Abstract
Siden individuell terapi blir mer og mer viktig i behandling av endetarmskreft, bør en nøyaktig og effektiv tilnærming være etablert i kliniske sammenhenger for å hjelpe leger til å fatte sine beslutninger. Sirkulerende tumorceller (CTCs), stammer fra enten primær eller metastatisk kreft, kan gi viktig informasjon for diagnostisering og oppfølging av kreft. Imidlertid er det på hodet og utvikling av CTCs begrenset på grunn av den ekstreme sjeldenhet av disse tumorceller. I denne studien ble fremstilt vi en enkel og meget effektivt mikrofluidanordning som utnytter tallrike filtrerte mikrokanaler i den for å berike den store størrelse target tumorceller fra fullblod. En meget høy CTC fangsteffektivitet (gjennomsnittlig utvinningsgrad: 94%) ble oppnådd i denne anordning ved den optimale strømningshastighet på 0,5 ml /t og kanalhøyde på 5 um. I tillegg har vi brukt denne enheten for å påvise CTCs i 60 pasienter med endetarmskreft. CTC tellinger av endetarmskreftpasienter var betydelig høyere enn hos friske personer. Videre CTC teller oppdaget av denne enheten var betydelig høyere enn ved EpCAM perle basert metode for endetarmskreftpasienter med ulike stadium. Spesielt for lokaliserte endetarmskreftpasienter, de positive tallene for prøver med mer enn 3 CTCs per 5 ml blod ved bruk av microdevice vs. EpCAM-baserte seg var 100% vs. 47%, henholdsvis. Dermed gir denne enheten en ny og effektivt verktøy for nøyaktig identifisering og måling av CTCs hos pasienter med endetarmskreft, og har bred potensial i klinisk praksis
Citation. Sun W, Jia C, Huang T, Sheng W Li G, Zhang H, et al. (2013) High-Performance Størrelse Basert Microdevice for deteksjon av sirkulerende tumorceller fra perifert blod i endetarmskreft pasienter. PLoS ONE 8 (9): e75865. doi: 10,1371 /journal.pone.0075865
Redaktør: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Spania
mottatt: 23 april 2013; Godkjent: 16 august 2013; Publisert: 16.09.2013
Copyright: © 2013 Sun et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av noen vitenskapelige forskningsfondene som følger: 1. National Basic Research Program of China (973 Program No. 2012CB933303) 2. Key klinisk prosjekt Helsedepartementet (2010-2012) 3. Fudan University Radiation medisin Research tredje fase «985-prosjektet» (Grant No. 985III-YPT06) 4. The National Natural Science Foundation of China (No. 81101645, 61271162) 5. Shanghai Municipal Commission for naturvitenskap og teknologi (No.12nm0503702, 11JC1414400). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i de senere årene, er forekomsten av kreft i endetarmen dramatisk økende over hele verden [1]. Til tross for de siste fremskritt innen diagnostikk og behandling teknikker, utfallet etter behandling forblir fattige hovedsakelig på grunn av utseendet på fjernmetastaser [2] -. [4]
Sirkulasjonstumorceller (CTCs), kaster fra enten primær eller metastatisk kreft, har blitt identifisert i det perifere blod hos pasienter og er ofte forbundet med kreft tilbakefall og metastase [5] – [6]. Følgelig ville påvisning av CTCs forventes å tilveiebringe et kraftig verktøy for kreft prognose, diagnose av minimal restsykdom, vurdering av tumor følsomhet overfor anti-kreft-medikamenter, og anvendelsen av individuell behandling [7].
Imidlertid forsøk på å studere CTCs er begrenset av deres sjeldenhet, med konsentrasjoner så lave som en CTC per milliard sirkulerende hematologiske celler [8]. Således CTCs må anrikes, isolert og riktig identifisert for å være klinisk nyttige. For tiden er en av de mest brukte metoder for påvisning CTC er basert på anvendelse av magnetiske kuler konjugert antistoff mot epitel-tumorrelaterte overflateantigener slik som epitelisk celleadhesjonsmolekyl (EpCAM) [9] – [10]. Den CellSearch (Veridex, NJ, USA) system er et typisk eksempel ved hjelp av anti-EpCAM magnetiske kuler basert metode for å detektere CTCs og det er det eneste systemet som er godkjent av det amerikanske FDA for klinisk utnyttelse ved metastatisk brystkreft, tykktarms og prostatakreft til nå [ ,,,0],11]. Ikke desto mindre noen data antydet at epitel-antigenet kan være tapt på grunn av CTCs epiteliale-mesenkymale overgang (EMT), som ble ansett for å være en viktig hendelse i metastatiske prosess [12] – [13]. Dette kan være hovedproblemet som begrenser den brede anvendelsen av EpCAM-baserte metoden i klinisk praksis.
På den annen side er en annen vanlig brukt metode for å separere CTCs fra blodprøver er basert på forskjeller i cellestørrelse og deformerbarhet mellom CTCs og hematologiske celler. Generelt er de størrelser av CTCs varierer fra 15 til 25 pm i diameter, som er større enn de av hematologiske celler (. Gjennomsnittlige størrelser av erytrocytter og lymfocytter fra perifert blod er henholdsvis 8 um og 7-10 um i diameter,) [14] – [ ,,,0],15]. Iset (Les Ulis, Frankrike), som lister opp CTCs av blod filtrering gjennom polykarbonat Track-Etch-type membraner med 8 mikrometer sylindriske porer, er en representant ett med relativt høy fangsteffektivitet [16]. Men porene i polykarbonatfiltere, som er fremstilt av spor etsing, er tilfeldig plassert med ujevn tetthet [17] – [18]. Nylig, har utviklingen av microfabrication teknikk tillot innføring av microfluidic metoder for å fange opp disse sjeldne celler, noe som kan gjøre opp den svake Iset [19] – [20]. Ved hjelp av en-lags parylene-C membranmikrofilter, Zheng S et al. [21] utvinnes 89,5% ± 9,5% menneskelige prostata kreft celler som ble tilsatt i fullblod fra friske donorer. I tillegg Tan og Lim et al. [14] utviklet en microfluidic enhet med flere matriser av halvmåneformede brønner og fått fangingseffektiviteter høyere enn 80% for brystkreft og tykktarmskreft cellelinjer. Videre Bhagat et al. [22] benyttet en rektangulær mikrokanaler mønstret med en sammentrekning-utvidelsesarray og kjøpte utvinningsgrad høyere enn 90% for menneskebrystkreftceller av MCF-7. Likevel, disse fremgangsmåter bare detektert prøvene med cancercellelinjene tilsatt i frisk blod, men mangler verifikasjon av CTCs i blodet hos kreftpasienter, samt videre analyse av deres kliniske anvendelse.
Nye terapeutiske strategier forbedring effekt mot metastatisk sykdom og nøyaktige biomarkører for oppfølging av endetarmskreftpasienter er de ledende utfordringer, sammen med tidlig oppdagelse og screening i høyrisikogrupper. I denne studien vi utviklet og fremstille et mikrofluidfiltreringsinnretning for å fange opp disse sjeldne CTCs basert på forskjellene i størrelse mellom tumorceller og blodbestanddeler. I vår enhet, passerer blodstrømmen gjennom en mikrokanal-basert system slik størrelse-selektiv isolering av sjeldne tumorceller, med meget høy fangsteffektivitet og fullt repeterbarhet. Etter immunfluorescens flekker, kan CTCs deretter identifiseres og telles direkte under fluorescens-mikroskop. Vår anordning er et svært effektivt verktøy for fangst av sjeldne CTCs uten behovet for store og kostbare apparater. var formålet med denne studien som følger: For det første, har vi målt og optimalisert parameterne for vår mikrofluid anordningen ved å tilsette kolorektal kreftceller i blodprøver. For det andre, vi nummerert og analysert CTC fangsteffektiviteten både i piggete celler modell og i blodprøver fra pasienter med endetarmskreft. Til slutt, vi sammenlignet vår enhet med anti-EpCAM antistoffer konjugert immunobead basert metode.
Materialer og metoder
Device design og fabrikasjon
Som vist i figur 1, microfluidic enheten består av 80 hovedkanal og sidekanaler 81, som er anordnet i en interdigital måte å minimalisere chip fotavtrykk. En gruppe av smale parallelle arrangerte filter kanaler er utformet for å koble til hvert par av hovedkanalen og tilstøtende sidekanal. Både hovedkanaler og sidekanalene har tverrsnittene av 50 mikrometer i bredde og 50 mikrometer i høyde, mens de av filter kanalene har en bredde på 20 um og høyder som varierte fra 2 um til 8 um. For hvert hovedkanal, er høyre side koblet direkte med prøven innløp, og venstre side er koblet via et filter kanal til en avfallskammeret, med en rekke mikro-innlegg som er utformet for å forhindre kammer kollaps. For hver sidekanal, er på høyre side blind og den venstre er koblet direkte til samlekammeret. Etter at blodprøven er lastet ved innløpet, er et negativt trykk påføres til utløpet, som aspirerer blodprøven inn i hovedkanalene. I mellomtiden, som følge av trykkforskjellen mellom hovedkanalen og den sidekanal, de fleste av de små dimensjoner hematologiske celler i fullblod, som erytrocytter og leukocytter kan filtreres inn i de tilstøtende side kanaler via filter kanaler og deretter fjernet fra avfallskammeret. De store celler som kreftceller kan ikke passere gjennom trange filter kanalene og deretter forbli i hovedkanalene. Dette er teorien om isolasjon av CTCs for denne enheten
A) Et skjematisk av mikrofluidanordningen.; B) Den skjematisk av oppsett av arbeidsstasjon for CTC isolasjon; C) Strukturen av anordningen under mikroskop; D) Et skjema som viser teorien av innretningen i vertikalsnitt; E) Skjematisk viser teorien om enheten i profil.
Vår enhet ble fabrikkert ved å binde en hybrid polydimethylsiloxane (PDMS) skive inneholder tredimensjonale mikro kanaler med et glass lysbilde. Den microfluidic enheten ble fabrikkert gjennom veletablerte multi-layer myk litografi prosess [23]. I korthet ble et to-nivå master ble fremstilt fra en negativ foto-motstand, SU-8 (Microchem, USA). Deretter ble avgasset PDMS (blandet i et 10:01 forhold av PDMS basis med herder, Sylgard 184, Dow Corning Inc., USA) ble støpt over hoved formen og bakt ved 90 ° C i 1 time i en ovn. Etter herding ble PDMS skive nøye skrellet av fra master mold. Ett innløp og ett utløp ble punchet gjennom PDMS ved hjelp av en nål med en avflatet spiss. PDMS skive ble deretter limt med et objektglass etter oksygen plasmabehandling, og fremgangsmåten ble beskrevet som følger: oksygenplasma binding ble utført ved å bruke dedikerte plasmarenser (PDC-32G-2, Harrick Plasma Corp., USA). Glasset lysbilde og PDMS skive ble plassert i kammeret av plasma renere i 50 sekunder. Etter dette ble PDMS plate og glass slide tatt ut av kammeret, og PDMS ble plassert og trykket på glasset umiddelbart.
Cell Culture and Cell Spike
Den menneskelige kolorektal cellelinje HT- 29 som ble oppnådd fra cellebank av American Type Culture Collection ble dyrket i McCoys 5A medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA). Cellekultur ble utført i en inkubator ved 37 ° C i 5% CO
2. Vekstmediet ble aspirert og cellene ble deretter høstet ved bruk av 0,25% trypsin. Umiddelbart før eksperimentene ble cellene renset med PBS-buffer og resuspendert. Ved å følge produsentens instruksjoner, ble cellene behandlet med Vybrant Dii celle-merkingsløsninger (Carlsbad, Invitrogen, CA) i 5 minutter ved 37 ° C, deretter skylles med PBS buffer og resuspendert. Konsentrasjonen av celler ble bestemt ved telling med et hemacytometer. Den ønskede konsentrasjon av celler ble fremstilt ved å fortynne cellesuspensjoner i PBS-buffer. Merkede celler med kjente tall ble tilsatt i blodprøver for ytterligere målinger.
Blood Prøvetaking og behandling
Blodprøver fra 60 pasienter med endetarmskreft ble oppnådd fra mars til desember 2012. Alle pasienter ble bekreftet patologisk som rektal carcinoma ved biopsi eller kirurgi. Av disse ble 30, 10 og 20 pasienter bekreftet som nylig diagnostisert Stage II-III, lokalt tilbakefall og fjernmetastaser, henholdsvis. For alle disse 60 pasienter, ble 10 ml blodprøver oppnås etter CTC deteksjon, inkludert 5 ml av mikrofluid enheten og 5 ml av EpCAM basert metode.
Som en kontrollgruppe, blodprøver ble også tatt fra 30 friske frivillige som ikke hadde noen kjent sykdom eller feber på tidspunktet for uavgjort, og ingen historie av malign sykdom.
Alle prøver ble trukket inn i evakuert EDTA-inneholdende blodprøverør, lagret ved 4 ° C og behandles i løpet av 72 timer. Etter sentrifugering av perifert blod ved 1500 rpm i 10 min, ble plasmaprøvene forsiktig fjernet fra den øvre del av den overliggende væske. Røde blodceller lyseringsbuffer (0,139 M NH
4Cl, 0,02 M Tris, pH 7,2) ble tilsatt til de gjenværende blodprøver og blandes i 45 minutter ved romtemperatur. Etter sentrifugering ved 1500 rpm i 10 minutter, supernatanten ble fjernet og den gjenværende perifere blod mononukleære celler (PBMC) pelleten ble resuspendert i PBS-buffer.
instrumentet
Før behandlingen av gjenkjenning, konsentrasjonene av PBMC-prøver fra pasienter med kreft i endetarmen (eller prøver fra friske donorer med piggete HT-29 celler) ble målt ved hjelp av et hemacytometer og fortynnet i PBS-buffer som 5 x 10
7 celler /ml. Deretter fortynnes den 0,5-0,6 ml PBMC-prøver ble innført i enheten ved hjelp av pumping. En sprøytepumpe (PHD 22/2000, HAVARD apparat, Massachusetts, USA) med en 5 ml sprøyte for avfall innsamling ble koblet til utløpet av enheten. Innløpet av enheten var koblet til blodprøvene via polymerrør. Sprøytepumpen ble slått på og trykket justeres i henhold til den ønskede strømningshastighet. Blodprøvene ble pumpet fra innløpet inn i mikrofluid anordning for CTC fangst og de filtrerte hematologiske bestanddeler slik som leukocytter ble oppsamlet i avfallskammeret.
identifikasjon og telling av CTCs ved Fluorescensmikroskopi
etter prosessen med CTC fangst, ble tumorceller identifiseres og skilles fra leukocytter basert på morfologi og differensial antigen ekspresjon. Tumorceller er epitelceller (cytokeratin + /CD45- /DAPI +), mens leukocytter er nonepithelial (cytokeratin- /CD45 + /DAPI +). Fluorescerende reagenser ble pumpet inn i apparatet og immunfluorescens reaksjonen ble utført direkte i kanalene i enheten. For det første, ble antistoffer mot CD45 konjugert til FITC (BD Biosciences, USA) innført i anordningen, etterfulgt av inkubasjon i 30 minutter ved 0 ° C. Deretter ble en løsning av 0,2% Triton X-100 og antistoffer mot cytokeratin konjugert til fycoerytrin (C-11, Abcam, UK) ble pumpet inn i enheten og inkubert i 10 min og 1 time, respektivt. Deretter ble fanget celler blandet med DAPI-løsning i 20 minutter. Til slutt ble fanget cellene fiksert med en oppløsning av 1% paraformaldehyd i 20 min. Etter disse reaksjonene ble anordningen spylt med 1 ml PBS for å fjerne overskudd av reagenser. Captured celler ble identifisert og nummerert med fluorescens mikroskopi (Olympus-Amerika). CTCs ble identifisert i henhold til farget farge og morfologiske karakteristikker som cellestørrelse, form og kjernefysisk størrelse. Cellene som farget cytokeratin + /CD45- /DAPI + og møtte fenotypiske morfologiske egenskaper ble scoret som CTCs. En erfaren patolog som var blind for de kliniske resultatene grundig evaluert hver blodprøve for CTC identifikasjon.
CTCs Detection ved EpCAM-basert metode
fangst effektivitet av CTCs ble også målt ved EpCAM baserte metode. Detaljert metoden ble beskrevet som følger: Utskillelsen av CTCs ble utført ved bruk av immunomagnetiske perler belagt med epiteliale cellespesifikke EpCAM antistoffer (magnetisk perle: 4,5 mikrometer i diameter, Dynal, Invitrogen, USA) i henhold til produsentens anvisninger. PBMC-pelleten ble resuspendert i PBS-buffer og blandet med immunomagnetiske kuler. Den celle-perler blandingen ble inkubert i 40 minutter ved 2-8 ° C med forsiktig vipping og dreining. Blandingen ble plassert i et magnetisk i 5 min, og supernatanten ble fjernet forsiktig. Deretter ble antistoffer mot CD45 konjugert til FITC (BD Biosciences, USA) tilsatt og blandet med fangede celler i 30 minutter ved 0 ° C. Deretter ble cellene vasket med en oppløsning av 0,2% Triton X-100 i 10 minutter og blandet med antistoffer mot cytokeratin konjugert med fycoerytrin (C-11, Abcam, UK) i 1 time. Etter at de digitaliserte celler ble blandet med DAPI-løsning i 20 minutter. Til slutt, ble cellene fiksert med en oppløsning av 1% paraformaldehyd i 20 min. Etter hvert behandlingstrinn, ble fanget cellene vasket med PBS-buffer for å fjerne overskudd av reagenser i et magnetisk. Fremgangsmåten for å identifisere og opplisting CTCs var lik med den av mikrofluid anordningen, i henhold til farget farge og morfologiske karakteristikker som cellestørrelse, form og kjernefysisk størrelse. Cellene som farget cytokeratin + /CD45- /DAPI + og møtte fenotypiske morfologiske egenskaper ble scoret som CTCs. En erfaren patolog som var blind for de kliniske resultatene grundig evaluert hver blodprøve for CTC identifikasjon.
Etikk erklæringen
Alle prosedyrer for påmelding ble utført i samsvar med relevante lover og institusjonelle retningslinjer og relevant institusjonell komité (Ethics Committee of Fudan University i Shanghai Cancer Center) godkjent vår forskning. Alle pasienter og friske frivillige signert skriftlig informert samtykke før innmelding.
Statistical Analysis
statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS (versjon 16.0, SPSS Inc., Chicago, IL). Alle resultater ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Capture effektivitet ble beregnet ved å dividere antall av de fangede målceller med det totale antallet målceller som innføres i anordningen. Renheten av celler fanges opp, ble bestemt ved å dele antall av de fangede målceller med antall av det totale antall celler fanges opp. Regresjonsanalyse ble utført for å bedømme riktigheten av tumorceller deteksjon. A Mann-Whitney U-test og Kruskal-Wallis H-testen ble brukt i tilfeller av 2 uavhengige prøver og mer enn 2 prøver, henholdsvis, mens de sammenligninger av relaterte målinger ble utført ved anvendelse av en Wilcoxon rank test signert. Spearmans rank korrelasjon ble brukt til å analysere korrelasjonen av fangstgrad mellom microfluidic enheten og EpCAM basert metode. Alle testene var tosidig og ble utført på et 5% signifikansnivå.
Resultater og Diskusjon
Effekten av Channel Høyde og Flow Rate på CTC Capture Effektivitet
for å optimalisere de eksperimentelle parametre i denne enheten, piggete vi HT-29 celler med kjente numrene i blodprøver fra friske donorer for å måle fangsteffektivitet og celle renhet.
for det første, har vi undersøkt effekten av det filter kanal høyden på fangst effektivitet og celle renhet. Som vist i figur 2a, fangst effektiviteten av CTCs med 8 um kanal høyde var tydelig lavere enn det med 2 um og 5 um høyde, mens tilsvarende økt fangsteffektivitet på 98% kunne ikke observeres for 2 pm og 5 pm. I tillegg cellen renhet gradvis bedre med økning av kanalens høyde, som vist i figur 2b. Således, på basis av dataene i figur 2a og 2b, valgte vi en høyde på 5 mikrometer som den beste avveining mellom fangsteffektiviteten og celle renhet. Disse resultatene indikerte at det var en nær sammenheng mellom størrelsen på filteret hulrom og fangst effektiviteten av CTCs, og enkelte andre studier har også gjort lignende konklusjoner: Hosokawa M. et al. [24] benyttet en størrelse-selektiv microcavity array å isolere CTCs og dens fangsteffektivitet presentert en nedadgående trend med økning av microcavity størrelse. Sheng W. et al. [25] fabrikkert en aptamer-aktivert microdevice og indikerte også at fangsteffektiviteten av CTCs vil stige gradvis, men renheten hadde en oppadgående trend når kanalen dybden økes.
A) Forholdet mellom kanalen høyde og fangsteffektivitet : Registreringseffektiviteten effektiviteten~~POS=HEADCOMP ble beregnet ved å dividere antall målcellene fanges opp av antallet av målcellene som føres inn i enheten. B) Forholdet mellom kanalhøyde og celle renhet: Renheten av celler fanges ble bestemt ved å dele antall målcellene fanges opp av den del av de totale celler fanges opp. Strømningshastigheten var 0,5 ml /time til A) og B). C) Forhold mellom strømningshastighet og fangsteffektivitet: Registreringseffektiviteten ble beregnet ved å dividere antall målcellene fanges opp av antallet av målcellene som føres inn i enheten. Kanalen høyde var 0,5 mikrometer. Feilstolpene representerer en standardavviket 4 gjentatte eksperimenter. D) Gjenvinning av kjente mengder av tilsatte HT-29 celler fra helblod. Regresjonsanalyse av observerte tumorceller antall forhold forventet antall tumorceller produsert en helning på 0,986 og en korrelasjonskoeffisient (r
2) av 1.
På den annen side har vi også undersøkt forholdet mellom strømningshastighet og CTC fangsteffektivitet. Som vist i figur 2c, ved en strømningshastighet i området fra 0,2 og 0,5 ml /h, har utløser effektivitet ikke endres selvsagt. Men fra kursen over 0,5 ml /t, fangst effektivitet falt dramatisk. Fangsteffektiviteten reduseres med økningen av strømningshastigheten antagelig på grunn av et større trykk ved en høyere strømningshastighet. Noen andre studier [24] – [26] også påpekt at cellen fangstutbyttet var omvendt proporsjonal med strømningshastigheten av blod. Derfor, med tanke på behandlingstiden for prøvene pumpes inn i enheten og fangsteffektivitet, valgte 0,5 ml /time som den beste parameter for deteksjon, ved hvilket strømningshastighet tilstrekkelig gjennomstrømning kunne observeres.
Derfor brukte vi den optimale kanalen høyde på 5 mikrometer og strømningshastighet på 0,5 ml /t for CTC deteksjon, og disse forsøksbetingelser ble brukt for alle etterfølgende eksperimenter.
Recovery av Tumor Cell Detection
for å bestemme følsomhet av tumorcelledeteksjon, HT-29 celler ved forskjellige kjente tall, ble tilsatt i 5 ml blodprøver fra hver frisk donor. Numrene på piggete celler var henholdsvis 5, 9, 51, 102, 500 og 998. Figur 2d viste det forventede antall av HT-29 celler tilsatt i den friske donorprøvene plottet mot den faktiske antall HT-29 celler observert i prøvene. Regresjonsanalyse av observerte tumorceller antall forhold forventet antall tumorceller produsert en helning på 0,986 og en korrelasjonskoeffisient (r
2) fra 1. Den midlere prosentandel av HT-29 som ble gjenvunnet var 94% og utvinningsgraden ved forskjellige cellekonsentrasjoner var alt over 80% (Tabell 1, Tabell S1). Vi validert også utvinningsgraden på tre lunge kreft cellelinjer inkludert A549, SK-MES-1 og H446, som alle var høyere enn 90% (data ikke vist).
CTC Påvisning av Rektal kreftpasienter med ulike stadier
CTC tellinger av 60 endetarmskreftpasienter med ulike stadier og 30 friske personer ble oppdaget og analysert i hver 5 ml fullblod. Figur 3 viste fanget CTCs av en typisk pasient med endetarmskreft i microfluidic enhet
A /B: CTCs flekker;. C /D: normale blodceller farging. A) positiv CK flekker i CTCs; B) positiv DAPI flekker i CTCs; C) positiv CD45-farging i normale blodceller; D) positiv DAPI farging i normale blodceller.
Som vist i figur 4, kan positive celler observeres i 3 av 30 friske mennesker, men ingen av dem hadde mer enn 3-positive celler per prøve . Disse resultatene var like med de i tidligere studier som viser at opp til tre CTCs ble påvist i en liten populasjon av friske donorer eller ikke-ondartede pasienter [27] – [28]. Grunnen til slike «falske positive» resultater er ikke kjent ennå, men antagelig på grunn av flere årsaker som følger: (a) forurensning av epitelceller i blodprøver på grunn av noen uriktig behandling som upassende blodprøvetaking; (B) unøyaktig dom i identifisering av CTCs av forskere; (C) nærvær av avvikende hematologisk celler som uttrykker epithelial antigen i blodprøver; (D) mulige kreftpasienter som ikke kan tidlig diagnostisert ved rutinemessige kliniske teknikker.
Boksplottet viser median, nedre og øvre kvartil (25, 75 percentil). Datapunkter som utenfor den 10. og 90th persentiler er vist som uteliggere.
Selv om tumor markører som serum CEA er mye brukt for diagnostisering og oppfølging av pasienter med gastrointestinal kreft, deres mangel på sensitivitet forblir uløst. Konvensjonelle bildediagnostikk og tumormarkører er ofte unøyaktige for kreftdiagnose og overvåkning av terapi responser, noe som resulterer i en forsinkelse i å bedømme sykdomsprogresjon tidlig. I denne studien kunne CTCs påvises i alle 60 endetarmskreftpasienter med CTC teller var alt over 3 celler per prøve. CTC tellinger av endetarmskreftpasienter var betydelig høyere enn hos friske forsøkspersoner (167,33 ± 212.76 vs. 0,17 ± 0,59, P 0,05). I tillegg kan pasienter med fjernmetastaser hadde betydelig høyere CTC nivåer enn pasienter med Stage II-III eller de med lokalt tilbakefall (385,30 ± 245,86 vs. 39,40 ± 19,23 vs. 115,20 ± 69,15, P 0,05). Videre CTC tellinger av lokale vendende pasienter var også signifikant høyere enn de med trinn II-III (P 0,05). Disse resultatene indikerte at CTC mengde korreleres rimelig godt med tumorbelastning og alvorlighetsgraden av pasientene med forskjellige stadier. Derfor CTC kan være en lovende biomarkør for å gjøre opp insuffisiens av konvensjonelle kliniske deteksjons modaliteter. Sastre et al. [29] viste en nær sammenheng mellom CTC teller og ulike kliniske stadier for pasienter med kolorektal kreft, som var lik våre resultater. Cohen et al. [30] viste at CTC teller før behandling og ved senere tidspunkt var uavhengige prognostiske faktorer for progresjonsfri overlevelse og total overlevelse. Allen-Mersh et al. [31] viste at CTC teller innen 24 timer etter primær kolorektal kreft reseksjon var en sterk prediktor for kolorektal kreft tilbakefall. Påvisningen av CTCs kan også anvendes i målrettet genterapi. Yen et al. [32] fant at påvisning av Kras mutasjonsstatus i CTCs hadde potensial for klinisk anvendelse i valg av metastatisk kolorektalcancer mest sannsynlig har nytte av cetuximab terapi. Dermed kan påvisning av CTCs har et bredt spekter anvendelse i de kliniske innstillinger som diagnostisering av kreft sykdommer, overvåking av behandlingstiltak, prognose evaluering og selv beslutningsprosessen for individualisert behandling. Videre analyser inkludert rollen CTCs på prediksjon og evaluering av kreftpasienter langsiktige overlevelse ved hjelp av vårt microfluidic enheten vil bli gjennomført i nær fremtid.
Sammenligning microfluidic Device vs. EpCAM-basert metode
Anti-EpCAM magnetiske kuler basert metode er i dag en av de mest brukte teknologiene for CTC deteksjon [9] – [10]. Derfor sammenlignet vi resultatene av vår microdevice for telling av tumorceller mot EpCAM baserte berikelse metode. For det første ble HT-29-celler med kjente nummer tilsatt i blodprøver fra friske donorer, og deretter hver prøve ble delt i to dubletter, en for vår enhet og en annen for EpCAM basert metode. Utvinningsgraden av disse to metodene ble sammenlignet og analysert. Som vist i tabell 1, utvinningsgraden av tumorceller ved hjelp av denne microdevice var over 80% ved hver konsentrasjon av tumorceller, mens utvinningsgraden ved å EpCAM-baserte metode var relativt lavere, som strekker seg fra 36% til 81% (P 0,05). I tillegg kunne vi ikke finne signifikant korrelasjon mellom utvinningsgrad på microfluidic enheten og at av EpCAM basert metode (korrelasjon effektiv var 0,07, P . 0,05). Deretter vi også sammenlignet resultatene for disse to metoder under anvendelse av pasienters blodprøver og resultatene ble vist i tabell 2. Vi samlet og behandlet blodprøver av 60 pasienter med rektal kreft, og hver prøve ble delt i to stykker for tumorcellene påvisning ved hjelp av disse to metoder (Tabell S2). For endetarmskreftpasienter med ulike stadier, CTC teller oppdaget av microdevice var betydelig høyere enn de av EpCAM basert metode (P 0,05). Antallet av isolerte CTCs varierte fra 0 til 100 versus 0 til 12 for (microdevice vs. EpCAM-baserte) per prøve for pasienter med trinn II-III (gjennomsnitt ± SD, 39 ± 19 ± 4 vs 3), 4-210 vs . 3-31 for tilbakevendende pasienter (115 ± 69 vs. 12 ± 9) og 47-980 vs. 5-55 for metastatiske pasienter (385 ± 246 vs. 24 ± 15). For EpCAM-baserte metode, CTC teller av 38 (63%) av pasientene gikk fra 0 til 10, mens det i bare en pasient (2%) var mer enn 50. I motsetning til dette, for microdevice, CTC tellinger av 3 (5 %) pasienter varierte 0-10 mens de i 34 (57%) pasienter var mer enn 50. forskjellen mellom disse to metodene var spesielt tydelig i 30 rektale kreftpasienter med Trinn II-III: De positive forekomst av prøver med mer enn 3 CTCs per 5 ml blod ved bruk av microdevice var 100% (30/30), mens bare 47% (14/30) positive prøver kan bli observert av EpCAM basert metode.
EpCAM- magnetiske kuler basert metode er i dag en av de mest utbredte metoder for isolering av CTCs. Imidlertid er denne metode avhengig av EpCAM ekspresjon på mål-kreftceller. Selv om EpCAM-antigen kan bli funnet i de fleste av epiteliale tumorer, svak eller negativ EpCAM uttrykk er angitt, som sannsynligvis er forbundet med fenomenet EMT [33] – [34]. Mange faktorer som kjemoterapi kan sannsynligvis forårsake EMT, noe som kan påvirke fangsteffektiviteten av tumorceller. I vårt studium, for å minimere innvirkningen av EMT, benyttet vi en størrelse basert metode for å detektere CTCs stedet for EpCAM-avhengige en. Derfor teoretisk, flere kreftceller inkludert både EpCAM utfoldelse positive og negative kan bli fanget av vår størrelse baserte microdevice. Denne hypotesen er i samsvar med våre resultater ovenfor: Ikke bare i prøver med tumorceller tilsatt i frisk blod, ble flere CTCs isolert av vår microdevice, men lignende resultater ble validert i prøver av endetarmskreftpasienter også. Andre tidligere studier [35] -. [36], som sammenlignet størrelse basert og EpCAM-baserte metode, rapporterte tilsvarende resultater og viste at en andel av celler isolert ved størrelsesbasert tilnærming manglet epitel-karakteristikker
På
