Abstract
Stor innsats har blitt gjort for å utvikle nye og effektive behandlingsformer mot kreft i bukspyttkjertelen for å bedre de behandlingsresultatene. Tumor-nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) er en slik terapeutisk cytokin med selektiv drapet effekt mot ondartede celler. Men noen menneskelige bukspyttkjertel kreft er egentlig motstandsdyktig mot TRAIL-mediert apoptose eller terapi. I denne studien har vi vist at histondeacetylase inhibitor LBH589 kan synergize med TRAIL å forsterke apoptose selv i TRAIL-resistente celler. LBH589 redusert c-FLIP-nivåer i hver testet cellelinje og Survivin nivåene i noen av de testede cellelinjer. Tvangs uttrykk for ektopisk c-FLIP, men ikke Survivin, avskaffet samarbeid induksjon av apoptose av kombinasjonen av LBH589 og TRAIL, noe som indikerer at c-FLIP downregulation spiller en avgjørende rolle i LBH589 sensibilisering av kreft i bukspyttkjertelen celler til stien. Videre redusert LBH589 c-FLIP stabilitet og nærværet av den proteasominhibitor MG132 forhindret c-FLIP fra reduksjon av LBH589. Tilsvarende, vi har oppdaget økte nivåer av ubiqutinated c-FLIP i LBH589-behandlede celler. Disse dataene indikerer således at LBH589 fremmer ubiqutin /proteasome-mediert degradering av c-FLIP, som fører til nedregulering av c-FLIP. Kollektivt, induserer LBH589 c-FLIP degradering og følgelig sensitizes kreft i bukspyttkjertelen celler til TRAIL-indusert apoptose, fremhever en roman terapeutisk regime mot bukspyttkjertelkreft
Citation. Kauh J, Vifte S, Xia M, Yue P, Yang L, Khuri FR, et al. (2010) c-FLIP Nedbrytning formidler Sensibilisering av kreft i bukspyttkjertelen celler i Trail-indusert apoptose av histondeacetylase Inhibitor LBH589. PLoS ONE 5 (4): e10376. doi: 10,1371 /journal.pone.0010376
Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 12 mars 2010; Godkjent: 07.04.2010; Publisert: 28 april 2010
Copyright: © 2010 Kauh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Georgia Cancer Coalition Distinguished Cancer Scholar award (til SY. S.) og avdelings forskningsfond (til JK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en av de vanskeligste formene for kreft selv om det utgjør bare 3% av alle krefttilfeller. Til tross for flere kliniske studier med nye kjemoterapeutika, i løpet av de siste 25 årene har fem års overlevelse på 5%, og median overlevelse på 6 måneder har stort sett vært uendret. Median overlevelse er ca 6 måneder [1], [2]. En årsak til dårlig overlevelse av kreft i bukspyttkjertelen er den ufølsomhet for de fleste konvensjonelle behandling, inklusive kjemoterapi og strålebehandling [3]. Således er nye og effektive terapeutiske midler eller regimer et presserende behov for behandling av kreft i bukspyttkjertelen.
Apoptose er en viktig del av mekanismer som opprettholder normalt vev homeostase [4]. Deregulering av apoptose maskiner og unndragelse av apoptose er en generell mekanisme i kreft. De fleste chemotherapies virke ved induksjon av apoptose. Derfor unndragelse av apoptose er hovedsakelig ansvarlig for insuffisiens av dagens behandling [2], [5]. Det er vel kjent at celler kan dø av apoptose primært gjennom den ytre døden reseptor-induserte bane og /eller den indre mitokondriene-mediert reaksjonsvei [6]. Aktiveringen av den ytre død reseptor-mediert apoptotiske reaksjonsvei omfatter ligering av en død ligand (for eksempel tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand; TRAIL) med dens tilhørende celleoverflate død-reseptor (er) eller aggregering (f.eks trimerisering) av død reseptorer, som fører til dannelsen av den dødsinduserende signale kompleks (DISC) etterfulgt av aktivering spalting av caspase-8 i DISC. Fordi Bud fungerer som en caspase-8 substrat, slår aktivering av ytre død reseptor apoptotiske sti også på den iboende apoptotiske sti [7].
Den døde ligand TRAIL har nylig dukket opp som potensiell kreft terapeutisk middel fordi det fortrinnsvis induserer apoptose i transformerte eller ondartede celler [8]. Foreløpig rekombinant humant TRAIL blir testet i fase I kliniske studier. Videre agonistiske antistoffer mot DR4 og DR5, som direkte aktiverer den ytre apoptotiske reaksjonsveien, er også blitt testet i fase I eller II-studier [9]. Dermed blir død reseptoren, særlig TRAIL død-reseptor-mediert apoptose har vært under intens forskning som et terapeutisk mål kreft [10], [11]. Mange prekliniske studier har vist terapeutiske potensialet rettet mot TRAIL /død reseptor-mediert apoptose i bukspyttkjertelkreft [12] – [20]. Men en viktig sak i denne sammenheng er den iboende motstanden av visse kreftceller, inkludert kreft i bukspyttkjertelen celler til TRAIL /død reseptor-indusert apoptose [17], [18].
Cellular FLICE-hemmende protein (c- FLIP), som hemmer caspase-8 aktivering ved å hindre rekruttering av caspase-8 til DISC, er den primære hemmer av TRAIL /død reseptor-indusert apoptose [21], [22]. Nivåene av c-FLIP, inkludert både FLIP
L og FLIP
S er gjenstand for regulering av ubiquitin /proteasome-mediert degradering [23] – [25]. Forhøyet c-FLIP uttrykk beskytter celler fra døden reseptor-mediert apoptose, mens nedregulering av c-FLIP av kjemikalier eller små interfererende RNA sensitizes celler til døden reseptor-mediert apoptose [26]. Overekspresjon av c-FLIP er blitt foreslått å være den viktigste mekanisme liggende TRAIL motstand i bukspyttkjertelkreft [13], [17].
LBH589 (panobinostat) er en pan-histon-deacetylase (HDAC) inhibitor med lovende anticancer aktivitet [27]. Mono aktivitet mot kreft i bukspyttkjertelen er vist i prekliniske eksperimentelle modeller [28]. I denne studien har vi avdekket en ny aktivitet LBH589, som sensitizes kreft i bukspyttkjertelen celler til TRAIL-indusert apoptose. Videre har vi vist at LBH589 letter ubiqutin /proteasome-mediert c-FLIP degradering, som fører til forbedring av TRAIL-indusert apoptose i kreft i bukspyttkjertelen.
Materialer og metoder
Reagenser
LBH589 ble gitt av Novartis (Basel, Sveits). Den løselig rekombinant humant TRAIL ble kjøpt fra Peprotech, Inc. (Rocky Hill, NJ). Den proteasominhibitor MG132 og proteinsynteseinhibitor cyclohexemide (CHX) ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Kanin polyklonale anti-DR5 antistoff ble kjøpt fra Prosci Inc (Poway, California). Mus monoklonalt anti-DR4 antistoff (B-N28) ble kjøpt fra Diaclone (Stamford, CT). Mus monoklonalt anti-caspase-3 antistoff ble kjøpt fra IMGENEX (San Diego, California). Kanin polyklonalt anti-XIAP, anti-kaspase-8, anti-Mcl-1 og anti-PARP-antistoffer og muse-monoklonalt anti-Survivin antistoff ble innkjøpt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA). Mouse anti BCL-2 antistoff ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, California). Kanin anti-GAPDH polyklonalt antistoff og anti-mus Bax monoklonalt antistoff ble anskaffet fra Trevigen (Gaithersburg, MD). Mus monoklonalt anti-β-actin antistoff ble kjøpt fra Sigma Chemical Co.
Cellelinjer og cellekultur
Menneskelige bukspyttkjertelkreft cellelinjer brukt i denne studien ble kjøpt fra American Type Culture Collection ( Manassas, VA). For å etablere bukspyttkjertelkreft cellelinjer som stabilt uttrykker ektopisk c-FLIP eller survivin, ble Panc-1 celler infisert med lentiviruses husing lentiviral ekspresjonsvektorer av FLIP
L og survivin, henholdsvis som beskrevet tidligere [29], [30]. Vi har også infiserte celler med lentiviruser som bærer LacZ-ekspresjonsvektor som en kontroll [29]. Enkeltcellekloner som er resistente mot blasticidin ble ekspandert og underkastet screening for ekspresjon av det målrettede protein ved Western blotting. Disse cellelinjene ble dyrket i DMSM medium inneholdende 5% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 og 95% luft.
celleoverlevelse Assay
celler ble sådd ut i 96-brønners cellekulturplater og behandlet den neste dag med agenter angitt. De levedyktige celler ble bestemt ved anvendelse av sulforhodamin B (SRB) assay, slik som tidligere beskrevet [31]. Kombinasjon indeks for interaksjon (f.eks synergi) ble beregnet ved hjelp av CompuSyn programvare (ComboSyn, Inc .; Paramus, NJ). Den statistiske signifikans av forskjeller mellom to behandlinger ble analysert med to-sidig uparet studentens
t
tester ved bruk av Graphpad INSTAT 3 programvare (GraphPad Software, San Diego, California). Resultatene ble ansett for å være statistisk signifikant på
P
. 0,05
Påvisning av apoptose
Apoptose ble evaluert av annexin V farging hjelp annexin V-PE apoptose deteksjon kit kjøpt fra BD Biosciences (San Jose, California) etter produsentens anvisninger. Vi har også oppdaget at caspaseaktivering ved Western-blotting (som beskrevet nedenfor) som en ytterligere indikator på apoptose.
Western Blot analyse
Hele celleprotein lysater ble fremstilt og analysert ved Western blotting som beskrevet tidligere [32], [33].
Immunpresipitasjon for påvisning av Ubiqutinated c-FLIP
Panc-1 /FLIP
L-5 celler, som stabilt uttrykte FLIP
L, ble transfektert med HA-ubiquitin plasmid med Fugene 6 transfeksjon reagens (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) etter produsentens anvisninger. Etter 24 timer ble cellene behandlet med LBH589 eller MG132 pluss LBH589 i 4 timer og deretter ble lysert for immunoutfelling av flagg-FLIP
L ved hjelp av Flag M2 monoklonalt antistoff (Sigma Chemicals) som tidligere beskrevet [34], etterfulgt av påvisning av ubiquitinmolekyler FLIP
L med Western blotting ved hjelp av anti-HA-antistoff (Abgent, San Diego, California)
Resultater
LBH589 sensitizes kreft i bukspyttkjertelen celler i Trail-indusert apoptose
.
Vi først bestemt følsomheten til bukspyttkjertelkreft cellelinjer brukt i denne studien å TRAIL. Som presentert i fig. 1A, fire bukspyttkjertelkreft cellelinjer viste differensial sensitiviteter: MiaPaCa-2 og Bxpc3 viste nedgang doseavhengig i celle overlevelse på TRAIL behandling og dermed var følsomme for TRAIL, mens Panc-1 og CAPAN-2 var resistente mot TRAIL fordi de viste minimal respons på sti i form av reduksjon i celleoverlevelse. Når det kombineres med LBH589, ble forbedret celle-drepende effekter observeres ikke bare i TRAIL-sensitive celler (f.eks Bcpc-3), men også i TRAIL-resistente cellelinjer (f.eks Panc-1 og CAPAN-2) fordi kombinasjonen av LBH589 og TRAIL var mye mer enn noen av midlene alene i avtagende overlevelsen av kreft i bukspyttkjertelen celler (fig. 1B). Kombinasjonen indekser for LBH589 (f.eks 12,5 nM) og TRAIL (3,125 til 26 ng /ml) kombinasjon i de testede cellelinjene var 0,5 (Fig. 1C), noe som indikerer at LBH589 og TRAIL kombinasjon utøver synergieffekter på mink celle overlevelse av kreft i bukspyttkjertelen celler. Videre tilbyr vi direkte oppdaget apoptose ved å måle annexin V-positive celler og caspase spalting i celler eksponert for LBH589 alene, TRAIL alene og deres kombinasjon. I overensstemmelse med celleoverlevelsesdata, kombinasjonen av LBH589 og TRAIL var mye mer potent enn hvert enkelt middel alene i indusering av spaltningen av caspase-9, caspase-8, caspase-3 og PARP (Fig. 2A) og økende annexin V-positive celler (dvs. apoptotiske celler) (fig. 2B). Spesielt LBH589 og TRAIL alene forårsaket henholdsvis ca 18% og 21% apoptose,; Men kombinasjonen av LBH589 og TRAIL induserte ca. 62% apoptose, som er åpenbart større enn additiv virkning. Samlet indikerer disse resultater at LBH589 sensibilisere kreft i bukspyttkjertelen celler til TRAIL-fremkalt apoptose.
A
, De angitte cellelinjer ble sådd ut i 96-brønners cellekulturplater og behandlet den neste dag med de gitte konsentrasjoner av TRAIL i 24 timer. Celle tall ble beregnet ved hjelp av SRB analysen. Dataene er midler til fire replikere bestemmelser; barer, ± SDS. *,
P
0,01 sammenligne med ubehandlede celler.
B
, De angitte cellelinjer sådd i 96-brønners cellekulturplater ble behandlet med de gitte konsentrasjoner av TRAIL alene, LBH589 alene, eller de respektive kombinasjon av LBH og TRAIL i 24 timer. Celle tall ble beregnet ved hjelp av SRB analysen. Dataene er midler til fire replikere bestemmelser; barer, ± SDS. I Bxpc-3 og Panc-1-celler, er betydelig mer effektivt enn både TRAIL alene eller LBH589 alene i nedadcelleoverlevelse hver kombinasjon (
P
0,05 eller 0,001). I CAPAN-2 celler, LBH589 på 50 nM i kombinasjon med 12,5 ng /ml eller 25 ng /ml er betydelig mer effektivt enn LBH589 eller TRAIL alene redusere celleoverlevelse (
P
0,001). Så er det LBH589 på 25 nm eller 50 nM kombinert med TRAIL (
P
0,05).
C
, Kombinasjoner indekser (CIS) ble beregnet basert på dataene som er presentert i Fig. 1B bruker CompuSyn programvare.
En
, De angitte cellelinjer ble behandlet med DMSO kontroll, 50 nM LBH589 25 ng /ml TRAIL alene, eller LBH589 pluss TRAIL. Etter 16 timer ble cellene utsatt for fremstilling av hel-celle protein-lysatene for å påvise caspase spalting ved hjelp av Western blotting. Casp, caspase; CF, kløyvde fragment.
B
, Panc-1-cellene ble behandlet med 25 ng /ml TRAIL alene, 50 nM LBH589 alene eller deres kombinasjon i 24 timer. Cellene ble deretter underkastet måling av apoptose ved hjelp av annexin V-farging. De prosentvise positive celler i øvre høyre og nedre høyre kvadrant representerer den totale apoptotisk cellepopulasjon.
LBH589 reduserer nivåene av c-FLIP og Survivin i kreft i bukspyttkjertelen celler
For å forstå mekanismer som LBH589 sensitizes bukspyttkjertelkreft cellelinjer til TRAIL-indusert apoptose, vi først analysert regulerende effekt av LBH589 på c-FLIP, DR5, DR4 og TRAIL, som er direkte involvert i reguleringen av TRAIL /død reseptor-mediert apoptose i tre bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Panc-1 og CAPAN-2 celler hadde høyere basale nivåer av c-FLIP (spesielt FLIP
L) enn Bxpc-3 celler. Behandling av disse cellelinjer med LBH589 reduserte nivåene av c-FLIP i alle de tre cellelinjer i en konsentrasjonsavhengig måte (fig. 3A). C-FLIP reduksjon skjedde ved 3 t og ble enda mer uttalt hos 12 timer etter, og deretter legge LBH589 behandling (fig. 3B). LBH589 endret ikke nivåene av TRAIL i noen av de testede cellelinjer (Fig. 3A) og kun minimal øket DR5-ekspresjon i en av de tre testede cellelinjer (dvs. Bxpc-3) (fig. 3A og 3B). Disse resultatene tyder klart på at c-FLIP donwregulation er en viktig begivenhet fremkalt av LBH589.
De oppgitte cellelinjer ble behandlet med ulike konsentrasjoner av LBH589 som indikert i 12 timer (
A
) eller med 50 nM LBH589 til angitt tid (
B
). Etter behandlingene, ble cellelinjene utsatt for tilberedning av hel-celle protein lysates og påfølgende Western blot analyse for påvisning av de angitte proteiner.
I tillegg har vi også undersøkt regulerende effekt av LBH589 på andre proteiner, inkludert survivin, XIAP, Bcl-2, Mcl-1, og Bax, som regulerer mitokondriene-mediert apoptose. LBH589 redusert Survivin nivåer i Panc-1 og CAPAN-2-celler, men ikke Bxpc-3-celler (fig. 3A). Tidsforløpet analyse av Survivin nivåer i Panc-1 celler viste at uttalt survivin reduksjonen skjedde på 12 timer etter LBH589 behandling (fig. 3B). LBH589 endret ikke nivåene av Bax og XIAP i disse cellelinjer; men det økte nivåene av Mcl-2 i følgende cellelinjer, så vel som Bcl-2 nivåer i Bxpc-3-celler (fig. 2A). Sammen disse resultatene tyder også på at survivin reduksjon kan også være en viktig begivenhet fremkalt av LBH589.
Tvangs Uttrykk for ektopisk c-FLIP, men ikke Survivin, beskytter celler fra Induksjon av apoptose ved kombinasjon av LBH569 og TRAIL
Både c-FLIP og survivin er involvert i reguleringen av TRAIL celle følsomhet [35]. For å bestemme involvering av c-FLIP og survivin downregulation i sensibilisering av kreft i bukspyttkjertelen celler til TRAIL-indusert apoptose av LBH589, etablerte vi Panc-1 cellelinjer som stabilt uttrykte utenfor livmoren FLP
L eller survivin gjennom en lentivial uttrykk system og deretter undersøkt sine svar til kombinasjonen av LBH589 og TRAIL. Uttrykket av ektopisk survivin eller c-FLIP ble antatt ved Western blotting som presenteres i fig. 4A. Lac Z er et irrelevant protein, og her ble anvendt som en kontroll. Som vist ovenfor, er kombinasjonen av LBH589 og TRAIL effektivt redusert celle overlevelse i Lac Z- eller Survivin-uttrykke cellelinjer, men klarte ikke å gjøre det i begge cellelinjer som uttrykker ektopisk FLIP
L (fig. 4B), noe som indikerer håndheves uttrykk for ektopisk FLIPL, snarere enn survivin, overfører celle motstand mot utvidet induksjon av apoptose ved LBH589 og TRAIL kombinasjon. Ved å detektere apoptose, har vi funnet at kombinasjonen av LBH589 sterkt indusert spaltning av kaspase-8, caspase-9, caspase-3 og PARP i PANC-1-cellelinjer som uttrykker Lac Z eller Survivin, men bare minimal i FLIP
L -expressing Panc-1-celler (fig. 5A). I forståelse, kombinasjonen av LBH589 og TRAIL forårsaket ca. 79% og 69% av apoptose i Panc-1 /lacZ-1 og Panc-1 /Survivin-4-celler, henholdsvis, men bare omtrent 25% av apoptose i Panc-1 /FLIPL-5-celler (fig. 5B), ytterligere bekrefter at FLIP
L overekspresjon overfører celle motstand mot kombinasjonen av LBH589 og TRAIL. Sammen er disse resultatene viser at c-FLIP downregulation spiller en nøkkelrolle i LBH-589-mediert allergi av kreft i bukspyttkjertelen celler til TRAIL-indusert apoptose.
A
, Uttrykket av ektopisk Survivin eller c-FLIP i de forskjellige trasnfectants som indikert ble påvist ved Western blotting med survivin eller c-FLIP-antistoff.
B
, Gitte transfektanter ble sådd ut i 96-brønners plater og behandlet med de angitte konsentrasjoner av LBH589 alene, 25 ng /ml TRAIL alene, eller individuell kombinasjon av LBH589 med TRAIL. Etter 24 timer ble cellene utsatt for SRB-analyse for måling av celle-overlevelse. Dataene er midler til fire replikere bestemmelser; barer; ± SDS. *,
P
0,0001 og #
P
0,001 sammenlignet med LBH589 behandling alene
De angitte transfektanter ble behandlet uten og med 50 nM. LBH589 pluss 25 ng /ml TRAIL (L /T) i 16 h (
A
) eller 24 timer (
B
). Cellene ble deretter høstet for fremstilling av hel-celle protein-lysatene for å påvise caspase og PARP-spaltning ved hjelp av Western blotting (
A
) eller for måling av apoptose ved hjelp av annexin V-farging (
B
). De prosentvise positive celler i øvre høyre og nedre høyre kvadrant representerer den totale apoptotisk cellepopulasjon.
LBH589 Donwregulates c-FLIP gjennom Fremme Ubiqitin /proteasome-mediert degradering
Gitt den kritiske rollen som c-FLIP downregulation i formidling forbedring av TRAIL-indusert apoptose av LBH589 som vist ovenfor, adressert vi videre hvordan LBH589 redusert c-FLIP nivåer. Fordi c-FLIP-proteiner er kjent for å bli regulert av ubiquitin /proteasom-mediert degradering [23], [25], og deretter bestemmes hvorvidt den observerte vi nedregulering av c-FLIP ved LBH589 ville være formidlet via denne fremgangsmåten. Derfor må vi først undersøkt om LBH589 fremmer c-FLIP degradering. For å oppnå dette, behandlet vi PANC-1cells med enten DMSO eller LBH589 i 4 timer og deretter vasket bort medikamentet, etterfulgt av påfylling av cellene med friskt medium inneholdende proteinsynteseinhibitor CHX. På de angitte tidspunkter legge CHX, ble cellene høstet for Western blotting til å analysere c-FLIP nedbrytningshastigheten. Som presentert i fig. 6A, reduksjon eller nedbrytningshastigheten av FLIP
L i LBH589-behandlede celler var tydeligvis raskere enn i DMSO-behandlede kontrollcellene, hvilket indikerer at LBH589 faktisk letter c-FLIP degradering. Deretter behandles vi cellene med LBH589 i fravær og nærvær av proteasominhibitor MG132 og deretter sammenlignet c-FLIP-modulasjon under disse betingelser. Som presentert i fig. 6B, LBH589 nedsatt c-FLIP nivåer i fravær av MG132, men ikke i nærvær av MG132, noe som tyder på at LBH589-indusert c-FLIP nedbrytning er proteasom-avhengig. Ved immunoprecipitation /Western blotting, vi også oppdaget de høyeste nivåene av ubiqutinated FLIP
L i celler behandlet med LBH589 pluss MG132 forhold til celler eksponert for LBH589 alene eller MG132 alene (Fig. 6C), noe som indikerer at HNK øker c-FLIP ubiquitinering . Tatt sammen, konkluderer vi at LBH589 induserer ubiquitin /proteasome-mediert c-FLIP degradering, som fører til nedregulering av c-FLIP i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler.
En
, Panc-1 celler ble behandlet med DMSO eller 50 nM LBH589 i 4 timer. Cellene ble deretter vasket med PBS 3 ganger og igjen foret med friskt medium inneholdende 10 ug /ml CHX. På de angitte tidspunkter legge CHX, ble cellene høstet for fremstilling av hel-celle-lysatene protein og påfølgende Western blot-analyse. Protein nivåer ble kvantifisert med NIH Image J programvare (Bethesda, MA) og ble normalisert til GAPGH. Resultatene ble plottet som de relative c-FLIP nivåer sammenlignet med de på tidspunktet 0 av CHX behandling (nedre panel).
B
, Panc-1-celler ble forbehandlet med 20 mM MG132 i 30 minutter før tilsetning av 50 nM LBH589. Etter ko-behandling i 4 timer, ble cellene høstet for fremstilling av hel-celle-lysatene protein og påfølgende Western blot-analyse.
C
, Panc-1 /FLIP
L-5-celler som stabilt uttrykker ektopisk flagg-FLIP
L ble transfektert med HA-ubiquitin plasmid hjelp Fugene 6 transfeksjon reagens i 24 timer. Cellene ble deretter forbehandlet med 20 uM MG132 i 30 minutter og deretter co-behandlet med 50 nM LBH589 i 4 timer. Hel-celle protein lysatene ble deretter utarbeidet for immunoprecipitation (IP) ved hjelp av anti-Flag antistoff etterfulgt av Western blotting (WB) ved hjelp av anti-HA antistoff for deteksjon av ubiquitinmolekyler FLIP
L (Ub-FLIP
L) og anti -Flag antistoff for deteksjon av ektopisk FLIP
L.
Diskusjoner
Menneskelige bukspyttkjertelkreft svulster eller cellelinjer vise heterogene reaksjoner på TRAIL. Noen av disse svulstene eller cellelinjer er egentlig ufølsom for TRAIL-indusert apoptose [17], [18]. I denne studien har vi presentert et nytt funn at histondeacetylase inhibitor LBH589 forsterker effektivt TRAIL-indusert apoptose i humane kreft i bukspyttkjertelen celler inkludert de resistente mot TRAIL-indusert apoptose. Gitt at LBH589 viser anticancer aktivitet i prekliniske kreft i bukspyttkjertelen modeller [28] samt at svulsten-selektive TRAIL er en potensiell kreft terapeutisk protein og blir testet i fase I kliniske studier, våre funn garanterer videre evaluering på kombinasjonen av LBH589 og TRAIL som en potensiell terapiregimer mot kreft i bukspyttkjertelen i dyremodeller og i kliniske studier.
Både survivin og XIAP er foreslått å regulere TRAIL-mediert apoptose [12], [36], [37]. Noen HDAC hemmere som natriumbutyrat og LAQ824 ble rapportert å øke TRAIL-indusert apoptose involverer donwregualtion av survivin og XIAP [38], [39]. En fersk studie har antydet at LBH589 forbedrer TRAIL-indusert apoptose gjennom nedregulering av XIAP i mesothelioma celler [40]. I vår studie fant vi at LBH589 redusert Survivin nivåer i to (dvs. Panc-1 og CAPAN-2) av tre testede bukspyttkjertelkreft cellelinjer, men ikke åpenbart endre nivåene av XIAP (Fig. 3). Videre tvungen ekspresjon av ektopisk Survivin ikke gi resistens mot LBH589 /TRAIL-fremkalt apoptose (fig. 4 og 5). Dermed Survivin og XIAP er usannsynlig å være involvert i reguleringen av LBH589-mediert allergi av TRAIL-indusert apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler.
BCL-2 familiemedlemmer som Bcl-2 og Mcl-en har også vært foreslått i reguleringen av TRAIL-indusert apoptose [14], [35]. Andre HDAC hemmere forbedre TRAIL-indusert apoptose i ulike kreftceller som involverer modulering av BCL-2 familiemedlemmer som nedregulering av Bcl-2 og Bcl-X
L og oppregulering av Bax og Bim [39], [41] – [ ,,,0],44]. I vår studie fant LBH589 ikke endre Bax nivåer. Uventet, økte LBH589 nivåer av BCL-2 og Mcl-1 (fig. 3). Det er således usannsynlig å bli forbundet med LBH589-medierte potensering av TRAIL-fremkalt apoptose i disse cellelinjene modulering av disse proteinene; snarere øke i Bcl-2 og Mcl-en kan motvirke LBH589 effekt i sensibiliserende kreft i bukspyttkjertelen celler i Trail-indusert apoptose. Dermed kan ytterligere inkludering av en BCL-2 eller Mcl-en inhibitor til dette regimet resultere i enda mer effektiv anticancer effekt enn kombinasjonen av LBH589 og TRAIL og bør videre utforsket.
DR5 induksjon og c-FLIP downregulation er viktige mekanismene bak narkotika-mediert styrking eller sensibilisering av TRAIL-indusert apoptose [45]. I vår studie fant vi at LBH589 enten ikke eller bare svakt økt DR5 uttrykk i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (Fig. 3), noe som tyder på at DR5 modulasjon har en begrenset rolle i LBH589-mediert allergi av TRAIL-indusert apoptose i disse cellene. c-FLIP nivåer har blitt foreslått å være assosiert med sensitiviteten av kreft i bukspyttkjertelen celler i Trail-indusert apoptose; spesifikt ble høyere nivåer av c-FLIP påvist i løypa bestandig bukspyttkjertelkreft cellelinjer sammenlignet med stien sensitive celler [17]. Inhibering av c-FLIP med en liten interfererende RNA eller et lite molekyl sensitizes kreft i bukspyttkjertelen celler til TRAIL-fremkalt apoptose [13], [17]. Videre har andre HDAC-inhibitorer så som LAQ824, MS-275, FR901228, valproinsyre og droxinostat blitt vist å nedregulere c-FLIP nivåer og forbedre død-reseptor-fremkalt apoptose [46] – [52]. I vår studie fant vi også at stien resistente cellelinjer Panc-1 og CAPAN-2 hadde høyere basale nivåer av c-FLIP enn TRAIL-sensitive cellelinje (Bxpc-3) (Fig. 3A). Som andre HDAC-inhibitorer, redusert LBH589 c-FLIP-cellelinjer i disse tre testede cellelinjer; Dette c-FLIP nedregulering er en hurtig hendelse fordi c-FLIP reduksjon ble påvist selv på 3 timer etter LBH589 behandling (Fig. 3). Viktigere, håndhevet uttrykk for ektopisk c-FLIP (dvs. FLIP
L) avskaffet LBH589 evne til å forbedre TRAIL-indusert apoptose (fig. 4 og 5). Sammen er disse resultatene tyder på at nedregulering av c-FLIP er kritisk for LBH589-mediert allergi av kreft i bukspyttkjertelen celler i Trail-indusert apoptose.
c-FLIP er kjent for å være regulert av ubiquitin /proteasome-mediert degradering [ ,,,0],23], [24]. Tidligere studier har vist at c-FLIP nedregulering induseres av visse HDAC-inhibitorer skjer på mRNA-nivå [39], [51]. Hvordan HDAC hemmere downregulate c-FLIP nivåer er ikke fullstendig klarlagt. I vår studie fant vi at LBH589 tilrettelagt c-FLIP degradering som demonstrert i CHX jage analysen. Nærværet av proteasominhibitor MG132 forhindret c-FLIP fra reduksjon indusert av LBH589. Videre økte LBH589 nivåene av ubiquitinmolekyler c-FLIP (fig. 6). Således indikerer disse resultater at LBH589 letter ubqitin /proteasom-mediert c-FLIP degradering, noe som resulterer i c-FLIP nedregulering. Så langt vi kjenner til, funn på c-FLIP degradering eller nedregulering av LBH589 er romanen og garanterer videre undersøkelser på hvordan hemming av histondeacetylase fører til c-FLIP degradering.
De maksimale plasmakonsentrasjoner av LBH589 i menneskelige kreftpasienter varierer fra 200 nM til 1300 nM avhengig testede doser [53]. Konsentrasjonene av LBH589 brukt i vår studie at downregulate c-FLIP og forbedre TRAIL-indusert apoptose er mellom 12,5 nM og 100 nM og dermed innenfor klinisk oppnåelig rekkevidde. Derfor er fremtiden klinisk test av kombinasjonen garantert.
Takk
F.R. Khuri og S-Y. Sun er Georgia Cancer Coalition Distinguished Cancer Scholars.
