Abstract
Bakgrunn
Evnen til å selektivt oppdage og målet kreftceller som har gjennomgått en epitelial-mesenchymale overgang (EMT) kan føre til bedre metoder for å behandle kreft som kreft i bukspyttkjertelen. Ombygging av mobilnettet glykosylering tidligere har vært assosiert med celledifferensiering og kan representere en verdifull klasse av molekylære mål for EMT.
Metodikk /hovedfunnene
Som et første skritt mot å undersøke naturen av glykosylering endringer i EMT, preget vi uttrykket av sukkerrelaterte gener i tre
in vitro
modellsystemer som hver representerte en utfyllende del av bukspyttkjertelkreft EMT. Disse modellene følger med: 1) TGFB-indusert EMT, som ga en titt på den aktive overgangen mellom stater; 2) et panel av 22 bukspyttkjertelkreft cellelinjer, som representerte terminal differensiering statene enten epitel-lignende eller mesenchymale-lignende; og 3) aktivt-trekkende og stasjonære celler, som ga en titt på mekanismen av migrasjon. Vi analyserte uttrykk data fra en liste over 587 gener involvert i glykosylering (biosyntese, sukker transport, glykan-binding, etc.) eller EMT. Glycogenes ble forandret til en høyere prevalens enn alle andre gener i de to første modellene (p 0,05 og mindre enn 0,005, respektivt), men ikke i migrerings modell. Flere funksjonelle temaer ble delt mellom indusert-EMT modell og cellelinjen panel, herunder endringer i matrisekomponenter og proteoglykaner, sulfate av glykosaminoglykaner; mannosereseptoren familiemedlemmer; initiering av O-glykosylering; og visse former av sialylering. Protein-nivå endringer ble bekreftet ved Western blot for mannosereseptoren MRC2 og O-glykosylering enzym GALNT3, og celle-overflate sulfate endringer ble bekreftet ved hjelp av Alcian blå farging.
Konklusjoner /Betydningen
endringer i glycogenes er en viktig komponent av kreft EMT og er kjennetegnet ved endringer i matrikskomponenter, sulfatering av GAG, mannosereseptorer, O-glykosylering, og spesifikke sialyserte strukturer. Disse resultatene gir potensielle kunder for å målrette aggressive og resistente formene for kreft i bukspyttkjertelen celler
Citation. Maupin KA, Sinha A, Eugster E, Miller J, Ross J, Paulino V, et al. (2010) Glycogene Expression Endringer Associated med kreft i bukspyttkjertelen Epitelial-Mesenchymale Overgang i Komplementær modellsystemer. PLoS ONE 5 (9): e13002. doi: 10,1371 /journal.pone.0013002
Redaktør: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasil
mottatt: 26 april 2010; Godkjent: 30 august 2010; Publisert: 27.09.2010
Copyright: © 2010 Maupin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute (www.cancer.gov) (R03CA139225 til BH, National Institutes of Health [NIH] R01 CA132571 til VK, og NIH R01 CA130940 NT), American Cancer Society (www.cancer.org) ( CSM-116801 til VK), The National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag (www.ninds.nih.gov) (NIH R01 NS042262 til MB) og Van Andel Research Institute (www.vai.org). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen har en av de fattigste overlevelse av noen store kreft [1]. Den ekstreme letalitet av kreft i bukspyttkjertelen er relatert til dets tendens til å spre på tidlige stadier før diagnose [2], [3], og dens motstand mot kjemoterapeutika [2], [4]. Oppkjøpet av trekkende og multiresistent trekk i kreft i bukspyttkjertelen celler kan oppstå i en steg-for-trinn mote, ledsaget av økende endringer i genetikk og morfologi av kreftceller. Tidlig stadium og pre-maligne tilstander er tenkt å bestå av dysplastiske celler i bukspyttkjertelen kanaler [5], og progresjon til duktalt adenokarsinom er preget av voksende epitelceller kreftceller samlet i rør-lignende duktale strukturer omgitt av fibrotisk stroma. Den metastatisk spredning av kreft i bukspyttkjertelen krever cellene til å bryte vekk fra epiteliale duktale strukturer og ta på egenskapene til trekkende, mesenchymale celler. Denne overgangen innebærer enorm ombygging av cellen og er sannsynligvis drives av genetiske avvik, ekstracellulære signaler, og aktiveringen av differensiering programmer i kreftcellene. Karakterisere molekylære endringer i forbindelse med den fenotypiske bryteren i kreft i bukspyttkjertelen celler fra epitel-lignende til mesenchymale-lignende egenskaper vil gi innsikt i muligheter for å oppdage og målretting denne konverteringen.
Denne store fenotypiske bryteren i kreft i bukspyttkjertelen celler kan være drevet av epitel-mesenkymale overgang (EMT). EMT er en biologisk program som koordinerer omdannelsen av celledifferensiering fra de epitele karakteristika for sterk celle-celle-adhesjon, polaritet, og jevn morfologi til mesenchymale egenskapene til minimal celle-celle-kontakter, tap av polaritet, og økt cellefremspring [2] , [6], [7], [8], [9]. EMT er normalt aktivert i utvikling og sårtilheling under vev remodeling, men det antas å være unormalt aktivert av visse typer kreftceller til å gi de egenskapene forbundet med svært dødelige kreftformer. Flere linjer av bevis støtter viktigheten av EMT i å fremme kreft i bukspyttkjertelen aggressivitet. Den generelle histologiske tap av cellulær differensiering er en svært nøyaktig prediktor for dårlig resultat i bukspyttkjertelkreft [10], [11], og de spesifikke EMT markører for redusert E-cadherin og økt vimentin korrelerer med dårlig overlevelse [12], [13] og invasjon [14]. Musemodeller av kreft i bukspyttkjertelen rekapitulere at forhold [15]. I overensstemmelse med disse funn, induksjon av en transkripsjonsfaktor kalt snegl, som styrer E-cadherin undertrykkelse, resulterer i øket metastase og chemoresistance av kreft i bukspyttkjertelen celler [16]. Videre kan mesenchymale lignende kreftceller være mer resistent enn deres epitel-lignende motstykker, som foreslått av korrelasjonen mellom gemcitabin-motstand og mesenkymale trekk [17] og tap av EGFR-inhibitor følsomhet i kreft i bukspyttkjertelen celler som har tapte epitel-lignende egenskaper [8]. Intensive undersøkelser har avdekket mange av de regulerende mekanismer og molekylære karakteristika for denne omdannelsen [2], [6], [7], [8], [9], men de in-vivo faktorer som virker i kreft EMT og som er relevant til kreft i bukspyttkjertelen progresjon er ikke klart.
glykosylering av en kreftcelle kan bli betydelig oppusset i løpet av EMT, selv om innholdet i denne foreningen ikke har vært godt karakterisert. Glykosylering er en dynamisk prosess som involverer en felles samspill mellom ulike glycosyltransferases og tilhørende enzymer i det endoplasmatiske retikulum og Golgi-apparatet [18]. Glykan strukturer som er involvert i riktig protein folding [19], [20], [21], intracellulær handel [18], [20], [22], cellevekst og differensiering, [20], [23], adhesjon og migrasjon [18], [24], og celle-baserte immunitet [20], [25], blant andre funksjoner. Endringer i glykaner har blitt oppdaget og innblandet i ulike patologiske tilstander [23], [26]. I tillegg karbohydratstrukturer på celleoverflaten og utskilte proteiner er gode indikatorer på celletype og status, som de spesifikt endres i forbindelse med utvikling [27], [28], celledifferensiering og aktivering [29], [30], og transformasjon [31]. Derfor hypotese vi at kreft i bukspyttkjertelen EMT er preget av bestemte glykolyseringsmetoder endringer som spiller funksjonelle roller i kreftcelledifferensiering eller migrasjon.
Som et første skritt i å teste denne hypotesen, vi undersøkte uttrykk for glykolyseringsmetoder relaterte gener i tre modellsystemer av EMT eller migrasjon. Overvåking genuttrykk er eksperimentelt mer medgjørlig enn omfattende karakterisere sukker strukturer knyttet til hver modell system, og vi valgte derfor denne ruten for en innledende etterforskning. Selv om det ikke er mulig å utlede sukkerstrukturer bare fra genuttrykk av glycogenes, uttrykk endringer i glycogenes gi innsikt i store strukturelle endringer så vel som fører videre målpunkter for terapeutisk intervensjon. Expression endringer i glycogenes tidligere er kontrollert ved hjelp av målrettede mikromatriser eller PCR-matriser utviklet for å spesifikt måle de relevante vitnemål [32], [33], [34]. Her viser vi bruk av hel-genom uttrykk profilering for å fange den samme informasjonen ved å selektivt analysere data fra et mål gen liste over 587 sukkerassosierte gener (inkludert gener som er relevante for EMT). En fordel med denne tilnærmingen er muligheten til å bruke standard uttrykk profilering plattformer samt historiske data som ikke ble generert spesielt for å undersøke glycogenes. Vi brukte cellekultursystemer hvori EMT kan styres ved stimulering med TGFp (modell 1) eller i hvilken terminal differensiering tilstand av en rekke forskjellige cellelinjer kan bli klassifisert som enten epitel-lignende eller mesenchymale-lignende (modell 2). I tillegg undersøkte vi genutrykksmønster i celler som var enten aktivt trekkende eller stasjonære (modell 3). Hver modell system representerer et annet aspekt av celle atferd knyttet til EMT: aktiv overgang mellom stater, terminal differensiering stater, eller aktiviteten av migrasjon. Vi rapporterer her de store endringer i Glycan-forbundet genuttrykk som er knyttet til hver av de modellsystemer og som er felles mellom de modellsystemer.
Resultater
Glycogene uttrykk i TGFB-indusert EMT
Den første modellen system hvor vi undersøkte glycogene uttrykk endringene var TGFB induksjon av EMT i cellelinjene Panc-1 og A549. Den A549-cellelinjen ble ikke avledet fra kreft i bukspyttkjertelen, men ble tatt med for å gi informasjon om det generelle i de assosiasjoner med EMT. I tillegg, ved å se etter gener som forandrer seg i begge cellelinjer, redusert vi listen over kandidat gener. TGFp-behandling resulterte i oppløsning av celle-celle adhesjon og økning i spindellignende fremspring i begge cellelinjer (figur S1). Hel-genom uttrykk målinger ble oppnådd for de behandlede og ubehandlede celler ved anvendelse av Affymetrix genet chips. For et fokusert analyse på gener av interesse, brukte vi vår liste over 587 gener knyttet til glykosylering og EMT-assosiert baner (se tabell S1).
Vi først undersøkt om glykolyseringsmetoder relaterte gener viste en høyere rate av uttrykk endringer enn alle andre gener (tabell 1), noe som kan tyde på en fremtredende rolle for glykosylering endringer i EMT. Blant alle gener, 1,524 unike Affymetrix mål forandret ekspresjon i både Panc-1 og A549 etter behandling med TGFp. Siden våre sukkerrelaterte gener representerte 1,5% av de totale unike Affymetrix U133 Plus 2,0 mål, tilfeldig representasjon av glycogenes spår en tilsvarende 1,5% representasjon av glycogenes (eller 23 gener) blant dem som endret uttrykk. Men 40 av de 1,524 gener (2,6%) var glycogenes fra våre mål liste. Denne forskjellen var signifikant ved chi-kvadrat analyse (X
2 = 13,05, p 0,05). Dette resultatet foreslått en berikelse av transcriptional regulering av sukkerrelaterte gener i TGFB-indusert EMT.
En undersøkelse av gener som ble endret mer enn 1,5 ganger i begge cellelinjer (tabell 2 og 3 ) viste noen funksjonelle temaer. Den største endringen var i proteoglykan SPOCK1, som inneholder glykosaminoglykan sidekjeder av heparin- og chondroitin-sulfat [35]. Relatert til dette proteinet, gener som modifiserer glykosaminoglykan sulfatering ble oppregulert, inkludert SULF2, CHST3, og CHST11, og has2 ble oppregulert, som er involvert i syntesen av glykosaminoglykanet hyaluronan. En lektin-like receptor involvert i cellemotilitet og ekstracellulære matrise ombygging, MRC2 ble oppregulert. Endringer til initiering av O-glykosylering ble indikert ved GALNT2 og GALNT10 forandringer, og matrise-adhesjon endringer ble representert ved oppregulering av flere integriner og matrisen protein LAMC2 (gamma 2 laminin). Andre forhøyede gener representerer EMT og TGF signaleringsfunksjoner. De seks gener med redusert uttrykk viste ingen spesiell berikelse i spesifisitet, med ST8SIA4 å være den eneste redusert glykosyltransferase.
Glycogene Expression i en bukspyttkjertelkreft cellelinje Panel
Den andre modellsystem var et panel av 22 bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Et mangfold av celle-morfologi og adhesjon atferd ble observert blant de cellelinjer (figur 1). Visse cellelinjer har sterke epiteliale egenskaper (avrundet morfologi og mange celle-celle kontakter), mens andre er helt klart mesenchymale-lignende (spindel-lignende anslag og få celle-celle adhesjon). Derfor søkte vi å identifisere genuttrykk egenskaper som skiller disse to atferd. Denne sammenligningen er ikke direkte ta EMT, men snarere gir innsikt i terminal differensiering sier forbundet med mesenchymale og epitelceller fenotyper.
Mesenchymale lignende cellelinjer er presentert i de to øverste radene, og epitelceller lignende cellelinjer er i de to nederste radene. Legg merke til økt celle scatter og spindellignende fremspring sett i mesenkymale-liknende celler sammenlignet med den tettere celle-celle adhesjon og mer sfærisk form karakteristisk for epitelcellene. Bildene ble oppsamlet ved fasekontrastmikroskopi ved 10 x forstørrelse.
opprinnelig klassifisert cellelinjene som enten epitel-lignende eller mesenchymale-lignende basert på morfologi og clustering (figur 1). Cellelinjer så som CAPAN-2, HPAF-II, og BXPC-3 har tette, avrundede kolonier og ble entydig klassifisert som epitel-lignende. På den andre enden av spekteret MiaPaCa-2 og MPanc-96 viste klart mesenchymale egenskapene av lav celle-celle interaksjoner og spindel som cellulære fremspring. Andre cellelinjer var vanskeligere å klassifisere av disse egenskaper, som viser blandede eller delvis karakteristika for hver type. Vi har derfor sett på uttrykket av EMT-relaterte gener som et middel for klassifisering (figur S2). Blant disse genene (se Figur S2 for fullstendig liste) den ZEB1 transkripsjonsfaktor klarest samsvarer morfologi og sterkt korrelert med nedregulering av epitel markør, E-cadherin (CDH-1) [6], [7], [8 ], [9] i de mesenkymale-lignende celler. Et slående todelingen av celler som var negative eller positive for ZEB1 var tydelig, dele cellelinjene inn seks som var mesenchymale-lignende og 16 som ble epitelial lignende. Basert på denne klassifiseringen, ble uttrykket av E-cadherin (CDH-1) betydelig opp regulert (p≤0.01) og uttrykk for vimentin (VIM) var signifikant nedregulert (p≤0.01) i epitelceller. Proteinet uttrykksmønster av disse to gener ble bekreftet ved Western blot (Figur 2). Derfor brukte vi denne klassifiseringen i senere analyser.
Lysates ble samlet inn fra de utvalgte cellelinjer, fraksjonert ved SDS-PAGE og analysert ved Western blot. De uthevede band er på de forventede molekylvekt på 110 kD for E-cadherin, 57 kD for vimentin og 42 kD for aktin.
Vi undersøkte om sukkerrelaterte gener var forskjellig mellom gruppene på en høyere rente enn alle andre gener (tabell 1). Strengt ved en tilfeldighet, siden våre sukkerrelaterte gener representerte 1,5% av de totale unike Affymetrix U133 Plus 2,0 mål, forventet vi en tilsvarende 1,5% representasjon av glycogenes blant listen over totalt endrede gener. Men av de 3.675 sonder som viste signifikant endret nivåer av uttrykk (p≤0.05) mellom mesenchymale-lignende celler og epithelial-lignende celler, 87 (2,37%) var glycogenes fra våre mål liste. En chi-kvadrat analyse viste disse resultatene til å ha stor betydning (X
2 = 18,9, p≤0.005). Denne trenden fortsatte på høyere nivåer av betydning som 1212 unike Affymetrix mål viste signifikant forskjellige uttrykk nivåer (p≤0.01). Av disse målene, 30 (2,48%) var på vår liste som glycogenes, også en signifikant forskjell ved Chi-kvadrat analyse (X
2 = 8,12; p≤0.005). Denne analysen antydet en berikelse av transcriptional regulering av sukkerrelaterte gener i differensieringen av celler mellom mesenchymale og epiteliale fenotyper.
genuttrykket endringer for denne modellen systemet er oppsummert i tabell 4 og 5. I likhet med ovenfor, et proteoglykan ble den mest betydelig overuttrykt i de mesenkymale-lignende celler, i dette tilfellet VCAN (versican), og gener som regulerer sulfatering av glykosaminoglykaner ble oppregulert, inkludert SULF2, CHST7, SGSH, og NDST2. Matrix endringen ble også representert ved oppregulering av VIM (vimentin) og LAMA4 (alpha 4 laminin). I motsetning til i den induserte-EMT modell, gener involvert i forgrening eller utvide sukkerkjedene ble oppregulert i mesenchymale-lignende celler, inkludert MGAT5B, ST3GAL2, ST6GALNAC4, POMGNT1, og B3GNT1. De mesenchymale-lignende celler viste også en slående nedregulering i enkelte gener, spesielt GALNT3, som initierer O-glykosylering. GALNT3 ble nedregulert i alle seks mesenkymale-lignende celler, med en gjennomsnittlig reduksjon på ~1000-fold. To C-type lektiner også ble nedregulert, LY75 og CLEC3A. Ekspresjons mønstre av disse genene klart skille mellom mesenchymale-lignende cellelinjer fra den epiteliale-lignende (figur 3)
Gener ble inkludert som hadde signifikant forskjellige (p 0,01). Ekspresjonsnivåer mellom mesenchymale-lignende ( kolonneetikettene farget rødt) og epiteliale-lignende (kolonneetikettene farget svart) cellelinjer. Uttrykket verdiene ble log transformert (base 10) og median sentrert ved rad. Verdien av hver rute er angitt med fargelinjen.
Glycogene uttrykk i migrere og stasjonære kreft i bukspyttkjertelen celler
Den tredje modellen systemet var en sammenligning av aktivt migrere celler til stasjonære celler [36]. PANC-1 og MiaPaCa-2-celler ble sådd ut som en definert mm omkrets og cellene ble tillatt å migrere i 48 timer. To forskjellige morfologiske populasjoner ble observert. Cellene på periferien av celleklase vandret vekk fra området med høy celletetthet (rim) og tok på en klassisk mesenchymale fenotype med spindel som anslag og tap av celle-til-celle adhesjon. Celler som forble i den svært befolket sentrum (kjerne) viste større inter adhesjon og var mer avrundet utseende. Cellene ble høstet inn i «rim» og «core» grupper ved selektivt å samle inn fra hver av disse to gruppene.
2,778 unike mål endret uttrykk minst +/- 0,25 ganger i både migrere MiaPaCa-2 og Panc-en i forhold til deres stasjonære motstykker (Tabell 1). Siden våre sukkerrelaterte gener representerte 3,0% av den totale unike Agilent Whole Human Genome Microarray Kit (4 × 44K prober), spådde tilfeldig sjanse tilsvarende 3,0% representasjon av glycogenes blant listen av gener som endret. At nivået av representasjon ble faktisk observert, som 84 av 2778 gener (3,0%) med endrede nivåer av uttrykk var glycogenes fra våre mål liste. En chi-kvadrat analyse viste at forskjellen mellom den observerte forandring i glycogenes var ikke signifikant sammenlignet med den forventede verdi. Disse resultatene tyder ikke en berikelse for regulering av sukkerrelaterte gener i karakterforskjeller mellom aktivt trekkende og stasjonære celler.
Færre gener viste differensial uttrykk mellom gruppene enn i de ovennevnte modellene (tabell 6 og 7). Åtte målgener økt uttrykk av mer enn 1,5 ganger i både migrere MiaPaCa-2 og Panc-1. Ingen gener økt med mer enn to ganger i begge celletyper. Ingen klare temaer i glycogene funksjon var merkbar blant de gener med økt uttrykk. Ni mål gener redusert uttrykk nivåer over 1,5 ganger hos både Migrere MiaPaCa-2 og Panc-1. To er relatert til fjerning av mannose i biosyntesen av N-glykaner, MAN1A2 og MANBA. Mucin MUC12 var den eneste gen med redusert uttrykk større enn to ganger i begge celletyper.
Delt Gener og funksjonelle Temaer
Vi neste undersøkt om visse genekspresjon forandringene var felles mellom to eller flere av de modellsystemer. En slik analyse er nyttig for å tilveiebringe mer veiledning om hvilke gener som er viktige i flere aspekter av EMT eller er funksjonelt viktig i prosesser relatert til EMT. Overlappingen mellom de modellsystemer var liten. I sammenligne TGFB-indusert EMT og cellelinjen panel, bare tre gener var felles: ZEB1 og SULF2 var oppregulert i begge modellene, og CDH1 ble redusert i begge. Ved hjelp av data bare fra Panc-en cellelinje i TGFB-indusert og migrere cellemodeller, økt ST6GALNAC4 og PIGM gått ned i alle modellsystemer. Disse resultater viser at mens glycogenes blir endret på hver modell, og er særlig anriket med indusert-EMT og cellelinjen panel, de spesifikke gener som er involvert i hver er avvikende mellom systemene.
Selv om mange av de endrede gener var forskjellig mellom den induserte-EMT modell og cellelinje panel, flere funksjonelle typer var til stede i begge. Den mest dominerende delte type var den modulering av glykosaminoglykan (GAG) komponent av den ekstracellulære matriks. SPOCK1 og VCAN (versican) er begge matrix proteiner som bærer GAG-kjeder, og begge systemene viste oppregulering av gener som legger og ta bort sulfat fra disse kjedene, inkludert SULF2, CHST3, CHST11, has2, CHST7, SGSH, og NDST2. En Alcian blå analyse ble utført for å ytterligere karakterisere den generelle sulfate nivåer mellom den epiteliale og mesenkymale-lignende cellelinjer, så vel som etter induksjon av EMT i Panc-1 av TGFp (figur 4). En betydelig økning i total sulfatering ble sett for mesenchymale-lignende cellelinjer (p = 1,29 x 10
-5). Induserende EMT i Panc-1 av TGFB fortsatte trenden med betydelig økende generelle nivået av sulfate (p = 0,027). Disse resultatene bekrefter cellesulfate endringer for de to modellsystemer som da de ble foreslått av genekspresjon.
(A) RT-PCR ble utført på lysater fra de angitte cellelinjer, og intensitetene for bånd ved de forventede størrelse for hvert gen ble kvantifisert. En student t-test (resultater gitt av p-verdi) ble utført ved å sammenlikne de båndintensitetene mellom mesenchymale-lignende cellelinjer (i fet skrift) og de epiteliale cellelinjer. I tillegg ble en korrelasjon beregnes (resultater gitt av r-verdi) mellom RT-PCR-resultater og de mikroarray data. Glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble brukt som et cDNA-lastekontroll. (B) Sammenligning av GALNT3 protein nivåer av Western blot i utvalgte bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Lysater ble oppsamlet fra de utvalgte cellelinjer, fraksjonert ved hjelp av SDS-PAGE og analysert ved Western blot. Mesenchymale-lignende celle er merket med fet skrift. De uthevede band er på de forventede molekylvekt på 73 kD for GALNT3 og 42 kD for aktin. (C) MRC2 proteinnivåer målt ved Western blot i TGFp behandlede og ubehandlede celler. Cellelinjene ble enten utsatt for 5 ng /mL TGFp eller ubehandlet serum i henhold til sult i 72 timer før cellelysering. De uthevede band er på de forventede molekylvekter ~167 kD for MRC2 og 42 kD for aktin.
Et annet tema til felles mellom indusert-EMT modell og cellelinjen panelet var endringer i lectin- som reseptorer av mannose-reseptoren familien. De fire medlemmene av denne familien, MRC1, MRC2, LY75, og CD302, er trans endocytiske reseptorer med flere karbohydrat-bindende domener. MRC2 ble oppregulert og CD302 ble nedregulert i indusert-EMT modell, og LY75 ble nedregulert i cellelinjen panel. De to EMT modellene deles også forandringer medlem av N-acetyl-galaktosamin (GalNAc) transferase familie, som katalyserer den innledende tilsetning av GalNAc til et serin eller treonin rest i mucin-type O-bundet glykosylering. GALNT2 og GALNT10 ble oppregulert i indusert EMT, og GALNT3 var den sterkeste diskriminatoren av epitel-lignende og mesenkymale-lignende celler i cellelinjen panel, med ekspresjon synker under målbare nivåer i mesenchymale celler (figur 4).
Validering av genuttrykk Forskjeller
differensial genuttrykk i mesenchymale-lignende og epitelceller lignende cellelinjer ble bekreftet for visse gener ved hjelp av RT-PCR og Western blot (figur 5). Sammenhenger mellom RT-PCR og microarray Resultatene var generelt i samsvar med de sterkeste korrelasjonene sett for GALNT3, 0,912; ZEB1, 0,774; GMPPA, 0,735; og MAN2B2, 0,713; og svakere korrelasjoner for ST3GAL6, 0,509; og PMM1, 0,415. Protein-nivå endringer ble bekreftet ved Western Blot for GALNT3 og MRC2. GALNT3 deteksjon var positiv for de epiteliale cellelinjer BXPC-3, HPAF II, og SU86.86 mens resterende uoppdaget i mesenkymale lignende cellelinjer MiaPaCa-2, MPanc-96, og Panc-1. MRC2 ble bare påvist i A549, Panc-1, og MiaPaCa-2 og viste økt nivåer etter behandling med TGFp i disse tre cellelinjer. Det var ingen påvisbar grad av MRC2 for BXPC-3 eller HS766t i nærvær eller fravær av TGFp.
An Alcian blå analyse ble utført på lysater fra de angitte cellelinjer, og den samlede sulfate for hver cellelinje var kvantifisert ved å måle absorbansen av fargestoffet ved 600 nm. En t-test (resultater gitt av p-verdi) ble utført sammenligne absorbansene mellom mesenchymale-lignende cellelinjer (i fet skrift) og epiteliale cellelinjer samt mellom Panc-1 etter 72 timer med TGFB behandling og ubehandlet Panc- 1. Heparin ble anvendt som en sulfatert GAG kontroll. (A) Fotografi av det resulterende fastholdelse av Alcian blått fargestoff etter utfellingen av sulfaterte glykaner og påfølgende re-suspensjon. Den andre kolonnen representerer de mesenchymale-lignende cellelinjer og beholdt mer flekk, som indikerer tilstedeværelse av høyere nivåer av sulfaterte glykaner i cellelysatene. (B) søylediagram som viser forskjellen i absorbans ved 600 nm for cellelinjene. De mesenchymale-lignende cellelinjer (i fet skrift) hadde signifikant høyere nivåer av absorbans enn de øvrige epiteliale cellelinjer (p = 1,29 × 10
-5). (C) søylediagram som viser forskjellen i absorbans ved 600 nm for Panc-1 etter 72 timers eksponering til 5 ng /mL TGFp eller ubehandlet serum i henhold til sult. Panc-1 etter TGFB behandling hadde signifikant høyere nivåer av absorbans enn ubehandlet Panc-1 (p = 0,027).
Diskusjoner
Evnen til å oppdage eller kontroll EMT i bukspyttkjertelkreft kan føre til bedre behandlingsstrategier. Karakterisering av molekylære endringer i forbindelse med EMT er et første skritt i å rakne noen av de mekanismene som driver denne prosessen. Definere ved sukker endringene forbundet med EMT kan være spesielt viktig for å forstå denne prosessen, gitt den kjente involvering av glykaner i andre prosesser av celledifferensiering. Hel-genom uttrykk profilering kombinert med en target gen liste over 587 glykolyseringsmetoder relaterte gener var et praktisk middel for å undersøke glykosylering i dette biologiske systemet. I tillegg vil bruk av tre i-vitro modellsystemer vist seg nyttig for å undersøke komplementære aspekter av epitel og mesenchymale stater, nemlig aktiv overgang mellom stater, terminal differensiering statene, og det handler om migrasjon.
betydningen av glykan endringer i EMT ble støttet av frekvensen av endringer i glykosyleringsseter-assosierte gener (tabell 1). Glykan-assosierte gener ble endret hyppigere enn det som ble forutsagt i to av de modellsystemer, TGFp-indusert EMT og cellelinjen som paneler, men ikke i celle migrasjon modell. Oppdagelsen av at glykan remodeling er et viktig aspekt ved celledifferensiering prosessen ville være i samsvar med tidligere arbeid som viser viktigheten av sukker endringer i stamcellebiologi og immunaktivering [27], [31], [37]. Mangelen på store glycogene endringer i cellemigrasjon mellom kan tyde på at de trekkende cellene ikke var faktisk skille, men heller bare endre uttrykk for mekanikerne av migrasjon. Derfor sukker endringer kan være viktigere som indikatorer på celletype og status snarere enn som funksjonelle bidragsytere til migrasjon. Imidlertid bør det bemerkes at endring av glykosyltransferase-aktivitet i cellelinje-modeller har vist at forskjellige effekter på trekkende evne
in vitro product: [38], [39], [40]. I tilfelle av Panc-1 og MiaPaCa-2, kan de allerede har den nødvendige for en forbedret evne vandrende glykan-maskineri; ytterligere transformasjon kan ikke være nødvendig. Dette området av undersøkelsen ble også begrenset til to bukspyttkjertelkreft cellelinjer i svært spesifikke
in vitro
forhold. Fremtidige analyser ved hjelp av flere cellelinjer og ulike metoder for å skille trekkende fra stasjonære celler kan gi nye funn.
De funksjonelle temaer som deles av den induserte EMT modellen og cellelinjen panel gi noen innsikt i rollene som glykosylering i EMT . De endringer av proteoglykaner og sulfate enzymer antyder viktigheten av kontroll av GAG sulfatering i EMT. Dette funnet er i samsvar med tidligere undersøkelser som viser endringer i matriks-komponenter slik som versican [41] og endringer til GAG sulfatering [42] i forbindelse med kreft, særlig i aggressive former for kreft. Kreftfremmende funksjoner av versican kan virke gjennom å regulere vekstfaktor aktivitet og ved å samhandle med immun og stromale celler [43], funksjoner som kan endres av endringer i sulfate. SPOCK1 kan fungere gjennom lignende mekanismer, men er mindre godt studert. SULF2, som var sterkt oppregulert i begge systemer, og virker til å fjerne sulfater fra visse GAG-kjeder, har også blitt assosiert med lunge karsinogenese [44] og tumorigenisitet av kreft i bukspyttkjertelen celler [45]. Kreftfremmende funksjoner av SULF2 synes å fungere ved å aktivere Wnt signalering eller avgi vekstfaktorer fra den ekstracellulære matriks, som også kan ha en pro-angiogen effekt. Foreningen av disse funksjonene med kreft EMT tyder på at kreftceller gjennomgår EMT bruke en overhaling av det ekstracellulære rom å bli svært plagsomme.
