Abstract
onkogen FOXM1 har vært innblandet i alle store typer kreft hos mennesker. Vi har nylig vist at avvikende ekspresjon FOXM1 bevirker utvidelse stamcellelinjen som fører til initiering av hyperplasi. Vi har tidligere vist at FOXM1 regulerer
HELLS
, en SNF2 /helicase involvert i DNA metylering, impliserer
FOXM1
i epigenetisk regulering. Her har vi demonstrert med primær normale menneskelige orale keratinocytter (NOK) som oppregulering av
FOXM1
undertrykte tumorsuppressorgenet
p16
INK4A product: (
CDKN2A
) gjennom promoter hypermethylation. Knockdown av
HELLS
hjelp siRNA re-aktivert mRNA uttrykk for
p16
INK4A Hotell og samtidig nedregulering av to DNA metyltransferaser
DNMT1 Hotell og
DNMT3B
. Den doseavhengige oppregulering av endogent
FOXM1 plakater (isoform B) uttrykk under tumorprogresjon over et panel av normale primær kroner stammer (n = 8), dysplasier (n = 5) og hode og hals plateepitelkarsinom ( HNSCC) cellelinjer (n = 11) positivt korrelert med endogene uttrykk for
HELLS
,
BMI1
,
DNMT1 Hotell og
DNMT3B Hotell og negativt med
p16
INK4A Hotell og involucrin. Bisulfite modifikasjon og metylering-promoter analyse ved hjelp av absolutt kvantitativ PCR (MS-qPCR) viste at oppregulering av
FOXM1
betydelig indusert
p16
INK4A
promoter hypermethylation (10 ganger, P 0,05) i primær kroner celler. Ved hjelp av en ikke-skjevhet genom-wide promoter metylering microarray profilering metode, vi avdekket at avvikende
FOXM1
uttrykk i primær kroner indusert en global hypometylering mønster lik den som finnes i en HNSCC (SCC15) cellelinje. Etter validering eksperimenter med absolutt qPCR, har vi identifisert et sett av ulikt denaturert gener, funnet å være omvendt korrelert med
in vivo
mRNA uttrykk nivåer av klinisk HNSCC svulst biopsiprøver. Denne studien gitt den første bevis, ved hjelp av primære normal humane celler og tumorvev, som avvikende oppregulering av
FOXM1
orkestrert en DNA metylering signatur som etterligner kreft methylome landskapet, som vi har identifisert en unik
FOXM1
indusert epigenetisk signatur som kan ha kliniske translasjonsforskning potensialer som biomarkører for tidlig kreft screening, diagnostiske og /eller terapeutiske intervensjoner
Citation:. Teh MT, Gemenetzidis E, Patel D, Tariq R, Nadir A, Bahta AW, et al. (2012) FOXM1 induserer en global Metylering signatur som etterligner Kreft epigenome i Head and Neck Plateepitelkarsinom. PLoS ONE 7 (3): e34329. doi: 10,1371 /journal.pone.0034329
Redaktør: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 28 november 2011; Godkjent: 26 februar 2012; Publisert: 26 mars 2012
Copyright: © 2012 Teh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble co-finansiert av Wellcome Trust (MTT, EG), Facial Surgery Research Foundation – Saving Faces (MTT, AW) og institutt for klinisk odontologi (DP, RT, AN), Barts og London School of Medicine og odontologi, Queen Mary University of London. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Forstå epigenetisk mekanisme som regulerer stamcelle skjebne besluttsomhet gir grunnleggende innsikt i fysiologi av vev gjenfødelse og patogenesen av kreft. Det best studerte epigenetisk mekanisme forstyrret i løpet av kreft initiering og progresjon er DNA-metylering, som er kjemisk legger metylgrupper til cytosines ved deres 5′-posisjoner, hovedsaklig ved CpG-dinukleotider i pattedyr genomisk DNA [1]. DNA metylering innebærer tre viktige DNA metyltransferaser: DNMT1, DNMT3A og DNMT3B. DNMT1 har klassisk vært innblandet i vedlikehold av eksisterende metylert DNA, mens DNMT3A og DNTM3B i
de novo
DNA metylering [1]. Den arvelige natur av DNA-metylering gjør det mulig for cellene å bestemme celle potens /skjebne uten å endre den primære sekvensen til genomisk DNA. Reversibel DNA metylering programmering gjør celle skjebne spesifikasjon svært plast og reversible. Epigenetisk omprogrammering som involverer endringer i DNA-metylering har vært implisert i alle faser av kreft utviklingen [2], [3]. Det har også blitt vist at epigenetisk reprogrammerings går forut for initiering av kreftlignende stammen /stamceller [4]. Det er nå godt akseptert at kreftceller utnytte reversible og arvelige egenskaper av DNA metylering å forstyrre balansen mellom stilk /stamcellefornyelse og differensiering og dermed fremme kreft initiering og progresjon [2], [3], [4].
FOXM1 (isoform B) ble først funnet å være en nedstrøms målet for en onkogen Sonic Hedgehog signalveien via en glioma familie sink finger transkripsjonsfaktor 1 (Gli1) i basalcellekreft [5]. Etterfølgende studier viste at FOXM1 ble overalt oppregulert i de fleste humane cancere [6], [7] som omfatter hjerne, lever, bryst, lunge, mage, pancreas, colon, nyre, blære, prostata, testikkel, ovarie, uterus, cervix , blod (akutt myelogen leukemi), kutan melanom, hode og hals plateepitelkarsinom [8], [9].
i søken etter å forstå onkogene mekanisme FOXM1, vi har nylig vist at FOXM1 induserer kreft initiering ved å fremme voksent menneske epitelial stilk /stamceller fornyelse og ved å motvirke differensiering [10]. Andre har vist at FOXM1 spiller en nøkkelrolle i å opprettholde stilk /stamceller fornyelse gjennom pluripotency gener inkludert
Oct4
,
Nanog
,
Sox2 Hotell og
Bmi1
[11], [12]. Vår tidligere arbeid identifisert en FOXM1 nedstrøms mål
HELLS product: [8], et humane embryonale stamcellefaktor /lymfoid spesifikke SNF2 /helicase involvert i kromatin remodellering og DNA metylering [13], [14], impliserer FOXM1 i epigenetisk regulering under stilk /stamceller fornyelse [8], [10]. Men det var uklart om FOXM1 har en rolle i epigenetisk regulering. I denne studien med primær normale menneskelige orale keratinocytter og hode og nakke plateepitelkreft (HNSCC) tumorcellelinjer og tumorbiopsi vev undersøkte vi rollen FOXM1 i reguleringen av genet promoter metylering både enkelt gen og genom-wide nivåer . Dette førte til det første bevis i normale primære humane orale epitelceller som FOXM1 induserer en metylering landskapet som ligner en kreft epigenome funnet i HNSCC tumorvev.
Metoder
Kliniske Vev
bruken av menneskelig vev i denne studien er godkjent av våre vertsinstitusjoner (Barts London NHS Trust og School of Medicine Dentistry, Queen Mary University of London) og Storbritannia nasjonale forskningsetiske komité. Alle kliniske prøver, som var overskudd til diagnose, ble samlet i henhold til lokale etisk komité godkjente protokoller og skriftlig informert pasienten samtykke ble innhentet fra alle deltakerne. Par av normal margin og HNSCC svulst kjerne vev biopsi var histopatologiske pre-godkjent av våre samarbeids patologer før bruk for denne studien. Fersk biopsi vevsprøver ble bevart i RNA
Senere plakater (Cat # AM7022, ambion, Applied Biosystems, Warrington, UK) og lagret kortsiktig på enten 4 ° C (1-2 dager) eller -20 ° C (opp til en uke) før transport og påfølgende langtidslagring ved -80 ° C inntil bruk.
Cell kultur
Alle primære normale menneskelige orale keratinocytter (OK355, HOKG, OK113, kroner, NOK1, NOK3, NOK 16 og NOK376) ble hentet fra normale munnslimhinnen vev donert av friske sykdomsfrie individer som gjennomgår visdom tanntrekking og kultivert som tidligere beskrevet [8], [15]. Oral dysplastiske forstadier til kreft cellelinjer (OKF6 /T [16], POE9n [17], DOK [18], D19 [19], D20 [19]) og muntlig SCC cellelinjer (SCC4 [20], SCC9 [20], SCC15 [20], SCC25 [20], SqCC /Y1 [21], UK1 [22], VB6 [22], CaLH2 [22], CaDec12 [22], 5PT [22], H357 [22]), SVpgC2a [23 ] og SVFN1-8 [8] var alle godt etablerte cellelinjer dyrket som beskrevet tidligere [8], [10], [15].
Immunoblotting
Protein ekstraksjon og separasjon på SDS siders geler og immunblotting ble utført som beskrevet tidligere (5). En mus monoklonalt antistoff for
INK4A p16 (1:2000 fortynning, Cat # 551154, BD Biosciences) og en kanin polyklonale anti-GAPDH (1:20,000 fortynning, Cat # 9485, Abcam) ble brukt for immunoblotting
.
RNA interferens
Pre-validert genspesifikke siHELLS (ON-TARGETplus SMARTpool HELLS, Cat # L-017444-09,10,11,12), kontrollere siCTRL (ON-TARGETplus Non-targeting Pool , Cat # D-001810-10-05) og siRNA transfeksjon reagens (DharmaFECT 1, Cat # T-2001-02) ble kjøpt fra Dharmacon, Thermo Fisher Scientific. En innledende dose-respons-forsøk ble utført i henhold til produsentens instruksjoner for å bestemme optimal transfeksjon effektivitet. siRNA ved 10 nM (48 timers inkubasjon) ble funnet å være det optimale sluttkonsentrasjonen som ble derfor benyttet i alle etterfølgende eksperimenter. Effekten av genet Slå ble validert ved kvantifisering av målgenet mRNA uttrykket (
HELLS
) av absolutt revers transkripsjon qPCR.
Retroviral transduksjon
Retrovirale supernatanten og transduksjon prosedyrer var utføres ved hjelp av de etablerte protokoller [8], [10], [15]. Like nivåer av
EGFP Hotell og
FOXM1 plakater (isoform B) uttrykk ble oppnådd ved serieretroviral supernatant titrering eksperiment og deretter
EGFP
plasmid kopiere nummer bekreftet av qPCR hjelp genomisk DNA ekstrahert fra transduced celler i henhold til vår tidligere etablert metode [15]. Nivåene av ektopisk
FOXM1
uttrykk i de primære keratinocyter ble titrert for å replikere nivåene funnet i kreftceller som rapportert tidligere [8], [10], [15] (se figur 1C). Transduced celler ble dyrket i 3-5 dager for å tillate transgene uttrykk før eksperimentere.
(A) FOXM1 betydelig undertrykker
p16
INK4A
mRNA og protein uttrykk (innfelt bilde) i primær normale menneskelige keratinocytter. GAPDH ble brukt som en kontroll for protein lasting. Kontrollceller (mock-transduced med tomme retrovirale partikler eller EGFP-omformet) viste ikke signifikant undertrykkelse av p16
INK4A uttrykk. (B) knockdown av en FOXM1-target gen
HELLS
, som regulerer genom-wide metylering [14], indusert
p16
INK4A Hotell og samtidig undertrykt
DNMT1
og
DNMT3B
, men ikke
DNMT3A
mRNA uttrykk i en FOXM1-transformert ondartet cellelinje (SVFN5) uttrykker konstituerende nivåer av endogen
HELLS product: [8]. Hver søyle representerer et gjennomsnitt ± SEM av tre eksemplarer transfeksjon (48 h) med enten siCTRL eller siHELLS. * P 0,05, ** P 0,01 og *** P 0,001 indikere nivået av statistisk signifikans sammenlignet med kontroller. (C) Endogene
FOXM1 plakater (isoform B) mRNA uttrykk nivåer i 8 stammer av primære humane normale orale keratinocytter, 5 dysplastiske og 11 HNSCC cellelinjer. Total
FOXM1
mRNA uttrykk nivåene ble målt i EGFP og FOXM1-omformet kroner (NOKG og NOKF), henholdsvis. (D-J) Tredje polynomregresjonsanalyse analyser ble utført for å skaffe R
2 determinantkoeffisient verdier som viser betydningen av co-uttrykk mellom hvert gen med
FOXM1
over 24 cellestammer /linjer indikert i panel C.
nukleinsyrer Emner av vev og celler
Alle vev biopsi ble fordøyd av proteinase K (Cat # 03115887001, Roche Diagnostics Ltd., England, UK) før samtidig mRNA utvinning (Dynabeads mRNA Direkte kit, Cat # 610,12, Invitrogen) og genomisk DNA (gDNA) ekstraksjon (ved standard phenol:chloroform metoden på mRNA-utarmet lystates). mRNA ble umiddelbart revers transkribert til cDNA (Transcriptor cDNA Synthesis kit, Cat # 04897030001, Roche Diagnostics). gDNA ble fragmentert av
MseI
fordøyelse (37 ° C, 16 timer) før berikelse for CpG-metylert DNA ved hjelp av en MBD2b /MBD3L1-konjugert magnetiske kuler-basert system i henhold til produsentens protokoll (MethylCollector Ultra kit, Cat # 55005, Aktiv Motif Europa, Belgia).
Genome-wide Arrangøren metylering Profilering
Ifølge produsentens protokoll og krav, innspill
MseI
-digested gDNA og metylering-beriket DNA fra hver celleprøve (NOKG, NOKF og SCC15) ble forsterket for å generere 6 mikrogram DNA ved hjelp WGA2 GenomePlex (Sigma) før microarray eksperimenter utført av Roche NimbleGen microarray tjeneste ved hjelp av menneskelig DNA Metylering 3x720K CpG Island Plus RefSeq Arrangøren Array (Cat # 05 924 600 001, NimbleGen System, Reykjavík, Island) basert på genomet bygget HG18, med promoter oppstrøms /nedstrøms tilling av -2.44 /+ 0,61 kb, som dekker totalt 27,728 CpG øyer over hele genomet (GEO Platform: GPL14361). Microarray data som genereres i denne studien er MIAME kompatibel og har blitt deponert i en MIAME kompatibel database på Gene Expression Omnibus repository (GEO Series tilgangsnummer: GSE31767)
Sanntids absolutt kvantitativ PCR
. standard kurve-basert real-time absolutt kvantitativ PCR ble utført ved hjelp av SYBR Grønn jeg Master (Cat # 04887352001, Roche Diagnostics Ltd, England, UK) i 384-brønnen LightCycler 480 qPCR system (Roche) i henhold til våre etablerte protokoller [8] [9], [15] som er MIQE kompatible [24]. Metylering-spesifikk PCR-betingelsene ble utført som beskrevet tidligere [25], [26]. Alle primerene anvendt i denne undersøkelse er oppført i figur S1. Tidligere validert isoform B-spesifikke FOXM1 primere ble anvendt for spesifikt å kvantifisere FOXM1 (isoform B) mRNA-ekspresjon i dette studiet [8]. Alle målgener ble normalisert til to stabile referansegener (YAP1 og POLR2A) tidligere er validert for å være blant de mest stabile referansegener over et bredt spekter av primære humane orale celler, dysplastiske og HNSCC cellelinjer [8].
resultater og diskusjon
Gitt våre tidligere funn at FOXM1 (isoform B) fremmet stilk /stamceller fornyelse gjennom perturbing differensiering vei [10], vi først avhørt involvering av en tumor suppressor gen
p16
INK4A product: (
CDKN2A
) gitt at det har vist seg å regulere epitelial stilk /stamcelledifferensiering [27], og det er den mest vanlige inaktiverte genet i cancer [28]. Her viste vi at ektopisk
FOXM1
uttrykk trykkes både mRNA og protein uttrykk for p16
INK4A i primære humane orale keratinocytter (figur 1A). Dessverre, som rapportert tidligere stanse endogen
FOXM1
uttrykk forårsaker cellesyklus arrest [29] som utelukket ytterligere eksperimenter med RNAi på notorisk sensitive primære humane orale keratinocytter [8], [10]. Likevel, vår
FOXM1
overekspresjon eksperimenter entydig viste at
FOXM1
oppregulering trykkes
p16
INK4A
genekspresjon i primære humane orale keratinocytter. Dette er i samsvar med tidligere funn om at
FOXM1
undertrykker senescence vei mediert av
p16
INK4A
i kreftceller [30].
Inaktivering av
p16
INK4A
genuttrykk kan være et resultat av en rekke mekanismer, inkludert genet sletting og formidler hypermethylation. Gitt at FOXM1 mål
HELLS
som regulerer DNA metylering [13], [14], hypotese vi at FOXM1 kan undertrykke
p16
INK4A
uttrykk gjennom arrangøren hypermethylation via
HELLS
. For å teste dette, knockeddown vi
HELLS
av siRNA i en HNSCC cellelinje SVFN5, en FOXM1-indusert forvandlet oral kinn keratinocyte SVpgC2a linjen [8], som uttrykker høye nivåer av endogen
HELLS Hotell og lave nivåer av
p16
INK4A
. Dette fører til re-aktivering av mRNA uttrykk for
p16
INK4A plakater (figur 1B) og samtidig nedregulering av to DNA metyltransferaser
DNMT1 Hotell og
DNMT3B
men ingen effekt på
DNMT3A
uttrykk. Det faktum at
p16
INK4A
hemming kan bli reaktivert argumenterer mot genet sletting som en mekanisme for
p16
INK4A
inaktivering. Våre resultater er i samsvar med tidligere funn om at
HELLS
samhandler med
DNMT1 Hotell og
DNMT3B product: [31] for å undertrykke
p16
INK4A
genekspresjon [32] gjennom epigenetiske modifikasjoner.
for ytterligere å bekrefte at uttrykket av
FOXM1
,
HELLS Hotell og
p16
INK4A
gener korrelerer med kreft progresjon og om det er noen assosiasjoner med gener involvert i DNA metylering, vi målte endogene mRNA uttrykk nivåer av
FOXM1
,
p16
INK4A
,
HELLS
BMI1
, involucrin (
IVL
, en differensiering markør har vist seg å være negativt regulert av
FOXM1 product: [10]) og 3 viktige DNA metyltransferaser (
DNMT1
,
DNMT3A
,
DNMT3B
) i et panel av 24 cellestammer /linjer som består av 8 stammer av primære normale menneskelige orale keratinocytter (fra normale munnslimhinnen vev), 5 dysplasi og 11 HNSCC cellelinjer.
i overensstemmelse med tidligere funn [8], [10],
FOXM1
viste oppregulering doseavhengige i løpet av tumor progresjon fra dysplasi til HNSCC (figur 1C). Across the panel av 24 cellestammer /linjer, har vi funnet ut at den endogene mRNA uttrykk for
FOXM1
korrelert omvendt med
p16
INK4A
men korrelasjonen effektivitet var svak (R
2 = 0,23, figur 1D). Den nedregulering av
p16
INK4A
uttrykk ble funnet å være mer uttalt hos dysplastiske forhold til HNSCC cellelinjer. Slike
p16
INK4A
uttrykk mønsteret er helt enig med
in vivo p16
INK4A
protein uttrykk mønster funnet i oral dysplasi og SCC vev [33]. Konsekvent,
BMI1
, en polycomb gruppe onkogen som er et oppstrøms regulator av
p16
INK4A
genet [34], og også et nedstrøms mål av FOXM1 [12], [30], viste positive co-uttrykk med
FOXM1 product: (R
2 = 0,64, figur 1E), men svak invers korrelasjon med
p16
INK4A product: (R
2 = 0,42, data ikke vist) støtter bevis for at
p16
INK4A
uttrykk er uavhengig regulert av
BMI1
under oral kreftutvikling [35]. De uharmoniske uttrykk nivåer mellom
FOXM1 Hotell og
p16
INK4A
i kreftceller kan skyldes det faktum at
p16
INK4A
kan deregulert gjennom en antall forskjellige mekanismer, slik som inaktivering av mutasjon (kan resultere i oppregulering på grunn av feedback mekanisme), genet delesjon, genamplifikasjon (av funksjonelt gen, men defekt nedstrøms signalisering), promoter hypermethylation, etc. Dette kan resultere i varierende
p16
INK4A
uttrykk uavhengig av
FOXM1
nivåer i de «kreft» cellelinjer. Derfor mens
FOXM1
kan indusere arrangøren hypermethylation av
p16
INK4A
i «normale» celler, slik effekt kan bli forstyrret i «kreft» celler.
Expression av
DNMT1 product: (R
2 = 0,84, figur 1 H) og
DNMT3B product: (R
2 = 0,89, figur 1J), men ikke
DNMT3A
(R
2 = 0,13; Figur 1I), viste signifikant positiv co-uttrykk med
FOXM1
som er i samsvar med våre funn ovenfor (figur 1B) som stanse
FOXM1 Anmeldelser – nedstrøms mål
HELLS
ført til samtidig nedregulering av
DNMT1 Hotell og
DNMT3B
men ingen effekt på
DNMT3A
uttrykk. Det er uklart hvorfor
DNMT3A
ble ikke påvirket. Publisert litteratur viser at selv om begge
DNMT3A Hotell og
DNMT3B
er involvert i
de novo
metyltransferase aktivitet, de tjener ikke-overlappende roller [1]. Likevel, involvering av både
DNMT1 Hotell og
DNMT3B
impliserer en rolle for
FOXM1 Hotell og
HELLS
i utløser både vedlikehold og
de novo
DNA metylering aktiviteter [1]. Expectedly,
HELLS
var positivt (R
2 = 0,76, figur 1F) og
IVL
ble negativt (R
2 = 0,52, figur 1G) korrelert med
FOXM1
som vist tidligere [8], [9], [10]. Sammen er disse resultatene gir det første bevis på menneskeceller som
FOXM1
kan opptre gjennom
HELLS
,
DNMT1 Hotell og
DNMT3B
å undertrykke
p16
INK4A
genuttrykk. Gitt at
HELLS
,
DNMT1 Hotell og
DNMT3B
har tidligere vist seg å modulere
p16
INK4A
arrangøren metylering [31], [32 ], hypotese vi at
FOXM1
kan utløse
p16
INK4A
genet stanse gjennom arrangøren hypermethylation.
for å undersøke promoter CpG DNA metylering, vi kvantifisert nivået
p16
INK4A
arrangøren metylering ved hjelp bisulfite modifikasjon og metylering spesifikke kvantitativ PCR (MS-qPCR Figur 2A og figur S1). Overekspresjon av
FOXM1
, men ikke
EGFP
, ble funnet å indusere
p16
INK4A
promoter hypermethylation (P 0,05) som ble vesentlig tilbake (P 0,001 ) av en DNA demethylating middel 5-aza-2′-deoxycytidine (5Aza) i primære humane orale keratinocytter (figur 2B). Resultatene bekreftet en rolle
FOXM1
i å undertrykke
p16
INK4A
uttrykk gjennom promoter hypermethylation. Til støtte for
FOXM1
initiere onkogenese gjennom hemming av
p16
INK4A
, det har vist seg at epigenetisk stanse av
p16
INK4A
induserer cellulær immortalisation i mus embryonale fibroblaster [36]. Videre våre tidligere funn at
FOXM1
ekspresjon ko-uttrykkes med en epitelial stamcelle markør ΔNp63α i prolifererende stammen /progenitor oral keratinocytt subpopulasjon [10], og som ΔNp63α har vist seg å målrette
HELLS
for å indusere plateepitelkarsinom dannelse hos mus [37], sammen antyder en mulig rolle for
FOXM1 plakater (via
HELLS
) i utløser onkogenese gjennom stanse
p16
INK4A
. Den nøyaktige mekanismen onkogen er utenfor omfanget av denne studien. Likevel, våre nåværende data som gir det første bevis på at
FOXM1
er i stand til å indusere arrangøren hypermethylation på et enkelt gen nivå tilbyr et glimt av muligheten for at avvikende oppregulering av
FOXM1
kan forstyrre den epigenetisk regulering av DNA metylering på genom-wide nivå.
(A) Bisulfite modifikasjon og metylering spesifikk absolutt qPCR for kvantifisering av
p16
INK4A
promoter metylering status. Genomisk DNA ble først behandlet med natriumbisulfitt før PCR pre-forsterkning av promoter-regionen i
p16
INK4A plakater (PCR
BS, 273 bp). Metylering spesifikke (p16M-R /F) og metylering-uavhengig (p16U-F /R) primere ble deretter brukt for å kvantifisere de relative nivåer av denaturert og unmethylated produkter innen PCR
BS prøve ved anvendelse av standardkurve basert absolutte qPCR metode for hvert produkt, respektivt. Smelte analyse ble utført for å validere qPCR spesifisitet i å oppdage de to M og U-produkter. (B) Bisulfite omdannelse og metylering spesifikk qPCR ble utført for å måle de relative nivåer av unmethylated (U, som smelter ved temperatur 85,8 ° C) og metanoldenaturert (M, 91,2 ° C) i enten EGFP- eller FOXM1-transduserte primær kroner behandlet med enten bærer (DMSO) eller 5Aza (1 uM, 3-dagers inkubering med ferskt medikamentfylling daglig). Totalt n = 11 replikater fra minst 4 uavhengige eksperimenter ble utført. Statistiske t-test betydning notasjoner * P 0,05 og *** P. 0,001
Vi og andre har tidligere etablert en sentral rolle for
FOXM1
i vedlikehold av genomet stabilitet hvor avvikende
FOXM1
uttrykk fører til global genomisk ustabilitet [8], [15], [38]. Videre funnene som
FOXM1
er rettet mot en epigenetisk /stamcelle modulator
HELLS
under initiering kreft [8], [14] og
FOXM1
direkte induserer
p16
INK4A
promoter hypermethylation (figur 2) bedt oss om å hypothesise at avvikende oppregulering av
FOXM1
perturbs den methylome. For å teste denne hypotesen, utførte vi en ikke-skjevhet genom-wide promoter metylering microarray profilering på primære normale muntlige humane keratinocytter (NOK) enten overuttrykker en kontroll gen
EGFP plakater (NOKG) eller
FOXM1
(NOKF) (se figur 1C for
FOXM1
genuttrykk nivåer av NOKG og NOKF celler), og også på en HNSCC cellelinje (SCC15). SCC15 ble valgt i dette studium som en positiv kontroll på grunn av promotoren
p16
INK4A
gen (CDKN2A) har tidligere blitt vist å være hypermethylated og kan reaktiveres ved 5Aza [39], og dermed tillater oss å validere metylering array-data.
FOXM1
ble funnet å indusere en global hypometylering mønster lik den som finnes i HNSCC cellelinje, sammenlignet med kontroll kr celler uttrykker
EGFP plakater (figur 3A). Sammenligning av metylering mønstre ved regresjon korrelasjon analyserer blant de tre celletyper (NOKG, NOKF og SCC15), bare NOKF vs SCC15 ga en positiv korrelasjon mønster, mens NOKF eller SCC15 hver produsert en invers korrelasjon med kontroll NOKG (figur 3B). Dette indikerer at overekspresjon av
FOXM1
, men ikke
EGFP
induserer en metylering landskapet lik den som finnes i SCC15. Både global hypometylering og focal hypermethylation (påvirker enkeltgener) er typiske metylering mønstre funnet i kreft [2], [3]. Det faktum at oppregulering av FOXM1 induserer disse metylering mønstre i «normale» celler indikerer at avvikende uttrykk for FOXM1 forandrer metylering landskapet mot de av kreft. Konsekvensen av global hypometylering har vist seg å føre til genomiske ustabilitet [2], [3], dette kan gi en mekanisme for våre tidligere funn om at avvikende FOXM1 ekspresjon fører til genomiske ustabilitet i primære normale humane keratinocytter [8], [15]. Selv om global hypometylering syntes å være den dominerende effekt, har det vist seg at fokus hypermethylation stanse viktige tumorsuppressorgener (f.eks.
p16
INK4A
) spiller også viktig rolle i onkogenese [2], [3] .
(A) Genome-wide promoter microarray analyse av primære normale muntlige humane keratinocytter uttrykker enten
EGFP plakater (NOKG, sorte prikker) eller
FOXM1
(NOKF, gule prikker ) og en etablert plateepitelkarsinom cellelinje (SCC15, røde prikker). Hvert punkt representerer et enkelt gen. (B) En ikke-lineær to
nd polynomregresjonsanalyse analysene ble utført på de relative metylering mønstre mellom NOKG vs NOKF (invers korrelasjon), NOKG vs SCC15 (invers korrelasjon) og NOKF vs SCC15 (positiv korrelasjon). (C) Gene utvalgskriterier for differensiert metylert gener mellom kontroll (NOKG) og tester grupper (NOKF og SCC15). 100 mest hypermethylated og 100-mest hypomethylated gener ble omvendt matchet med ulikt denaturert gener fra NOKF og SCC15. Den tilstøtende genet listene viser nominert FOXM1-indusert (også funnet i SCC15) forskjellig hypermethylated (rød) og hypomethylated (grønn) gener i forhold til å kontrollere NOKG celler. De CDKN2A (koder
p16
INK4A
) genet, sin promoter kjent for å være hypermethylated i HNSCC, ble inkludert som en positiv kontroll for arrangøren hypermethylation. (D) Klinisk svulst vevsprøve sammenheng mellom de relative nivåer av metylering og genuttrykk av hver nominert genet i en kohort av 10 pasienter med paret normal margin og prøver HNSCC svulst vev. Hvert punkt representerer gjennomsnitt ± SEM av hvert gen. Vertikale feilfelt ble avledet fra relativ genekspresjon av 10 margin-svulstvev parene og horisontale feilfelt ble utledet fra relative arrangøren metylering av tre uavhengige primære kroner (NOKG /NOKF) eksperimenter. Korrelasjonskoeffisient (R
2) av en ikke-lineær to
nd polynomregresjonsanalyse analyser ble utført på alle 30 kandidatgener (venstre panel), 16 hypermethylated gener (midten panel) eller 14 hypomethylated gener (høyre panel) henholdsvis.
For å validere vår hypotese at
FOXM1
-orchestrated en metylering signatur som etterligner en kreft methylome, differensielt denaturert gener (100 mest hypomethylated og 100 mest hypermethylated) ble opprinnelig valgt for inverse sammenligninger mellom NOKG og NOKF /SCC15, og en undergruppe av 30 konsensus gener, delt mellom NOKF og SCC15 celler, med motstridende metylering status til NOKG kontrollceller, ble senere nominert for videre analyser (Figur 3C). Hvis disse kandidat
FOXM1
indusert differentially denaturert gener var faktisk en epigenetisk signatur av kreft, hypotese vi at HNSCC tumorvev bør beholde en invers
in vivo
mRNA uttrykk signatur av disse kandidat gener. For å bekrefte dette, utførte vi absolutt qPCR å kvantifisere hver av de 30 kandidatgener: Jeg, relative nivåer av promoter DNA metylering av hvert gen i NOKG vs NOKF celler, og ii, de relative mRNA uttrykk nivåer i paret normal margin vs HNSCC svulst vevsprøver. Korrelasjon regresjonsanalyser av de 30 kandidatgener viste en invers sammenheng (R
2 = 0,62, figur 3D, venstre panel). Mellom genuttrykk av HNSCC tumorvev og DNA metylering av NOKF celler
Interessant, hypomethylated gener viste signifikant høyere invers korrelasjon mønster (R
2 = 0,92, figur 3D, panel høyre) enn hypermethylated gener (R
2 = 0,27, figur 3D, midtre panelet). Dette tyder på at arrangøren hypometylering viste en sterkere effekt på transkripsjonen aktivering forhold til arrangøren hypermethylation på transkripsjonen undertrykkelse. En forklaring kan være at det kan være lettere å oppdage transkripsjonen aktivering følgende promoter hypometylering i motsetning til å oppdage transkripsjonen undertrykkelsen som avhenger av om genene ble aktivert før hypermethylation. Våre resultater indikerer at hypo /hypermethylation ikke kan være en enkel symmetrisk /på-bryter for gentranskripsjon. Videre studier er nødvendig for å avgrense transkripsjonsmekanismer regulert av promoter DNA metylering /demetylering.
Av en liste over 15 nye
FOXM1
indusert hypermethylated gener (Figur 3D, midtre panelet), 4 gener (
C6orf136
,
MGAT1
,
NDUFA10 Hotell og
PAFAH1B3
) hadde signifikant nedregulert mRNA uttrykk nivåer i HNSCC svulster, sammen med den positive kontroll
p16
INK4A product: (
CDKN2A
). Lite publisert genet informasjon var tilgjengelig for
C6orf136
.
