Abstract
Bakgrunn
Adrenomedullin (AM) er sterkt uttrykt i bukspyttkjertelkreft og stimulerer bukspyttkjertelen kreftceller fører til økt tumorvekst og metastasering. Den aktuelle studien undersøker rolle spesifikke AM reseptorer på svulsten og celler som ligner svulsten mikromiljøet (human bukspyttkjertelstel – HPSC, menneskelige umbilical vein – HUVEC og mus lunge endotelceller – MLEC).
Metoder og funn
AM reseptorer ADMR og CRLR var tilstede i HPSC, HUVEC og MLECs mens PDAC celler besatt bare ADMR reseptorer som vurderes av RT-PCR og Western blotting. Alle cellelinjer uttrykt og utskilt AM som indikert ved hjelp av ELISA. Veksten av hver av cellelinjene ble stimulert av eksogent AM og hemmet av antagonisten AMA. AM også stimulert
in vitro
angiogenese vurdert av polygon dannelsen av endothelial cellelinjer. SiRNA-mediert stanse av ADMR, men ikke CRLR, redusert basal vekst av alle celler undersøkt og redusert polygon dannelse av endotelceller
in vitro
. Ortotopiske tumorer utviklet med shADMR lagercancerceller hadde dramatisk redusert primær tumorvolum (mer enn 90%) og lunge- og levermetastaser sammenlignet med shControl bærende celler. For å validere ADMR som et potensielt terapeutisk mål, i
n vivo
studier ble utført ved bruk av nøytrale nanoliposomes å levere systemisk menneskelig siRNA til ADMR til taushet humane kreftceller og mus siRNA til ADMR til taushet mus stromale tumorceller. Systemisk stanse av både mennesker og mus ADMR hadde ingen åpenbare negative effekter, men sterkt redusert svulst utvikling.
Konklusjon
ADMR formidler stimulerende effekten av AM på kreftceller og på endotelceller og stel celler i svulstens mikromiljø. Disse dataene støtter den videre utviklingen av ADMR som et nyttig mål behandling av bukspyttkjertelkreft
Citation. Ramachandran V, Arumugam T, Langley R, Hwang RF, Vivas-Mejia P, Sood AK, et al. (2009) ADMR Receptor formidler effekten av Adrenomedullin på kreft i bukspyttkjertelen celler og på celler av svulstens mikromiljø. PLoS ONE 4 (10): e7502. doi: 10,1371 /journal.pone.0007502
Redaktør: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland
mottatt: 04.06.2009; Godkjent: 15 september 2009; Publisert: 22 oktober 2009
Copyright: © 2009 Ramachandran et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av NIH DK052067, MD Anderson Support Core-stipend CA16672, MD Anderson bukspyttkjertelen spesialiserte programmer for fremragende forskning (SPORE) stipend P20 CA101936, og ved Lockton legat, og støtte fra et program Prosjektutvikling Grant fra Ovarian Cancer Research Fund. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA, og det har blitt anslått at det i 2008 om lag 37 680 amerikanere ble diagnostisert og 34 290 døde av denne sykdommen [1]. Selv om betydelige fremskritt begynner å bli gjort til forvaltningen av sykdommen, har fem års overlevelse ikke forbedret de siste 25 årene [1]. Den høye dødeligheten skyldes den høye forekomsten av metastatisk sykdom ved førstegangsdiagnose, den aggressive klinisk forløp og svikt i systemisk behandling [2]. Det er derfor et stort behov for bedre forståelse av molekylærbiologi av sykdommen som kan utnyttes til å utvikle nye behandlingsformer for kreft i bukspyttkjertelen.
Vi har tidligere vist at adrenomedullin (AM) er over-uttrykt i kreft i bukspyttkjertelen og har en sterk autokrin rolle i denne sykdommen [3]. AM er et 52 aminosyre-peptid opprinnelig isolert fra human pheochromocytoma [4] som fungerer som en multifunksjonell regulerende peptid [5]. Ett problem med AM som et mål for kreftbehandling er at AM har flere fysiologiske funksjoner som hemming kan være skadelig. AM er uttrykt i normale pankreatiske øyceller, med overveiende ekspresjon i cellene F, som også inneholder pankreatisk polypeptid [6]. AM reduserer insulinutskillelse i fysiologiske betingelser [6]. AM har også viktige virkninger i vaskulær cellebiologi hvor det regulerer vaskulær tonus og permeabilitet og vasodilatasjon fremmer [7] – [11]. AM er også en potent angiogen molekyl, spesielt i hypoksi, som induserer AM [10]. Den angiogene effekter av AM blir sannsynligvis formidlet ved direkte stimulering av endotel-celle proliferasjon [12] og beskyttelse av endotelceller fra apoptose [13]. Adrenomedullin signalering er nødvendig for muse-lymfatisk vaskulær utvikling [14]. Mus som AM er genetisk slettet utvikle kutant ødem og midgestational dødelighet på grunn av feil i lymfekar vekst og hjerte-feil [15]. I kreft, synes AM for å ha en viktig rolle i angiogenese, så vel som et ytterligere trofisk effekt direkte på kreftceller [16] -. [18]
AM virker som en peptid-ligand som aktiverer reseptorer på celleoverflaten . Pankreas beta-celler uttrykker reseptorer som er kjent for å svare til AM inkludert adrenomedullin reseptor (ADMR, også kjent som L 1-R) og kalsitonin-reseptor-lignende reseptor (CRLR) [6], [19], [20]. Vår tidligere studie fant at kreft i bukspyttkjertelen celler uttrykker bare ADMR, mens begge reseptorer finnes i celler innenfor svulsten mikromiljøet inkludert menneskelige bukspyttkjertelen stel celler (HPSCs) og endotelceller. Men rollene til de spesifikke reseptorer i AM sin effekt på kreft i bukspyttkjertelen, HPSCs og endotelceller er foreløpig ukjent.
Den aktuelle studien undersøker effekten av AM på humane bukspyttkjertelen kreftceller, HPSCs og endotelceller og undersøker reseptorer som er involvert i disse effekter. Vi forstummet hver av reseptorer
in vitro
hjelp siRNA og fant at ADMR var hovedansvarlig for de biologiske effektene av AM på hver av disse celletyper. Vi undersøkte effekten av å kneble ADMR på kreft i bukspyttkjertelen celler og observert en stor reduksjon av tumorvekst
in vivo
. For å analysere potensialet for ADMR som et mål for kreftbehandling, evaluert vi så effekten av å kneble ADMR i begge museceller som utgjør svulsten mikromiljøet og på humane kreftceller ved hjelp av DOPC nanoliposomes å levere artsspesifikke sirnas. Dette systemisk stanse av ADMR ikke har åpenbare skadelige virkninger på friske mus, men sterkt redusert svulst utvikling. Derfor ADMR bør være et viktig mål for fremtidig utvikling av små molekyl legemiddelselskap.
Materialer og metoder
Cellelinjer og AM Peptider
kreft i bukspyttkjertelen BxPC3 celler og HUVEC celle linjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). MPanc96 bukspyttkjertelen adenokarsinom cellelinjer ble opprinnelig etablert av Dr. Timothy J. Eberlein (St. Louis, Missouri) [21]. MLECs er mikrovaskulære endotelceller fra primærkulturer ble oppnådd fra lungene hos mus som har vev havn en temperaturfølsom SV40 stort T-antigen [22]. Når dyrket under permissive temperaturen (33 ° C), cellelinjer viste doblingstider i samsvar med endotelceller som innehar en angiogen fenotype. Overføringen av disse endotelceller til ikke-permissive temperaturen (37 ° C) resulterte i celledifferensiering og induksjon av en hviletilstand. MLECs ble dyrket i 10% FBS i DMEM. BxPC3 celler ble dyrket i 10% FBS i RPMI-medium, MPanc96 ble cellene dyrket i 10% FBS i DMEM medier og humane endotelceller (HUVEC) ble dyrket i 15% FBS i MEM. Alle medier inneholdt 1% antibiotika. Humane pankreatiske stel celler (HPSCs) ble isolert ved anvendelse av fremgangsmåten utvekst fra pankreas adenokarsinom prøver fra pasienter som gjennomgår kirurgisk reseksjon og dyrket i 15% FBS i DMEM [3], [23]. Alle celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. BxPC3 og MPanc96 cellelinjer som stabilt bærer shControl eller shADMR vektorer og luciferase-genet utviklet i en tidligere studie ble også brukt [3]. Adrenomedullin (AM 52) og adrenomedullin antagonist (AMA (am 22-52)) ble kjøpt fra Sigma, (St. Louis, MO).
ELISA for AM
AM ble oppdaget i kondisjonert media fra HPSC, HUVEC og MLECs bruker et kommersielt ELISA. For innsamling av kondisjonert medium, ble cellelinjer vokst til 80% samløpet og vasket med PBS og deretter dyrket i 24 timer i sine respektive serum-frie medier. Media ble samlet og konsentrert ved hjelp Centricon YM-3 filter enheter (Millipore Corporation, Chicago, IL). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved bruk av Bio-Rad-reagens (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Competitive ELISA ble deretter utført ved bruk av en AM deteksjon kit (Phoenix Pharmaceuticals, Belmont, CA, katt # EK-010-01) etter produsentens foreslåtte protokoll. Respektive konsentrert serumfritt medium tjente som reagens kontroll og kontroll OD-verdiene ble subtrahert fra de i alle andre prøver. Beregninger av AM konsentrasjon benyttes standardkurven inkludert i settet og ble utført i henhold til produsentens protokoll.
Transient transfeksjon av siRNA
stanse av ADMR og CRLR ble oppnådd i HPSC, HUVEC og MLECs (2 × 10
4 celler) ved hjelp av transient transfeksjon av siRNAs. Menneskelige og mus sirnas hver mot kontroll, ADMR og CRLR (sirnas ID # 4611, 46184, 42272, Ambion Inc. Austin, TX og skreddersydde mus sirnas ID # Control – 1.129.089, 1.129.090, ADMR – 1.129.085, 1.129.086, CRLR – 1.129.087, 1129088 fra Sigma-Aldrich (Proligo), St.Louis, MO) ble transfektert ved en sluttkonsentrasjon på 5 nM per brønn på 96-brønners plater. Vi analyserte også effekten av siADMR på MPanc96 kreftceller. SiRNA transfeksjon ble gjennomført med Hiperfect transfeksjon reagens (Qiagen, Valencia, CA) som per produsentens protokoll.
Western blotting
MPanc96, HPSC, HUVEC og MLEC celler ble transient transfektert med kontroll siRNA eller sirnas mot ADMR eller CRLR og etter 72 timer, cellelysatene ble fremstilt og proteinkonsentrasjoner ble målt ved hjelp av BioRad-reagens. Protein (50 ug) ble applisert på 10% SDS-PAGE-geler og Western-blotting ble utført ved anvendelse av et primært antistoff mot ADMR (cat # LS-A4048 MBL International Corporation, Woburn, MA) ved en 1: 1000 fortynning og ved å bruke et primært antistoff mot CRLR (cat # sc-30028, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) på en 1: 100 fortynning. Det samme blot ble re-analysert for β-Actin (1:200 fortynning, katt # A2066 Sigma, St.Louis, MO)., Som fungerte som lasting kontroll
RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra HPSC, HUVEC og MLEC celler med eller uten siRNA transfeksjon og fra mus bukspyttkjertel. DNase ble brukt for å fjerne kontaminerende genomisk DNA etter RNA rensing. Integriteten av RNA ble bekreftet ved å kjøre på en denaturerende gel, og observere tydelige 28S og 18S rRNA band. En ikke-reverstranskribert kontroll ble kjørt for å sikre at ingen genomisk DNA ble amplifisert. RT-PCR ble utført med mennesker og mus AM /ADMR /CRLR primere for å bestemme deres uttrykk og nivåer av demping. Revers transkripsjon ble etterfulgt av 35 sykluser med standard PCR (1-min denaturering ved 94 ° C, 1-min annealing ved 63 ° C, og 1-min forlengelse ved 72 ° C). Primere utformet for human AM (Genebank: NM_001124) var: frem 5’CGG GAT CCA TGA AGC TGG TTT CCG TC 3 «og omvendt, 5» CGG AAT TCC TAA AGA AAG TGG GGA GC 3 «. Primere utformet for human ADMR (Genebank: NM_007264) var: forover 5 «CAT CGC GGA CCT GGG CAT TGT 3» og omvendt, 5 «TGA GAG GGA AGG GCA GCA GGA AGC 3». Primere utformet for human CRLR (Genebank: NM_005795) var: sende 5’TGC TCT GTG AAG GCA TTT AC 3 «og omvendt, 5» CAG AAT TGC TTG AAC CTC TC 3 «. Primere beregnet for mus AM (Genebank: NM_009627) var: forover 5 «CCA GGG TTC CCG CAG CAA 3» og omvendt, 5 «CTA TAT CCT AAA GAG TCT GG 3». Primere beregnet for mus ADMR (Genebank: NM_007412) var: forover 5 «CCG TTA CCT TCC CAA GGA 3» og omvendt, 5 «TTA GCT GGC TAC AGA ATT GCA 3». Primere beregnet for mus CRLR (Genebank: NM_018782) var: forover 5 «TGG CTT TTC CCA CTC TGA T 3» og omvendt, 5 «TCA CAT CAC Tags ATC ATA CGT 3». 18S primere tjente som lasting kontroll for RT-PCR reaksjoner. Amplifiserte produkter ble separert på 1,5% agarosegeler og visualisert ved etidiumbromid.
Cell vekststudier
HPSC, ble HUVEC og MLECs (1000 celler) sådd ut på 96-brønners plater i 0,5% serum inneholder media med eller uten AM (0-200 nM) eller AMA (1 mm), som ble oppdatert daglig, og celletall ble estimert etter 48 timer for HPSC og HUVEC celler og etter 96 timer for MLECs av MTS analysen. For siRNA studier ble HPSC, HUVEC og MLECs (1000 celler) belagt på 96-brønners plater og respektive menneske og mus siControl /siADMR /siCRLR ble transfektert og celle tall ble beregnet etter 48 timer for HPSC og HUVEC celler og etter 96 timer for MLECs. Cellevekst ble analysert ved hjelp av MTS-reagens tilsettes en time før du tar spektrofotometrisk lesing i henhold til produsentens anvisninger (Promega, Madison, WI).
In vitro
Angiogenese analysen
HUVEC og MLEC (1 x 10
4) celler ble sådd på overflaten av det polymeriserte ECMatrix fremstilt som beskrevet av produsenten (Cat # ECM625; Chemicon Intl, Millipore Corp, Billerica, Massachusetts). Cellene ble behandlet med AM (200 nM) eller AMA (1 UM) peptider og etter 6 timer tube formasjonen ble evaluert under en invertert lysmikroskop (Olympus, Center Valley, PA). Bilder ble tatt med et kjølt, CCD kamera (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) og Smart programvare (Digital Scientific, Cambridge, UK). Bilder ble videre behandlet med Adobe Photoshop-programvare (Adobe Systems, Mountain View, California). For å kvantifisere angiogene hendelser, mønstre av cellevekst i 10 tilfeldige felt på 100 × forstørrelse ble vurdert i henhold til produsentens forslag og gradert som: Individuelle celler, godt atskilt -0; Celler migrerte og justert -1; Kapillarrør synlig, ingen spirende -2; Spirende av kapillarrør -3; Lukkede polygoner dannet – 4; og komplekse mesh-lignende strukturer utviklet -5
Immunhistokjemisk farging -. CD31 /VEGF
ufargede 4 mikrometer vevssnitt fra siControl eller siADMR behandlet mus ble deparaffinized med xylen og rehydrert med etanol. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert med 3% hydrogenperoksid i metanol og ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert med protein blokkeringsløsning (5% normalt heste og 1% normalt geiteserum). Primært antistoff mot CD31 (1: 800 fortynning; cat # 01951A; BD Pharmingen, San Diego CA) /VEGF (1:100 fortynning; cat # sc-152, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ble tilsatt, og prøver ble inkubert over natten ved 4 ° C. Sekundært antistoff ble tilsatt og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Til slutt, lysbilder ble utviklet med 3,3-diaminobenzidin (DAB) substrat kontra med hematoxylin, dehydrert med etanol, festet med xylen og montert. Immunhistokjemi ble analysert ved hjelp av en omvendt lysmikroskop (Olympus, Center Valley, PA). Bilder ble tatt med et kjølt, CCD kamera (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) og Smart programvare (Digital Scientific, Cambridge, UK). Bilder ble videre behandlet med Adobe Photoshop-programvare (Adobe Systems, Mountain View, California). Lysbilder ble blindet og analysert ved IHC kjernen i Dept. of Cancer Biology, UT MDACC.
DOPC nanoliposome kombinert siRNAs.
For eksperimenter for å teste effekten av
in vivo
terapeutisk målretting av ADMR i ortotopiske tumorer i mus ble det nøytrale liposomer inneholdende sirnas fremstilt som tidligere beskrevet [24]. Kort, siRNA oligonukleotider (uten hårnåler) til ADMR målrette sekvenser (human siADMR (sanse – 5 «rGrCUrGrCUUrGrArCrCUrCUUrCrArArCTT 3»), mus siRNA følelse sekvens – 5 «rCrCUUUUrGrArArArCrGUrArCrArGrCrGTT 3») eller kontrollsekvenser (kontroll siRNA følelse sekvens – 5 «UUrCUrCrCrGrArArCrGUrGUrCrArCrGUTT 3» ) (skreddersydde menneske og mus oligos katt # menneskelig siADMR – 1.150.080, 1.150.081, Mouse siADMR – 1129085-H, 1129086-H; Control – 1.129.089, 1.129.090 fra Sigma-Aldrich (Proligo), St.Louis, MO) ble blandet med 1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-fosfatidylcholin (DOPC) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) i et forhold på 10:01 (vekt /vekt) DOPC /siRNA og frysetørket. Umiddelbart før
in vivo
administrering, frysetørkede preparater ble hydratisert i 0.9% saltløsning ved en konsentrasjon på 10 ug siRNA pr 200 ul og ble renset ved å separere fri siRNA fra liposomer med filterenheter med en størrelseseksklusjonsgrense på 30 000 Daltons (Millipore Corp, Billerica, MA).
glucose Tolerance Test.
for glukosetoleranse, ble musene injisert intraperitonealt med 1,5 mg glukose /g kroppsvekt på 9:00, etter en 16-h raskt. Blodsukker ble bestemt på angitte tider med prøver av halen blod ved bruk av det Ascensia CONTOUR blodglukosemåler (Bayer Health Care: Bli by, New York).
In vivo
studier.
Alle dyrene ble håndtert i henhold til god dyr praksis som definert av de relevante nasjonale og /eller lokale dyrevern organer, og alle dyr arbeidet ble godkjent av den aktuelle komiteen (IACUC – 09-04-08832).
ortotopiske tumor modell.
MPanc96 og BxPC3 celler som bærer shADMR eller shControl ble utviklet som nevnt i en tidligere publikasjon [3]. Disse kreft i bukspyttkjertelen celler ble ytterligere modifisert til å stabilt uttrykke ildflue luciferase genet ved lentivirus transfeksjon å lette
in vivo
overvåking av svulst utvikling [25]. Disse cellene ble dyrket til 80% konfluens, høstet ved trypsinering, vasket to ganger i PBS og resuspendert til en sluttkonsentrasjon på 1 x 10
6 celler /50 ul av MPanc96 celler og 2 x 10
6 celler /50 ul av BxPC3 celler i steril PBS og injisert i bukspyttkjertelen av fire-ukers gamle hann
atymiske nakne
mus (n = 5). Tumorvekst ble bestemt ved bioluminescens avbildning ved slutten av fire uker.
Lung og levermetastaser modeller.
Sammenligninger ble gjort mellom lunge og levermetastaser i MPanc96 celler som bærer shADMR eller shControl celler ved hjelp av godt etablerte metastasemodeller. Lungemetastaser ble utviklet av halevene-injeksjon av 1 x 10
6 celler /100 ul (n = 9) og levermetastaser av milt injeksjon av 1 x 10
6 celler /50 ul (n = 7) for å
atymiske nakne
mus og evaluert av bioluminesens imaging. Etter seks uker ble musene avlivet og organer ble skåret ut og lagret i Bouins fiksativ løsning.
Levering av DOPC nanoliposome kombinert siRNAs.
For vurdering av potensielle toksisitet, ble eksperimenter utført levere DOPC nanoliposome kombinert siControl eller siADMR (mus) til
atymiske nakne
mus (10 ug per dyr ip to ganger uke i fire uker). Vann og matinntak, kroppsvekt og blodsukker ble målt. Dyrene ble avlivet etter fire uker, bukspyttkjertelen ble isolert, og total RNA ble ekstrahert. RT-PCR ble brukt til å vurdere å stanse all ADMR, mens 18S fungert som intern kontroll. Ortotopiske tumorer ble utviklet i
atymiske nakne mus med
MPanc96 celler som bærer luciferase-gen (1 x 10
6 celler /50 ul steril PBS) og to uker senere, DOPC nanoliposome koplet siControl og siADMRs (human og mus i kombinasjon) ble levert 10 ug per dyr ip to ganger i uken i seks uker. Bioluminesens bildebehandling. Bioluminesens bildebehandling ble utført med en kryogenisk avkjølt imaging system koblet til en datainnsamling datamaskin som kjører LivingImage programvare (Xenogen Corp., Alameda, CA). Før bildebehandling, ble dyrene bedøvet i en akryl kammer med 1,5% isofluorane /luftblanding og injisert intraperitonealt med 40 mg /ml av luciferin kaliumsalt i PBS i en dose på 150 mg /kg kroppsvekt. Et digitalt gråtoner dyr bilde ble kjøpt fulgt av oppkjøp og overlegg av en pseudocolor bilde som representerer den romlige fordelingen av påviste fotoner som kommer ut av aktiv luciferase innenfor dyret. Signalintensitet ble kvantifisert som summen av alle oppdagede fotoner innenfor regionen av interesse per sekund. Etter den siste tumoravbildning, ble vevene fjernet, og dyrene ble gjen avbildes for å visualisere og telle kreftcellespredning og metastaser. Vev ble også løst med formaldehyd og histologi ble evaluert for å kontrollere riktigheten av bioluminescence data.
Statistical Analysis
Alle
in vitro
eksperimenter ble utført i tre eksemplarer og utføres på tre eller flere anledninger. Data presentert finnes hjelp av tre eller flere uavhengige forsøk ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Statistisk signifikante forskjeller mellom kontroller og behandlede prøver ble bestemt ved to-halet uparede t-test og ble definert som * p 0,05. Resultatene ble sammenlignet ved hjelp GraphPad Prism 4 programvare (GraphPad Software, https://www.graphpad.com).
Resultater
AM har autokrine effekter på HPSC, HUVEC og MLEC celler
Tidligere har vi observert at AM fungerte som en autokrint regulator av spredning, overlevelse, og motilitet av kreft i bukspyttkjertelen celler [3]. For å avgjøre om AM også påvirket HPSC, HUVEC og MLECs, vi først undersøkt om de uttrykte AM og dets reseptorer ADMR og CRLR målt ved RT-PCR. Alle tre cellelinjer uttrykte AM, ADMR og CRLR (Fig. 1A). Videre vurderes vi om disse cellene skilles AM i vev kultur media ved hjelp av en ELISA. Alle disse celletyper utskilt AM (fig. 1B), som støtter rollen til dette molekylet som en autokrin regulator i flere celletyper. For å undersøke effekten av AM om biologien til disse cellene, ble eksogene AM lagt til HPSC (Fig. 1C), HUVEC (Fig. 1 D) og MLEC (Fig. 1E) celler og spredning ble vurdert av MTS analysen. Tidligere studier indikerte at den optimale konsentrasjonen av AM var 50 nM for HPSC og 200 nM for HUVEC og MLEC-celler (data ikke vist). Tilsetting av AM på optimale konsentrasjoner stimulerte veksten av HPSCs med 29 ± 1,8% (p 0,05), HUVECs ved 25 ± 3,7% (p 0,05) og MLECs med 33 ± 4,5% (p 0,05). Videre tilsetning av AM-antagonist, AMA (1 uM), reduserte basal veksten av HPSCs med 21 ± 5,3% (p 0,05), HUVECs ved 21 ± 0,4% (p 0,05) og MLECs med 25 ± 5,1% ( p 0,05) videre støtte en autokrint rolle AM på disse cellene. For ytterligere å undersøke effekten av AM, og vi gjennomførte
in vitro
angiogenese analyser. AM stimulert polygon-formasjonen i HUVECs (Fig. 1F) og i MLECs (Fig. 1G) 6 timer sammenlignet med kontrollkulturer, og AMA blokkerte AM medierte effekten av polygon formasjon.
(A) RT-PCR viser uttrykk for AM, ADMR, og CRLR på HPSC, HUVEC og MLECs. (B) ELISA-analyse som viser sekresjon av AM fra HPSC, HUVEC og MLEC celler. Serum-fritt medium som bader disse cellene ble samlet og konsentrert og analysert for tilstedeværelse av AM. Nivåer ble beregnet som per produsentens anvisninger. (C) HPSC, (D) HUVEC, eller (E) MLEC celler (1000 celler) ble sådd ut på 96-brønners plater og AM (50 nM for HPSC og 200 nM for HUVEC og MLEC) eller AMA (1 uM) ble tilsatt til platene daglig og celle tall ble beregnet etter 48 timer for HPSC og HUVEC celler og etter 96 timer for MLECs av MTS analysen. Når sammenlignet med WT kontrollgruppen, AM stimulert proliferasjon av alle tre celletyper. Likeledes AMA behandling inhiberte basal proliferasjon av alle cellene. Viste data er midler +/- SEM (* p 0,05).
In vitro-
angiogenese-analyser ble utført med (F) HUVEC og (G) MLEC celler. Celler ble sådd ut på EC-matriks sammen med AM (200 nM) alene eller i kombinasjon med AMA (1 uM). Etter 6 timer tube formasjonen ble evaluert mikroskopisk som per produsentens anvisninger. Vist er representative mikrografer. AM konsekvent stimulert HUVEC og MLEC celler til å danne rør, mens AMA reverseres effekten av AM.
Effekten av AM på HPSC, HUVEC og MLEC celler formidles via ADMR reseptoren
Det er to potensielle reseptorer som reagerer på AM, ADMR og CRLR. Vi har tidligere rapportert at menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler uttrykker utelukkende ADMR mens HPSC og HUVEC celler uttrykte både AM reseptorer [3]. I denne studien, observerte vi at MLECs også uttrykker begge reseptorer. For å bestemme den relative betydningen av disse reseptorene vi forstummet dem uavhengig av hverandre på disse tre cellelinjene ved hjelp av siRNA teknikker. Transfeksjon med siRNA signifikant reduserte nivåer av enten ADMR eller CRLR på HPSC (fig. 2A), HUVEC (Fig. 2B) og MLECs (fig. 2C) sammenlignet med kontroll sirnas. HPSC, HUVEC og MLECs forstummet med siRNA for enten ADMR eller CRLR ble undersøkt i vekstanalyser hvor celletall ble estimert ved hjelp av MTS-metoden. Stanse all ADMR, men ikke CRLR, betydelig redusert vekst av alle disse celletyper. Stanse av ADMR redusert vekst av HPSC med 21 ± 3,4% (p 0,05) (Fig. 2D), HUVECs ved 24 ± 1,8% (p 0,05) (Fig. 2E) og MLECs med 26 ± 4,3% (p 0,05) (fig. 2F). Stanse av ADMR på HUVECs (Fig. 2G) og MLECs (fig. 2 H) fullstendig avskaffet AM mediert tube formasjon, mens tie av CRLR delvis redusert tube formasjon. Disse data samlet tyder på at autokrine effektene av AM på HPSC, HUVEC og MLEC celler formidles primært via reseptoren ADMR selv CRLR kan også ha noen effekter.
(A) HPSC og (B) HUVEC celler ble midlertidig transfektert med humane sirnas og (C) MLEC-celler ble transfektert med mus sirnas (siControl, siADMR, eller siCRLR). Etter 72 timer ble cellene høstet og protein eller RNA ble ekstrahert. Western blotting ved hjelp av humane antistoffer viser omfanget av stanse av menneskelig ADMR og CRLR i HPSC og HUVEC celler, og RT-PCR ved hjelp av muse primere viser effektene av mus siADMR og siCRLR på MLECs. P-Actin fungert som en lasting kontroll for western blotting og 18S primere fungerte som en lasting kontroll for RT-PCR. Full lengde geler er vist i figur S1. Virkningene på proliferasjon av siRNA mediert stanse av reseptorer er vist på (D) HPSC, (E) HUVEC, og (F) MLEC celler. Cellene ble transfektert med sine respektive menneskelige eller mus sirnas (siControl, siADMR, eller siCRLR) i 24 timer og deretter spredning ble anslått av MTS analysen etter ytterligere 48 timer for HPSC og HUVEC celler og 96 timer for MLECs. Stanse av ADMR men ikke CRLR forårsaket en betydelig reduksjon av spredning av disse cellene. Viste data er midler +/- SEM (* p 0,05).
In vitro
angiogenese analysen med (G) HUVEC og (H) MLEC celler. Cellene ble sådd ut på matrise gel 24 timer etter transfeksjon med sine respektive menneskelige eller mus sirnas (siControl, siADMR, eller siCRLR). Cellene ble deretter behandlet med AM (200 nM) i 6 timer og undersøkt mikroskopisk. Omfanget av røret formasjonen ble evaluert i henhold til produsentens anvisninger. Representative mikrografer vises. ADMR stanse fullstendig blokkert rør formasjon, mens CRLR stanse bare delvis redusert tube formasjon.
stanse av ADMR på kreft i bukspyttkjertelen celler redusert tumorvekst og metastase
in vivo
for å undersøke effekten av ADMR stanse på kreftceller, observerte vi veksten av ortotopiske svulster dannes fra to forskjellige bukspyttkjertelkreft cellelinjer transfektert med enten shADMR eller shControl. Tumorvolumene ble målt etter 4 uker ved bioluminescens avbildning. Tumorvolumet ble redusert med 92 ± 0,5% i ADMR stilnet MPanc96 tumorer når sammenlignet med kontroll vektor som bærer tumorer (p 0,05) (figur 3A.). Likeledes BxPC3 tumorvolumet var signifikant redusert med 83 ± 0,6% etter ADMR lyddemping i forhold til å kontrollere svulster (p 0,05) (figur 3B.). I begge tilfeller var det også en reduksjon i lunge og levermetastaser og en reduksjon i peritoneal formidling. Imidlertid, fordi ADMR stanse redusert tumorvolumet; noen reduksjon i metastase kan ha vært på grunn av den generelle nedgangen i tumorvolumet.
ortotopiske svulster ble utviklet med MPanc96 (A) eller BxPC3 (B) celler stabilt forstummet med shADMR og uttrykker luciferase genet. Etter 4 uker ble tumorvolumet beregnet ved bioluminescens avbildning og viste en signifikant reduksjon mellom ADMR og shControl vektor som bærer tumorer fra begge celletyper. Data som vises er midler +/- SEM for 10 dyr per gruppe. (* P 0,05) Bioluminesens bilder av representative mus er også gitt
stanse av ADMR på kreft i bukspyttkjertelen celler redusert metastaser
in vivo
For å direkte vurdere. rollen ADMR i bukspyttkjertelkreft lunge og levermetastaser, gjennomførte vi separate studier i
nakne
mus ved halevenen og milten injeksjon, henholdsvis. ADMR stanse reduserte forekomsten av lungemetastaser (ShControl – 67% Vs ShADMR – 22%) målt ved bioluminesens imaging (figur 4A.). Videre ble tilstedeværelse av metastaser påvises ved hjelp av bioluminesens bilde utsatt fra 2
nd uke i kontrolldyrene til 5
th uke i shADMR lagerceller. Utskårne lungene etter fiksering i Bouins oppløsning viste reduksjon i antallet lungemetastaser som er vist i den representative bilde (fig. 4C). Effekten av ADMR avstilt på levermetastaser var lik dem på lungemetastase. ADMR stanse redusert forekomsten av levermetastaser (ShControl – 100% Vs ShADMR – 43%) (figur 4B.). Tilstedeværelsen av påvisbare metastaser ble utsatt fra 2
nd uke inntil 5
th uke. Reduksjon i antallet levermetastaser er vist som et representativt bilde (fig. 4D). Disse dataene indikerer at AM kan fungere som en metastase induser av kreft i bukspyttkjertelen celler og disse effektene av AM på kreftceller formidles via reseptor ADMR.
MPanc96 celler som bærer luciferase genet stabilt transfektert med shControl eller shADMR celler ble injisert i halevenen til å måle lungemetastase og inn i milten for å måle levermetastaser. Dyr peiling ADMR forstummet celler viste reduksjon i forekomst av lunge (A) og levermetastaser (B) målt ved bioluminesens imaging. Etter 6 uker ble musene avlivet og lunge og lever er også skåret ut og undersøkt grovt og histologisk. Stabil stanse av ADMR redusert antall metastaser på lunge og lever i forhold til shControl. Representative bildene viser reduksjon i antall metastaser i lungene (C) og lever (D).
I
n vivo
målretting av ADMR hjelp systemisk levering av siRNAs er svært effektiv på å redusere tumorvekst
Våre data støtter en rolle for ADMR i virkningene av AM på kreft i bukspyttkjertelen celler.
