Abstract
Prostatakreft er den vanligste kreftformen blant menn i USA USA USA. Cytokinet IL-6 aktiveres flere prostatakreft veier, men dens oppstrøms trans-signalveien forblir dårlig forstått. I denne studien evaluerte vi rollen til IL-6 i PDCD4 genekspresjon og hvordan den mikroRNA MIR-21 regulerer denne prosessen i prostatacancercellelinjer PC-3 og LNCaP. Uttrykket mønster av PDCD4 fra prøver fra menneske prostatakreft, forstadier til kreft, og benign prostatahyperplasi ble undersøkt ved immunhistokjemi. PDCD4 transkripsjon og translasjon ble påvist ved kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) og Western blot-analyse, respektivt. Den målrettede modulering av PDCD4 ved MIR-21 ble analysert i PC-3 og LNCaP-celler, og effekten av IL-6 på ekspresjon av PDCD4 ble studert in vitro. PDCD4 ekspresjon i prøver fra 3 vevstyper gradvis øket, og uttrykket nivåer av PDCD4 og prostata-spesifikt antigen var negativt korrelert. Nivåene av PDCD4 mRNA og protein i PC-3 og LNCaP-celler transfektert med anti-MIR-21-konstruksjonene var lavere enn de i kontrollceller. Ekspresjon av PDCD4 ble inhibert med IL-6, men denne effekten ble svekket i cellelinjer med lav ekspresjon av MIR-21. Vårt studium viser at reguleringen av PDCD4 ved MIR-21 er rettet og IL-6 inhiberer ekspresjon av genet PDCD4 i PC-3 og LNCaP-celler gjennom målrettet funksjon av MIR-21 på PDCD4. Disse funnene støtter muligheten for videre arbeid for diagnostisering og genterapi for prostatakreft som er basert på IL-6, MIR-21, og PDCD4
Citation. Dong B, Shi Z, Wang J, Wu J Yang Z, Fang K (2015) IL-6 Hemmer Målrettet Modulation av PDCD4 av MIR-21 i prostatakreft. PLoS ONE 10 (8): e0134366. doi: 10,1371 /journal.pone.0134366
Redaktør: Craig N. Robson, Nord Institute for Cancer Research, STORBRITANNIA
mottatt: 19 februar 2015; Godkjent: 08.07.2015; Publisert: 07.08.2015
Copyright: © 2015 Dong et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:. forfatterne fikk spesifikk støtte til dette arbeidet fra Heath Department of Yunnan-provinsen (Grant No.2010NS053). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreft dødsfall blant menn i USA. I Kina er forekomsten av prostatakreft øker hvert år. Interleukin-6 (IL-6) er en pleiotropisk cytokin som stimulerer spredning og modulerer viktige cellulære hendelser i prostatakreft [1]. Uttrykket av IL-6 er forhøyet i avansert prostatakreft [2] og korrelerer med Gleason grad av prostatakreft [3] og prostatakreft progresjon [4]. IL-6 er en viktig aktivator av Janus kinase /signal transduser og aktivator av transkripsjon 3 bane i prostatakreft [5]. IL-6 kan også aktivere mitogen-aktivert protein kinase pathway [6]. Men forblir IL-6 oppstrøms trans-signalveien i prostatakreft dårlig forstått.
programmert celledød 4 (PDCD4) er en suppressor av tumorigenesis, tumorprogresjon, og invasjon som fungerer med eller uten initiator utfordring. PDCD4 var den første Lyddemper funnet å målrette oversettelse [7]. PDCD4 samvirker med translasjonsinitiering faktorer eIF4A og eIF4G å inhibere translasjon i en mRNA-spesifikk måte, noe som fører til hemming av pro-onkogene faktorer [8]. Overekspresjon av PDCD4 hemmer tumordannelse og tumorprogresjon hos en transgen musemodell og hemmer tumorcelle invasjon in vitro.
microRNAs (Mirs) er små kodende RNA som er post-transcriptional regulatorer av genuttrykk og viktige regulatorer av flere fysiologiske og patologiske prosesser. Mirs også påvirke proteinproduksjon [9] og spiller en nøkkelrolle i ulike typer humane tumorer [10]. MIR-21 uttrykket er høyere i noen solide svulster [11-13], inkludert prostatakreft, enn i normalt vev [14]. Videre MIR-21 er et onkogen med antiapoptotic funksjon [15]. MIR-21 inhiberer apoptose i androgen-negative og androgen-uavhengig metastatisk prostata kreft-cellelinjer PC-3 og DU-145 og kan regulere motilitet og invasjon i disse cellelinjene [16].
I denne studien vi fastslått hvorvidt IL-6 regulerer ekspresjon av genet PDCD4 og definert rollen til mir-21 i denne prosessen i prostatakreftcellelinjer LNCaP og PC-3.
Materialer og metoder
Reagenser
PC-3 og LNCaP cellelinjer ble hentet fra Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences. Rekombinant humant IL-6 ble kjøpt fra R HyClone 0,25% trypsinase fra GE Healthcare og biovitenskap (Piscataway, NJ); og DMSO fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Anti-MIR-21 hemmer og anti-MIR-21 negativ kontroll ble kjøpt fra ABI Biotech (USA). Lipofectamine 2000 ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California). Den RNAiso Plus kit for RNA isolering, ble PrimeScript RT reagenssett for cDNA revers transkripsjon, og Perfect Real Time kit for kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) kjøpt fra Takara Bio (Mountain View, California) sammen med DL1000 DNA markør . Primere for
PDCD4 Hotell og
GAPDH
ble hentet fra Sangon (Kina). Humant anti-PDCD4 monoklonalt antistoff og kanin polyklonalt anti-β-aktin-antistoff ble innkjøpt fra Abcam (Cambridge, MA). Anti-kanin IgG-HRP-bundet antistoff ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). BCA protein assay kit og RIPA lysat buffer ble kjøpt fra Beyotime Institutt for bioteknologi (Kina). In situ hybridisering sett for HSP og DAB ble kjøpt fra LBP Biotech Company (Kina).
Pasientprøver
Tjue prøver hver av prostatakreft, forstadier til kreft, og godartede prøver fra pasienter prostatahyperplasi vev med prostata atypisk adenomatøs hyperplasi, prostata intraepitelial neoplasi, eller benign prostatahyperplasi, henholdsvis, ble levert av Avdeling for patologi, den andre Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Yunnan, Kina, fra januar 2010 til oktober 2011. Alle prøvene ble løst i formalin, parafin-innleiret, og skiver.
Cellekultur kultur~~POS=TRUNC
LnCap og PC-3-celler ble dyrket i 25-ml plater i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum, penicillin ( 100 U /ml), og streptomycin (100 ug /ml) i en 37 ° C, 5% CO
2 inkubator. Dyrkningsmediet ble skiftet hver andre dag.
kvantitativ real-time PCR
PDCD4 ble bestemt ved QRT-PCR-analyse. Celler (5 x 10
5) ble sådd ut i hver brønn av seks-brønners plater, dyrket i 24 timer, og inkubert med IL-6 (0, 5 eller 10 ng /ml) i 24 timer. RNA ble ekstrahert ved hjelp av RNAiso Plus RNA ekstraksjon kit i henhold til produsentens anvisninger. RNA kvalitet ble målt ved hjelp av PrimeScript RT reagenssett som per produsentens instruksjoner før RNA ble revers-transkribert til cDNA. De følgende PDCD4 primere ble anvendt: oppstrøms primer 5′-CCTGAATTAGCACTGGATACTCCT-3 «og nedstrøms primer 5′-CTAGCCTGCACACAATCTACAGTT-3». De følgende GAPDH-primere ble anvendt: forover primer 5′-TCACTTTGTCACAGCCCAAG-3 «og revers primer 5′-AGCAAGCAAGCAGAATTTGG-3». Revers transkripsjon ble utført ved 37 ° C i 15 min (revers transkripsjonsreaksjon), etterfulgt av 85 ° C i 5 s (revers transkriptase inaktive reaksjon), i henhold til produsentens instruksjoner. Amplifikasjon ble utført under følgende betingelser: for 2 sykluser ved 95 ° C i 30 sekunder hver, etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 s
Western blot-analyse
Celler (5 x 10
5) ble sådd ut i hver brønn av seks-brønners plater, dyrket i 24 timer, og inkubert med IL-6 (0, 5 eller 10 ng /ml) i 24 timer . Totalt protein ble ekstrahert med RIPA-lyseringsbuffer, og proteinkonsentrasjonen ble målt ved BCA-analyse. Proteinene ble separert i henhold til størrelse ved elektroforese, overført til film, og inkubert med følgende antistoffer: PDCD4 antistoff, 1: 5000; p-aktin-antistoff, 1: 8000; og sekundært antistoff, 1: 5000. Imagequant LAS4000 (GE Healthcare og biovitenskap) ble brukt til bilde gels.
Cell transfeksjon og IL-6 behandling
Cells (5 × 10
5) ble sådd i hver brønn 6-brønns plater og dyrket i 24 timer for å sikre at integrasjonen av transfekterte celler var minst 60%. Mediet ble endret en gang før en 4-h transfeksjon i en antibiotika-free medium med Lipofectamine 2000, i henhold til produsentens anvisninger. Den endelige konsentrasjonen av den anti-MIR-21-inhibitor og negativ kontroll var 30 nM. Transfeksjon Blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 20 minutter og deretter plassert i et 37 ° C, 5% CO
2 inkubator i 30 min. Mediet ble erstattet med friskt, antibiotika-fritt RPMI 1640 etter 6 timer. Celler ble inkubert med eller uten IL-6 (10 ng /ml) i 24 timer før de ble høstet og anvendt for QRT-PCR og Western blot-analyser for å påvise PDCD4 ekspresjon.
Immunhistokjemisk analyse
den prostatakreft, forstadier til kreft, og godartede prøver prostatahyperplasi vev ble delt inn i 2 mm tykke skiver og fiksert i 10% formalin i opptil 24 timer. Skiver ble deretter deparaffinized, antigen ble hentet fra dem, og de ble inkubert i hydrogen peroxide i 15 min. Primært antistoff (50 ul, konsentrasjon 1: 500) ble tilsatt til hver skive, og inkubert ved 4 ° C over natten. HRP Polymer (HRP sekundært antistoff) ble tilsatt til vaskede objektglass og objektglass ble inkubert ved romtemperatur i 30 min. Deretter ble 1 ml DAB Plus Substrat dråpevis tilsatt til hvert objektglass sammen med 2 dråper DAB Plus kromogen og inkubert i 10 min. Lysbilder ble vasket, kontra, og dehydrert før du legger den transparente monteringsmedium og Dekk. Alle skiver ble vurdert separat av 2 patologer og gradert som -, +, ++ og +++, avhengig av dybden av PDCD4 farging i cytoplasma og cellekjernen. Vi identifiserte også basal celler med p63 farging.
Statistiske analyser
Data ble analysert ved SPSS17.0 statistisk programvare. The Chi-squared test ble brukt til å beregne forskjeller mellom de uttrykk for PDCD4 og PSA. Shapiro-Wilk test ble anvendt for å undersøke den normalitet av data fra immunhistokjemisk analyse, og en-veis ANOVA ble brukt til å sammenligne forskjellen mellom intervensjonsgruppene. The Fisher minst signifikant forskjell (LSD) test ble brukt for å teste forskjeller mellom 2 grupper.
Etikk erklæringen
Studiet ble godkjent av Institutional Review Board av den andre Affiliated Hospital of Kunming Medical University og gjennomføres i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Behovet for å innhente skriftlig informert samtykke ble frafalt av Institutional Review Board fordi dette var en retrospektiv studie. Pasientenes poster ble anonymisert før analyse.
Resultater
PDCD4 uttrykk i prostata vevstyper
PDCD4 protein ble uttrykt hovedsakelig i cytoplasma, men det ble også uttrykt i mindre utstrekning i kjernen av prøver av forstadier prostata og prostatahyperplasi. Det var en markant forskjell i PDCD4 uttrykksmønster blant eksemplarer av prostatakreft, prostata intraepitelial neoplasi, og prostatahyperplasi (fig 1). I dårlig differensiert karsinom, PDCD4 uttrykk var lav eller fraværende. PSA uttrykk var høyere i prøver fra prostata kreft enn de fra benign prostatahyperplasi (fig 1). Resultater fra PSA og PDCD4 farging i forskjellige typer prostata vev viste at mindre differensiert prostata cancer, desto lavere er nivået av PDCD4 ekspresjon og jo høyere nivå av PSA uttrykk. Resultatene av p63 flekker viste at basal celler var rikelig i BPH, mangelvare i PIN og fraværende ved PCA vev (fig 1).
I prostatakreft gis betydelig mengde normal kjertel mangler. Kreft reir er dannet med uregelmessige cribriform kjertler, og kreft infiltrerer muskelvev og cellen cytoplasma. Denne fargemønster ble gradert PDCD4 (+), PSA (+++). I prostata intraepitelial neoplasi, ble fargemønster gradert PDCD4 (++), PSA (++). I prostatahyperplasi /kjertel hyperplasi, ble atomfargemønster gradert PDCD4 (+++), PSA (+/-). Uttrykket av PDCD4 og PSA var annerledes (
x
2 = 8,632,
P
0,05) blant de 3 vevstyper. I Spearman rank test, ble uttrykket nivåer av PDCD4 og PSA blant de 3 prostata vevstyper negativt korrelert (-1
r
0).
Effekt av MIR-21 hemming på PDCD4 uttrykk
en MIR-21-regulert locus på 3’UTR av PDCD4 har blitt rapportert i HeLa livmorhalskreft celler [17]. For å bestemme hvorvidt MIR-21 regulerer også PDCD4 ekspresjon i prostata cancer, PC-3 og LNCaP-cellelinjer ble transfektert med MIR-21-inhibitor for å redusere mengden av endogent MIR-21 før måling PDCD4 mRNA og protein ekspresjon ved sanntids-PCR og immunoblotting, respektivt. Nivået av PDCD4 mRNA-ekspresjon var høyere i den transfekterte gruppen enn i noen av kontrollgrupper, med ekspresjon i LNCaP-celler var høyere enn den i PC-3-celler (figur 2a) (
F
= 20,562,
P
0,001). PDCD4 protein uttrykk økt etter LNCaP og PC-3 celler ble transfektert med MIR-21-hemmer (fig 2b) (PC-3 celler:
Z
= -3,920,
P
0,001 ; LNCaP celler.
Z
= 3,883,
P
0,001), noe som tyder på at PDCD4 reguleres av MIR-21 i disse prostatakreftcellelinjer
qRT- PCR-resultater som viser en økning i PDCD4 mRNA-ekspresjon i PC-3 og LNCaP-celler transfektert med MIR-21-inhibitor, noe som indikerer at PDCD4 mRNA ble uttrykt forskjellig mellom de to gruppene. Blant de MIR-21-inhiberte celler, PDCD4 mRNA ekspresjon i LNCaP-celler var signifikant høyere enn den i PC-3-celler. PDCD4 mRNA ekspresjon av LNCaP og PC-3-celler ble nedregulert etter en 24-timers behandling med forskjellige konsentrasjoner av IL-6. (B) Western blot-analyse viser en økning i nivåene av ekspresjon av proteinet PDCD4 i PC-3 og LNCaP-celler transfektert med den MIR-21-inhibitor. Nontransfected og negativ-kontrollceller ble rangert fra 1 til 6 i rank test for parede prøver. Nivåer av PDCD4 protein uttrykk for LNCaP og PC-3 celler ble nedregulert etter en 24-timers behandling med ulike konsentrasjoner av IL-6.
PDCD4 uttrykk etter IL-6 behandling
resultater fra QRT-PCR-analyse viste en signifikant reduksjon i transkripsjon av PDCD4 i PC-3 og LNCaP-celler etter forbehandling med IL-6 (5 eller 10 ng /ml, fig 3a). Resultater fra Western blot-analyse viste en signifikant reduksjon i oversettelsen av PDCD4 etter forbehandling med IL-6 (5 eller 10 ng /ml, fig 3b). I tillegg var det en negativ korrelasjon mellom konsentrasjonen av IL-6 og nivået for nedregulering av ekspresjon PDCD4. PDCD4 uttrykk redusert mer i PC-3 celler enn i LNCaP celler. PC-3 og LNCaP-celler ble stabilt transfektert med den MIR-21-inhibitor og deretter behandlet med IL-6 (10 ng /mL) for å bestemme rollen til mir-21 i reguleringen av PDCD4 ekspresjon av IL-6. I begge PC-3 og LNCaP-celler, nivået av PDCD4 mRNA og protein ekspresjon i transfekterte gruppene var høyere enn i noen av kontrollgruppene eller negativ-kontroll-grupper (Fig 4). Som tidligere nevnt, PDCD4 var målet for MIR-21 regulering, og IL-6 hemmet PDCD4 uttrykk gjennom MIR-21.
Nivåer av PDCD4 mRNA uttrykk i LNCaP og PC-3 celler ble nedregulert etter en 24- h behandling med IL-6 på 0, 5, eller 10 ng /ml. Forskjellen var statistisk signifikans (a) mellom hverandre. Den samme forskjell ble også observert i nivåer av PDCD4 proteinekspresjon (b). (A) PDCD4 mRNA ekspresjon av LNCaP og PC-3-celler ble nedregulert etter en 24-timers behandling med IL-6 ved 10 ng /ml. (B) PDCD4 protein uttrykk for LNCaP og PC-3 celler ble nedregulert etter en 24-timers behandling med IL-6 på 10 ng /ml,
PDCD4 protein uttrykk var betydelig høyere i prostatakreftceller transfektert med MIR-21-inhibitor før Il-seks behandling enn i celler ikke transfektert med inhibitor (enveis ANOVA test:
F
verdi = 241,781,
P
0,05) . Nivåer av PDCD4 protein uttrykk i transfekterte og nontransfected cellene i begge cellelinjene var signifikant forskjellige (LSD test:
P
0,05).
Diskusjoner
I denne studien, har vi funnet at ekspresjonen av PDCD4 protein ble redusert med en reduksjon i graden av differensiering av prostatavevet. Denne observasjonen tyder på at graden av malignitet i prostata kreftvev er relatert til PDCD4 uttrykk. Et lignende mønster er sett i kreft i fordøyelsessystemet [18], leverkreft [19], ductal carcinoma av brystkreft [20], og nasofaryngeal kreft [21]. Gitt at uttrykket nivåer av PDCD4 varierer med graden av sykdommen i prostata vev, kan PDCD4 være en lovende tumormarkør for både diagnostisering og behandling av prostatakreft (figur 1). Vi fant også at PDCD4 ble uttrykt både i luminal celler og basal celler i BPH, men i PIN og PCA vev hovedsakelig uttrykt i luminal celler (figur 1), og uttrykk for PDCD4 og PSA er negativt korrelert i prostata vev, noe som tyder på at diagnostisering av prostatakreft kan forenkles ved å kombinere påvisning av 2 faktorer.
Vår studie fant også at PDCD4 er et mål på MIR-21 regulering i prostatakreftceller. MIR-21 er kjent for å være overuttrykt i mange typer av faste tumorer. Moden MIR-21 kan redusere PDCD4 ekspresjon ved å indusere den TGF-β veien, noe som er en regulator av PDCD4 [22]. Dessuten har et konservert protein locus blitt identifisert i PDCD4 sekvens, gjennom hvilken MIR-21 regulerer PDCD4 uttrykk for å indusere tumorinvasjon og metastase [23]. I samsvar med tidligere funn [24,25], vår studie støtter at MIR-21 og PDCD4 ha en negativ korrelasjon med MIR-21 reduserer PDCD4 uttrykk og indusere tumorcelle invasjon og fjernmetastaser.
For å avgjøre om Mir -21 og PDCD4 uttrykk var forskjellige i androgen-avhengige og androgen-uavhengig prostatacancer, utførte vi våre studier på androgen-uavhengig prostatacancer-cellelinjen PC-3 og androgen-avhengige prostatacancer LNCaP-cellelinje. I begge cellelinjer, PDCD4 var et mål for MIR-21 på de transkripsjonelle og translasjonelle nivåer. Imidlertid er virkningsmekanismen til mir-21 i å regulere PDCD4 var forskjellig i de androgen-avhengige og androgen-uavhengige celler, med MIR-21-inhibering påvirker PDCD4 ekspresjon i større grad i PC-3-celler enn i LNCaP-celler. Dermed tyder våre resultater at PDCD4 genet er målet for MIR-21 regulering i prostatakreft.
sirkulerende nivåer av IL-6 i solide svulster kan være av prognostisk betydning hos pasienter med metastatisk og hormon-refraktær prostata kreft [26]. IL-6 fremmer proliferasjon av prostata kreftceller ved aktivering av androgenreseptoren (AR), og denne effekten blir inhibert av anti-androgener, for eksempel bicalutamid [27]. I tillegg kan MIR-21 regulere AR ekspresjon ved utvikling av prostatacancer [28]. Våre studier viser at Mir-21 fremmer veksten av prostata kreft celler ved downregulating uttrykk for PDCD4. Derfor kan AR være det felles mål for IL-6 og MIR-21 i prostata cancer, med MIR-21 spiller en mellommann rolle i aktivering av IL-6 for å regulere PDCD4 uttrykk. Dessuten påvirker IL-6 PDCD4 uttrykk gjennom utviklingen av prostatakreft hos både androgen-avhengige prostatakreft og androgen-uavhengig prostatakreft.
Konklusjoner
Denne studien gir eksperimentelle data til å drive det videre arbeidet i prostata cancer genterapi og diagnose som er basert på IL-6, MIR-21, og PDCD4.
takk
Vi takker Dr. Zhiwei Yuan for å få hjelp med immunhistokjemisk analyse.
