Abstract
Bakgrunn
Dagens diagnostisering og behandling av kreft i urinblæren (BC) har vist stor fremgang med utnyttelse av mikromatriser.
Formål
Vårt mål var å identifisere felles forskjellig uttrykt (DE) gener blant klinisk relevante undergrupper av BC ved hjelp av mikromatriser.
metodikk /hovedfunnene
BC prøver og kontroller, både eksperimentelle og offentlig tilgjengelige datasett, ble analysert ved hjelp av hele genomet mikromatriser. Vi gruppert prøvene i henhold til deres histologi og definert DE genene i hver prøve hver for seg, så vel som i hver tumor gruppe. En dobbel analyse strategien ble fulgt. Først ble det eksperimentelle prøver analysert og konklusjoner ble formulert; og andre, eksperimentelle settene ble kombinert med offentlig tilgjengelige microarray datasett og ble videre analysert på jakt etter vanlige DE gener. Den eksperimentelle datasettet identifisert 831 gener som var DE i alle tumorprøver, samtidig. Videre 33 gener ble oppregulert og 85 gener ble nedregulert i alle 10 BC prøvene i forhold til de 5 normalt vev, samtidig. Hierarkisk clustering fordelt tumor grupper i henhold til deres histologi. K-means for alle genene og alle prøvene, samt gruppering av tumor grupper, presentert 49 klynger. K-means av felles DE gener i alle prøvene avslørte 24 klynger. Gener manifestert ulike differensial mønstre av uttrykk, basert på PCA. YY1 og NFkB var blant de vanligste transkripsjonsfaktorer som er regulert uttrykk for de identifiserte DE gener. Kromosom 1 inneholdt 32 DE-genene, etterfulgt av kromosomer 2 og 11, som inneholdt 25 og 23 DE-gener, respektivt. Kromosom 21 hadde minst antall DE gener. GO analyse viste utbredelsen av transport og bindende gener i felles nedregulert DE gener; utbredelsen av RNA metabolisme og prosessering gener i oppregulert DE gener; samt forekomsten av gener som er ansvarlige for celle-kommunikasjon og signaloverføring i DE gener som ble ned-regulert i T1-Grade III tumorer og opp-regulert i T2 /T3-Grade III tumorer. Kombinasjon av prøver fra alle microarray plattformer avslørte 17 vanlige DE gener, (BMP4, CRYGD, DBH, GJB1, KRT83, MPZ, NHLH1, TACR3, ACTC1, MFAP4, SPARCL1, TAGLN, TPM2, CDC20, LHCGR, TM9SF1 og HCCS) 4 av som deltar i en rekke veier.
Konklusjon /Betydning
Identifiseringen av de vanligste dE genene blant BC prøver av forskjellig histologi kan gi ytterligere innsikt i oppdagelsen av nye mulige markører.
Citation: Zaravinos A, Lambrou GI, Boulalas jeg, Delakas D, Spandidos DA (2011) Identifisering av Common differensielt uttrykte gener i kreft i urinblæren. PLoS ONE 6 (4): e18135. doi: 10,1371 /journal.pone.0018135
Redaktør: Michael Polymenis, Texas A M University, USA
mottatt: 9. september 2010. Godkjent: 26 februar 2011; Publisert: 04.04.2011
Copyright: © 2011 Zaravinos et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Instituttet of Urology, Asklipieio General Hospital, 16673 Voula, Athen, Hellas finansiert studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i urinblæren (BC) er den femte vanligste kreftformen hos menn. Toppen utbredelsen av sykdommen er blant pasienter 60-70 år. BC kan helbredes dersom diagnosen i de tidlige stadier av sykdommen. Svulster i urinblæren utvikle gjennom to atskilte men noe overlappende baner: den papillære og ikke-papillær. Omtrent 80% av Bachelor består av overfladiske exophytic papillær lesjoner som stammer fra urothelial hyperplasia. Disse vanligvis lavgradige papillærtumorer kan gjenta seg, men sjelden invadere blæreveggen eller metastasere. De resterende 15-20% av svulster representerer høy grad av faste ikke-papillær Bachelor som oppstår fra høyverdig intraurothelial neoplasi. Disse svulstene aggressivt invadere blæreveggen og har en høy tilbøyelighet for fjernmetastaser [1].
Parallel gen-uttrykk overvåkning er et kraftig verktøy for å analysere forholdet mellom blæren svulster, oppdage nye kreft undergrupper, tildele svulster å pre -defined klasser, identifisere co-regulert eller tumorstadium-spesifikke gener og forutsi sykdom utfallet [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]. Til dags dato har mye arbeid blitt brukt for å identifisere gener som viser differensial uttrykk (DE) mellom ulike krefttyper kontra andre grupper vev, slik som fenotypisk normalt vev. Men de rapporterte DE genene varierer mellom ulike studiegrupper, avhengig av microarray-baserte metoder og antall saker. En spennende sak som har ennå ikke vært overveid innebærer mulig data som kan samles om gener som er forskjellig uttrykt samtidig i alle studie krefttilfeller.
I denne studien har vi utført cDNA microarray analyse, bestående in- huset eksperimentelle samt offentlig tilgjengelige data, for å analysere genekspresjon profil BC og for å bestemme dE gener mellom kreft og friskt vev. Påvisningen av DE-genene ble utført på hver prøve hver for seg, så vel som i hver tumor gruppe, som definert ved histologisk undersøkelse og rapporterte data. Data ble gruppert med forskjellige algoritmer og funksjoner av de kjente DE gener ble ytterligere definert av Gene ontologi. Videre har vi søkte ikke bare for forskjeller blant krefttyper, men heller for likheter. Bakgrunnen for denne tilnærmingen var at, selv om ulike krefttyper er forventet å ha forskjeller i sine uttrykk profiler selv mellom personer med samme svulst subtype, hypotese vi at svulster har lignende egenskaper som kan til slutt føre til kunnskap om etiologi ved kreftutvikling. I et betydelig arbeid med
Goldstein et al.
Et forsøk på å oppdage en vanlig celle er utstedt på prostatakreft ble rapportert. De underforstått at, til tross for forskjellene som tumorceller gjør del, er det en mulighet for en felles opprinnelse [9]. I samme retning forsøkte vi å identifisere felles genekspresjonsprofiler mellom forskjellige tumorvev. På dette punktet bør vi nevne at genekspresjon, spesielt fra tumor biopsier, representerer bokstavelig talt en «snap-shot» av state-plass på den ellers dynamisk oppførsel av sykdommen. Likevel kan denne «snap-shot» være tilstrekkelig for å oppnå nyttig informasjon om dynamikken i systemet av studien. Spesielt i tilfelle av svulster, er det det eneste verktøyet vi har for å trekke ut informasjon på
ex vivo
nivå.
De nåværende dataene støtter verdien av microarray-baserte genekspresjonssignaturer da disse identifisere klinisk viktige cellulære egenskaper.
Materialer og metoder
svulstvev Prøvetaking og Kirurgisk prosedyre
ti kreft i urinblæren prøver fra pasienter med nylig diagnostisert Bachelor gjennomgår transuretral blæretumor reseksjon ved Institutt for Urologi, «Asklipieio» General Hospital, Athen, samt fem prøver normalt vev, ble kjøpt etter mengden vev er nødvendig for rutine patologi undersøkelse hadde blitt fjernet. De undersøkte pasientene var av høy alder (73,9 ± 12,0 år). Flertallet (6/10, 60%) var røykere eller tidligere-røykere, mens fire (40%) var preget av en viss grad av yrkesmessig eksponering for midler knyttet til BC (maling, kjemikalier, etc.). Alle vevsprøver ble klassifisert og gradert etter samme patolog. Histologisk gradering ble utført ved å bruke både 1973 World Health Organization (WHO) og 2004 WHO /International Society of urologisk patologi (ISUP) klassifiseringer [1]. Tumorstadium ble vurdert i henhold til den amerikanske Joint Committee on Cancer staging system 2002 [10]. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter som er inkludert i denne studien. Studien protokollen ble godkjent av etikkomiteen ved University of Crete. Kriteriene som ble brukt var elektivt dissekert primære Bachelor og tilgjengeligheten av DNA fra normal og svulstvev for biomolekylære analyser. Eksklusjonskriterier var en historie med tidligere neoplasmer og cellegift eller strålebehandling før operasjonen
Vevsprøver ble oppnådd ved kirurgi fra svulsten og følgende tre grovt normale utvalgte områder (kald kopp biopsier):. Posterior vegg, trigone , og i tilknytning til svulsten. Deler av dissekert normale prøver ble sendt til histopatologisk analyse. Tumor og normalt vev ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen, transportert og lagret ved -80 ° C til DNA-ekstraksjon.
Pasienter med ikke-muskel-invasiv BCs ble fulgt opp med periodiske cystoskopisk undersøkelser og intravesikal behandling som angitt. Pasienter med invasive BCs ble tilbudt radikal cystektomi med eller uten systemisk kjemoterapi.
Immunohistochemistry
Profiler, 3 mm tykke, av formalinfiksert, parafininnebygd vev ble kuttet og plassert på lysbilder belagt med 3-aminopropyltriethoxysilone. Platene ble tørket ved 56 ° C i 1 time før immunohistokjemisk farging. Vevssnitt ble deparaffinized i xylen før rehydratisering i graderte alkoholer, og endogen peroksidase-aktivitet ble blokkert ved behandling med 3% H
2o
2 ved romtemperatur i 15 min. Antigen avsløring ble utført ved 30 minutters inkubering ved 80 ° C i 10 mM trinatriumcitratoppløsning (pH 6.1). Farging og åpenbaring ble utført på en Dako automatisere. Platene ble inkubert ved romtemperatur med primære polyklonale geite-antistoffer mot anti-ErbB2 (1:800; Dako), cyklin D1 (1:100, SP4, Epitomics), monoklonalt antistoff mot anti-p53 (1:250, E26; Epitomics) og monoklonalt antistoff mot anti-Ki-67 (1:100, SP6, Epitomics). Epitoper av det primære antistoff ble lokalisert ved immunperoksydase teknikk ved hjelp av sekundære antistoff avidin-biotin kompleks og peroksydasesubstrat kit (kit 5001, Dako) i henhold til produsentens protokoll. Seksjonene ble deretter behandlet med Chromagen 30-30 diaminobenzidene -tetrahydroklorid å identifisere områder av immunoprecipitation ved lysmikroskopi. Til slutt, delene ble vasket, kontra med hematoksylin og montert under dekkglass. Ingen spesifikk farging ble observert når det primære antistoff ble utelatt fra protokollen (negativ kontroll). Spesifisiteten til farging ble ytterligere kontrollert ved samtidig farging av brystkreft prøver med kjent ErbB2, cyklin D1, p53 og Ki67 uttrykk mønstre. En erfaren patolog scoret fargeintensitet på fire nivåer (negative, svake, moderate og sterke), vurderer både fargeintensitet og antall fargede celler.
microarray Eksperimentering og inkluderings av offentlig tilgjengelig Mikromatrise datasett
oligos microarray chips (~57 k gener) ble innhentet fra GE Healthcare (IL) og AppliedMicroarrays (MA) (tidligere Amersham Biosciences) (Code 57 k Menneskelig Whole Genome) [11], [12], [13]. Hybridisering ble utført med Code RNA-amplifikasjon og merking kit som beskrevet av produsenten, anvendelse av Cy5 fluorescerende fargestoff. Lysbilder ble skannet med en microarray scanner (ScanArray 4000XL). Bilder ble generert med ScanArray microarray oppkjøpet programvare (GSI Lumonics, USA). CRNAs fra tre forsøksoppsett ble benyttet i enkle eksperimenter med innvendige pigger som kontroller. De eksperimentelle oppsett besto av 10 urin BC prøver av forskjellig histologi (se Tissue Prøvetaking og Kirurgisk prosedyre seksjon) og 5 kontrollprøver. De skannede bildene ble videre behandlet med Code Expression Analysis Software v5.0 fra Amersham Biosciences (for tiden GE Health Care Inc.). Den eksperimentelle oppsettet ble analysert basert på referansedesign som beskrevet tidligere [14], [15], [16] som presenteres i figur S1A. Alle tumorprøver ble sammenlignet mot middelverdien for kontrollprøvene. Rå microarray data er tilgjengelig på GEO microarray database. Alle microarray data er MIAME kompatibel
For å utvide antall BC prøver under etterforskning, inkludert vi følgende offentlig tilgjengelige microarray datasett i vår analyse:. 1) GSE89 datasett (GDS183) [17], som består av 40 BC prøver; 2) GSE3167 datasettet (GDS1479) [18], som består av 60 prøver (9 kontroller og 51 BC prøver); 3) GSE7476 settet [19], som består av 12 prøver (3 kontroller og 9 BC prøver) og 4) GSE12630 datasett [20], som består av 19 BC prøver. Totalt ble vår samlet microarray analyse består av 17 kontrollprøver (n = 5, for Codelink plattformen, og n = 12, for de resterende microarray plattformer) og 129 BC prøver (n = 10, for Codelink plattformen, og n = 119, for de resterende microarray plattformer). Offentlige data ble brukt i deres tilgjengelige normalisert form, siden bakgrunnskorreksjon og normalisering hadde allerede blitt utført.
Mikromatrise Databehandling
microarray Datafiltrering og Bakgrunn Korreksjon av Code Platform.
Filtrering blir utført basert på det signalintensitet og på kriteriet om hvorvidt dette signalet er over et visst nivå. I vår analyse, ble filtrering utført ved hjelp av ligningen: hvor S er den målte signalintensitet, B
L er den lokale bakgrunn målt og σ
BL er standardavviket for den lokale bakgrunnen. Signaler med intensitet lavere enn det ovenfor måles, oppnås et flagg. Bakgrunn korreksjon ble utført ved å subtrahere median globale bakgrunn fra median lokal bakgrunn fra signalintensiteten. En terskel på 2 ble satt som cut-off, noe som betyr at flekk intensitet i minst en kanal bør være to ganger så mye som for bakgrunnen.
Microarray data Normalisering av Code plattformen.
Mikromatrise data ble normalisert ved standardprosedyre av Code programvare, ble altså stikk intensiteter dividert med den globale median (global median normalisering) [13]. Normaliserte data ble hentet, pre-behandlet og sortert med Microsoft Excel ®. For ytterligere dataanalyse Matlab ® (The Mathworks Inc.) datamiljø ble brukt. Data ble undersøkt for sin distribusjon mønster for videre valg av statistisk testmetode.
Mikromatrise data Cross-Normalisering.
mikroarray data var kryss normalisert, ved hjelp av en quantile algoritme, for å konto for bias som ble tatt på grunn av eksperimentering, ulike plattformer og annen prøvetaking (Figur S2). Normalisering av plattformer data har blitt beskrevet tidligere [21], [22], [23] med svært gode sammenhenger og konsistens mellom Code og Affymetrix plattform [24], [25].
skape en felles Gene List og BC grupper
for å sikre at resultatene av vår analyse var sammenlignbare, har vi opprettet en felles gen liste blant alle microarray plattformer. For dette formål ble NCBI Gene ID-nummer brukt som en felles referanse. Etter å sammenligne DE genene blant alle datasett, ble bare de som er tilstede i alle plattformer valgt for videre analyse. Totalt denne filtre tilnærmingen ga et gen sett 11,837 unike poster, samtidig tilstede i alle microarray plattformer. Datasett ble benyttet som individuelle prøver, så vel som i tumor grupper. Gruppen fordeling er presentert i tabell S1.
mikroarray data statistikk for Codelink plattformen og Offentlig tilgjengelige Microarray datasett
I forhold til Codelink plattformen vår tilnærming besto av følgende metodikk. Hvert gen ble testet med hensyn til sin betydning i differensiell ekspresjon ved hjelp av en z-test. Gener ble ansett for å være vesentlig forskjellig uttrykt hvis de fikk en p-verdi 0,05. Sammenligninger ble gjort både blant eksperimenter samt innenfor eksperimenter. Satt manipulasjon ble deretter benyttet for å oppdage ytterligere undergrupper som vil karakterisere, om mulig, alle tumorprøver. . For ytterligere analyser vi brukte de genene som var forskjellig uttrykt blant tumorprøver
Når det gjelder sammenligning mellom gener av alle tilgjengelige microarray datasettene har vi brukt følgende metode:
Først søkte vi for forskjeller, sammenligner alle kontrollprøver (betraktes som en gruppe), mot alle kreftprøver (betraktet som en annen gruppe), ved hjelp av en to-tailed to-sample T-test. Siden disse gruppene inneholdt prøvene som varierte i etnisitet og svulst klasse, vi kontrollerte all skjevhet ved å sammenlikne dem som enhetlig grupper.
For det andre, separert vi prøver inn i grupper (11 grupper totalt) (tabell S1), og hver gruppen ble sammenlignet mot alle kontrollprøver, ved hjelp av en to-tailed to-sample T-test.
Tredje, sammenlignet vi prøver individuelt for vesentlige gener mellom hvert forsøk, ved hjelp av en to-tailed z-test, som er referert til som «intra-eksperimentelle». Denne type sammenligning hadde en egenart. Siden ekspresjonen av genene ble sammenlignet med gjennomsnittet av genekspresjonen i samme eksperiment, ville DE genene betegne den forskjell at hver vevsprøve utstilt i sammenligning med normalt vev. Dette betyr at de felles gener blant dem ville være de gener som er felles for svulstvevet.
Vi sammenlignet prøver individuelt for vesentlige gener dvs. genet forhold, blant forsøksoppsett, ved hjelp av en to-tailed z-test, som vi refererer til som «inter-eksperimentelle». Med andre ord, vi søkte etter gener som utviste ekspresjon forskjellig fra en prøve til den neste, men ikke mot kontrollprøver. Interessant, betydelige gener som er avledet fra disse inngår gener som ikke var DE. Med andre ord, ble disse genene identifisert blant dem som uttrykk forblitt den samme i alle prøvene.
For å identifisere differensielt uttrykte gener, vi brukte to metoder. Gener ble ansett for å være vesentlig forskjellig uttrykt hvis de fikk en p-verdi 0,05. Sammenligninger ble gjort både blant eksperimenter samt innenfor eksperimenter. Satt manipulasjon ble deretter benyttet for å oppdage ytterligere undergrupper som vil karakterisere, om mulig, alle tumorprøver. For ytterligere analyser vi brukte de genene som var forskjellig uttrykt blant tumorprøver, på et behov for å bruke basis. I det tilfelle hvor prøvegruppene ble sammenlignet, ble gjennomsnittet av hvert gen tatt mot gjennomsnittet av alle kontrollprøver. Når det gjelder individuelle sammenligninger av prøvene, ble genet forholdstall beregnet mot gjennomsnittet av alle kontrollprøver.
False Discovery Rate (FDR)
Den falske funnraten ble beregnet som tidligere beskrevet [26 ], [27], [28].
Clustering analyse
Clustering analyse ble utført med k-betyr algoritme. Totalt 81 klynger av hele datasettet på Codelink plattformen og 100 klynger for alle tilgjengelige datasett, ble dannet og DE genene ble videre klassifisert ved hjelp av to-veis (gener-mot-samples) gjennomsnittlig binding hierarkisk clustering med euklidske avstand [29 ]. Clustering analyse og kromosom kartlegging ble delvis utført med Genesis 1.7.2 (Technische Universitaet-Graz, Østerrike) ved hjelp av Pearsons korrelasjon (
r
) og Spearmans rangordnet sammenheng (
ρ
) [30 ], [31], [32].
TFBM Analyse
for å identifisere de transkripsjonsfaktorer som driver de observerte endringene i genuttrykk, vi undersøkt transkripsjonsfaktorbindende Motiver (TFBMs) i transkripsjon Element Lytte System Database (telis) (www.telis.ucla.edu) [33]. Den TRANSFAC transkripsjonsfaktor databasen ble brukt for identifikasjon av gentranskripsjon faktor bindingssteder [34].
kromosom Mapping
kromosom kartlegging ser ut til å være en lovende metode for å identifisere mønstre blant gener. Hovedideen opprinnelig rapportert av
Cohen et al
. er å kartlegge gener på kromosom regioner og på denne måten hvis sammenhenger eksisterer de vises gjennom plasseringen av gener på kromosom regioner, ettersom påfølgende gener er ofte på samme måte uttrykt [30]. For kromosom kartlegging analyse, brukte vi Gene ontologi Tre Machine, WebGestalt web-verktøy (Vanderbilt University, Nederland, https://bioinfo.vanderbilt.edu/gotm/) [35] og Matlab ® (The Mathworks Inc.) datamiljø.
Gene ontologi (GO) analyse
Gene ontologi (GO) analyse ble opprinnelig utført ved hjelp av Egon online verktøy for Gene ontologi (den norske universitet for vitenskap og teknologi, Trondheim, Norge , https://www.genetools.microarray.ntnu.no/egon/) for å finne savnede genet symboler [36]. WebGestalt web-verktøy (Vanderbilt University, Nederland, https://bioinfo.vanderbilt.edu/gotm/) [35], [37] ble brukt for genet funksjons klassifikasjoner. Forholdet til de forskjellig uttrykte gener og transkripsjonsfaktor bindende motiver ble videre undersøkt ved hjelp av Pubgene ontologi Database (www.pubgene.org). Gene definisjoner og funksjoner var basert på National Institute of Health databaser (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez/).
GEO deponeringsnummer
Array dataene ble avsatt på Gene Expression Omnibus (National Center for Biotechnology Information) med deponeringsnummer GSM678186 gjennom GSM678385 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE27448).
Results
Immunohistochemistry
Tumor Prøvene ble farget med antistoffer for ErbB2, cyclin D1, p53 og Ki-67. Hvis til stede, anti-ErbB2-farging i tumorprøver er en membranfarging, diffus i urothelium (figur 1). Alle TCC prøver (100%) viste moderat /sterk (++, +++) farging, mens ingen TCC prøven viste ingen /svak farging (0, +). Terskler for høye merkeindeksene ble satt for Ki-67 på ≥10% positiv tumor kjerner og for p53 ved 10 og 20%. T1 /2-Grade III tumorer oppviste den sterkeste immunfarging (+++, 70%). T1-Grade I /II svulstene, viste svak farging for anti-Ki-67 (40% og 7,5%, respektivt), mens T1 /2-Grade III tumorer oppviste den sterkeste immunfarging (54%). Tilsvarende T1-Grade I /II svulstene, viste svak farging for anti-p53 (10% og 35%, henholdsvis), mens T1 /2-Grade III tumorer oppviste den sterkeste immunfarging (53%). På den annen side, T1-Grade I /II svulstene, viste intens farging for anti-Cyclin D1 (80% og 80%, henholdsvis), mens T1 /2-Grade III tumorer oppviste svak farging (31,8%).
på den annen side, T1-Grade II svulster viste intens farging for anti-cyclin D1 (80%), mens T1-grad III svulster viste svak farging. Representant H E lysbilder betegne histologi av T1-Grade II, T1-Grade III og T2-Grade III svulster
Distribusjon Code Platform data og analyse
Microarray data ble undersøkt. for deres normalfordeling eiendom. De normaliserte data fulgte en normalfordeling som vist i figur S1B og S1C. Z-teststatistikken ble påført på data, både på individuelle prøver så vel som på tumor grupper. I tilfelle av tumor grupper gener som er oppnådd en p-verdi 0,05 ble betraktet som forskjellig uttrykt. I fig S3A-C fordelingen av p-verdiene er presentert. FDR ble beregnet som tidligere rapportert [27], [28]. FDR ble beregnet til å være 9,3% for en p-verdi 0,05 for svulster i T1-Grade II-gruppen, 8,6% for p-verdi 0,05 for svulster i T1-Grade III gruppe og 11,03% for p-verdi 0,05 for svulster i T2 og T3-Grade III gruppe (figur S3D-F). Den samme prosedyre ble fulgt for hver prøve individuelt. Gener ble plottet i box-plott for å undersøke uttrykk utdelinger i ytterligere detalj. Box-plott av svulst grupper samt de individuelle prøvene er vist i figur S4A og Figur S4B henholdsvis
Analyse av Common forskjellig uttrykt Genes:. Code Platform
For å identifisere genet ekspresjonsmønstre i urin BC, vi videre analysert vår microarray data på en slik måte at vanlige mønstre for ekspresjon mellom de forskjellige prøver ble identifisert. Vi fokusert vår analyse, ikke bare på forskjellene mellom tumorprøver, men også på deres likheter. Det var ikke overraskende at slike likheter eksisterte. Skjæringene mellom de enkelte tumorprøver viste 831 gener som er differensielt uttrykte samtidig i alle tumorprøver (enten opp- eller ned-regulert). Av disse DE genene, identifiserte vi 33 gener med samtidig økt uttrykk og 85 gener med samtidig redusert uttrykk i alle BC prøvene, sammenlignet med normalt vev.
Blant de oppregulert gener, de presentere den høyeste fold uttrykk ( gjennomsnitt ± SD) var: hypoksi-induserbar protein 2 (HIG2; NM_013332.1) (2,70 ± 0,54); APC11 anaphase fremme kompleks subenhet 11 (ANAPC11; NM_001002245.1) (2,50 ± 0,60); zo54e12s1 Stratagene bukspyttkjertelen (# 937208) cDNA-klon BILDE: 590734 3 «lik TR: G1022718 G1022718 NUCLEAR RESEPTOR CO-repressor (NCOR1; AA156336.1) (2,01 ± 1,13); UI-en-BB1p-ATP-e-01-0-UIs1 NCI_CGAP_Pl6 cDNA-klon UI-en-BB1p-ATP-e-01-0-UI 3 «, (BU754189; BU754189.1) (1,89 ± 0,56). Tilsvarende gener som viste de laveste fold ekspresjonshastigheter (gjennomsnitt ± SD) var: tn52a12.x1 NCI_CGAP_Kid11 cDNA-klon BILDE: 2171998 3 «lik inneholder PTR5.b2 MER22 repeterende element (AI565993, AI565993.1) (-3,13 ± 0,66 ); zx51b02r1 Soares_testis_NHT cDNA-klon BILDE: 795723 5 «(AA461577, AA461577.1) (-2,75 ± 0,86); lactotransferrin (LTF) (ANKRD29; NM_173505.2) (-2,28 ± 1,17); HUMNK566 human epidermal keratinocyte cDNA-klon 566 (ODZ2; D29453.1) (-2,15 ± 1,02); tumor nekrose faktor reseptor superfamily, medlem 17 (TNFRSF17) (TNFRSF17; NM_001192.2) (-2,07 ± 0,73); og skjelettmuskel LIM-protein FHL1 mRNA (FHL1; U60115.1). (-2,06 ± 0,87)
Når det gjelder de tre kreft grupper (T1-Grade II, T1-Grade III og T2 /T3-Grade III ), vår analyse viser ikke et delsett av gener som er felles for alle grupper. Derfor, undersøkte vi de vanlige DE genene mellom par av tumor grupper (Tabell S2, S3, S4). DE gener som er felles for alle personer, uavhengig av tumor gruppe, ble ytterligere gruppert ved hjelp av hierarkisk clustering med euklidsk avstand. Grupper av felles gener i flere kombinasjoner er presentert i tabell S5
hierarkisk Clustering med Euklids Avstand:.. Code Platform
Vi utførte toveis gjennomsnittlig binding hierarkisk clustering med euklidske avstand for ~57 k gener. Et detaljert riss av prøven klyngen dendrogram er vist i figur 2. Vi fordelt tumorene i to hovedgrupper og flere undergrupper, basert på en annerledes ekspresjon av sitt genom. Den første grenen inneholdt en T1-Grade II svulst og den andre inneholdt svulster i T1-3-Grade II /III, som ble ytterligere gruppert i flere undergrupper
k-means. Code Platform.
k-means algoritmen er en annen måte å klassifisere data for å finne mønstre av uttrykk. Vår analyse ble organisert som følger:
k-hjelp av alle gener og av alle prøvene. Resultatet av k-means for alle genene og alle prøvene er presentert i figur 3A. Vi samlet data i 49 klynger sammen med sine centroids (Figur 3B). For hver klynge gruppe var det flere gener som preget klyngen dvs. preget utvalget at genene tilhørte.
k-hjelp av vanlige DE gener i alle prøvene. De vanligste DE genene blant alle prøvene ble fremmet gruppert (figur 4A og 4B).
k-hjelp av kreftgrupper. For å konkludere analysen basert på k-means tumor gruppene ble analysert som angitt ovenfor. Resultatene er presentert i Figur 5A og 5B for klynge og centroids, respektivt. Klynger av tumor gruppene avdekket både forskjeller og likheter mellom de ulike gruppene. For eksempel er bestemte gene kategorier avslørte konstitutiv ned-regulering i en tumor gruppen mot gruppen av høyere stadium /grad, mens andre kategorier gen oppviste konstitutiv oppregulering mellom de tilsvarende grupper (klynger 11, 24, 27, 30, 33, 41, 46). Samtidig flere klynger inkludert gener som forble uforandret mellom tumor grupper (klynger 21, 26, 35, 37, 45, 47, 48).
K-cluster betyr ga noen tydelige mønstre mellom prøvene , slik som i klynger 1, 3, 4, 5, osv
Clusters (A) og centroids (B) presenteres der ingen klart skille kan gjøres mellom enkeltprøver.
Principal Component Analysis (PCA). Code Platform
PCA av alle genene i alle prøvene. PCA analyse av våre data ble videre gjennomført for å søke etter andre potensielle mønstre blant gener. Den innledende analyse ble utført med gener som ble mest de blant alle prøvene. Beregnede Hovedkomponentene ble plottet mot hverandre i spredningsplott som presentert i figur 6. PCA-analyse av genene ble utført for å finne ytterligere mønstre i uttrykket dataene. For å utføre denne analysen med alle gener og i alle prøvene, de første skritt var å plotte spredningsplott av alle kombinasjoner av de viktigste komponentene (Figur 6A, B). Genene manifestert flere mønstre som nevnt i insirklede områdene i figur 6B. Deretter ble prøvene undersøkt for prosentandelen av variansen de knyttes til hovedkomponentene (figur 6C, D). Til slutt ble en biplot konstruert for å undersøke prøven klassifisering med hensyn på total genekspresjon (figur 6E). Som presentert i de sirklene områdene i Figur 6E, ble prøvene grupperes i to hovedkategorier: prøver 22A (T2 /T3-Grade III), 27A (T1-Grade III) og 29A (T2 /T3-Grade III) på den ene siden, og resten av prøvene ble gruppert sammen. For ytterligere å løse for forskjeller basert på PCA-analyse sammenlignet vi genekspresjon som følger.
PCA av vanlige DE gener i alle prøver. PCA-analyse av de vanlige DE-genene er vist i figur 7. gruppering av prøvene basert på hovedbestanddelene viste ulike klassifiseringer. Tumorprøver 2A, 3A og 4A ble gruppert tydelig som per de første tre hovedkomponenter (figur 7E). Disse tre prøver ble gruppert sammen når det fullstendige datasettet ble vurdert. Løse dette resultatet med de vanlige DE genene viste en forskjell mellom kreftgrupper. På samme måte ble flere forskjellige grupperinger oppnådd ved PCA-analyse av de vanlige DE genene hos alle prøver, for eksempel blant tumorprøver 22A, 10A, prøvene 2A, 4A, 16A som dannet en separat gruppe og prøvene 3A, 17A, 26A, 27A, 29A som dannet en annen (figur 7F). Tilsvarende plotting av komponentene gruppert prøvene 3A og 16A, samt prøver 2A, 4A og 10A i en separat gruppe.
PCA av tumor gruppene.
