samme var 6,14 og 26,76% for 50 og 75 uM av plumbagin behandlede henholdsvis H29-celler, noe som indikerer forekomsten av omfattende apoptose bare i 75 uM av plumbagin behandlede H29-celler, sammenlignet med 50 pM av plumbagin behandlet H29 celler og kontrollere HT29 celler. Resultatene illustrerer også at akkumulering av celler i G0 /G1 fase bare i 75 uM av plumbagin behandlede H29-celler, forårsaker betydelig reduksjon i populasjon av S og G2 /M-fasen, noe som indikerer forsinkelse eller inhibering av innføring av disse cellene inn i syntesefasen og mitotisk syklus. Betydelig økt cellepopulasjon ble sett i S og G2 /M fase i 50 M av plumbagin behandlet H29 celler som indikerer spredning av celler (Fig. 4.b.ii)
Analyse av fosforylert Akt, fosforylert EGFR, PCNA og cyklin D1 i plumbagin inkubert HCT15 HT29-celler og
Ekspresjon av PCNA, ble cyklin D1 sammen med fosforylering av Akt og EGFR analysert ved western blotting (fig. 5). Ekspresjon av PCNA ble signifikant redusert på 15 uM og 30 uM plumbagin behandlet – HCT15 celler når sammenlignet med ubehandlede celler. Betydelig reduksjon i nivåene av PCNA ble kun observert i 75 uM plumbagin behandlede HT29-celler, men ikke i 50 uM plumbagin behandlede HT29-celler. Signifikant redusert nivå av fosforylert EGFR, ble Akt og GSK-3β observert i 15 uM og 30 uM plumbagin behandlet HCT15 og i 75 uM plumbagin behandlede HT29-celler når sammenlignet med kontrollceller. I 50 uM plumbagin behandlede HT29-celler, nivået av fosforylert EGFR, Akt og GSK-3β viste ubetydelige endringer. . Β – Actin fungert som intern kontroll
Lane 1- Kontroll HCT15; Lane 2- 15 mikrometer plumbagin behandlet HCT15; Lane 3- 30 mikrometer plumbagin behandlet HCT15; Lane 4- Kontroll HT29; Lane 5- 50 mikrometer plumbagin behandlet HT29; Lane 6- 75 mikrometer plumbagin behandlet HT29. Ekspresjon av PCNA, cyklin D1 sammen med fosforylering av Akt og EGFR ble signifikant redusert på 15 uM og 30 uM plumbagin behandlet HCT15 og i 75 uM plumbagin når sammenlignet med kontroll HCT15, Kontroll HT29 og HT29-celler ble behandlet med 75 uM plumbagin. β-Actin fungert som intern kontroll.
Analyse av
TNF-α Hotell og
cox-2
uttrykk i HCT15 og HT29 celler behandlet med plumbagin
en. b. c. d.
