Abstract
førstelinjebehandling av pasienter med kastrering resistent prostatakreft (CRPC) innebærer primært administrering av docetaxel kjemoterapi. Dessverre, motstand mot docetaxel terapi er en ultimate forekomst. Endringer i androgen reseptor (AR) uttrykk og signalering er assosiert mekanismene bak motstand mot docetaxel behandling i CRPC. Varmesjokkprotein 90 (HSP90) er en molekyl anstand, som regulerer aktiveringen, modning og stabilitet i kritiske signale proteiner involvert i prostata cancer, inkludert AR. Denne kunnskapen og nylige fremskritt i forbindelse design og utvikling har fremhevet HSP90 som en attraktiv terapeutisk mål for behandling av CRPC. Vi har nylig rapporterte utviklingen av en MYC-Cap kastrering resistente (MYC-cap /CR) transplantasjon tumormodell, som uttrykker forsterket vill type AR. Innenfor rapporterer vi at en andre generasjon HSP90 inhibitor, NVP-AUY922 hemmer cellevekst og betydelig induserer celledød i MYC-cap /CR og PTEN-cap /ce2 cellelinjer. NVP-AUY922 indusert proteasome nedbrytning av AR, men interessant ikke krever tap av AR protein å hemme AR transkripsjonen aktivitet. Videre økte NVP-AUY922 docetaxel toksisitet i MYC-cap /CR og PTEN-cap /ce2 cellelinjer
in vitro
. Endelig NVP-AUY922 /docetaxel kombinasjonsterapi i mus med MYC-cap /CR svulster ført til større anti-tumor aktivitet sammenlignet med enkel behandling. Denne studien viser at NVP-AUY922 utløser potent aktivitet mot AR signalering og forsterker kjemoterapi respons i en musemodell for CRPC, og gir begrunnelsen for den videre kliniske utviklingen av HSP90-hemmere i kliniske studier for behandling av CRPC pasienter.
Citation : Ku S, Lasorsa E, Adelaiye R, Ramakrishnan S, Ellis L, Pili R (2014) Hemming av HSP90 forsterker Docetaxel Therapy i Castrate resistent prostatakreft. PLoS ONE 9 (7): e103680. doi: 10,1371 /journal.pone.0103680
Redaktør: Bandana Chatterjee, University of Texas Health Science Center, USA
mottatt: 16 juli 2013; Godkjent: 06.07.2014; Publisert: 29.07.2014
Copyright: © 2014 Ku et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble delvis støttet av det amerikanske forsvarsdepartementet – PC094159 (LE) og National Cancer Institute – P50 CA58236 (RP). Finansiører har ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne ønsker å erklære følgende konflikter: Roberto Pili har vært en betalt konsulent og mottatt forskningsmidler fra Novartis. Som sådan, ikke dette endre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Castrate resistent prostatakreft (CRPC) er en uhelbredelig og aggressiv prostatakreft (PCA) fenotype. I flere år har det primære behandlingsalternativet for CRPC vært begrenset til docetaxel kjemoterapi, som strekker overlevelse selv for en begrenset tid [1]. Mens behandlingen av CRPC har vært ekstremt utfordrende, har de siste 2 årene har sett en dramatisk endring i behandlingsalternativer for denne sykdommen. Den andre linjen cabazitaxel [2], den immunoterapi sipuluecel-T [3], androgen syntese inhibitor abirateron acetat [4], AR antagonist enzalutamide [5], og radium-223 [6] har alle fått ny FDA-godkjenning for behandling av CRPC. Selv om disse nye behandlingsformer har utvidet behandlinger for pasienter, forblir bærekraftig undertrykkelse av CRPC veksten fortsatt en hovedutfordring og nye behandlingsstrategier er fortsatt nødvendig.
Fordi docetaxel er en effektiv behandling, gjenstår det fortsatt en kritisk komponent for førstelinjebehandling strategi CRPC. Overvinne både kjøpt og iboende motstand mot docetaxel har vært en stor klinisk utfordring og bedre behandlingsresultater for pasienter med docetaxel motstand er av høy prioritet. Med en større forståelse av de underliggende mekanismene for resistens, er nye terapeutiske muligheter dukker opp. Dette kan skape muligheter for monoterapi behandling av docetaxel motstand CRPC eller potensielt gjensensitiv CRPC pasienter til docetaxel behandling med nye kombinasjonsstrategier.
Målrette androgen-AR aksen med abirateronacetat [4] og enzalutamide [5], som monoterapi hos pasienter med docetaxel motstandsdyktig CRPC har vist klinisk nytte. Mens direkte målretting av AR handling er primært ønsket, er indirekte målretting, via hemming av AR assosierte proteiner en attraktiv tilnærming. Den molekylære anstand HSP90 er et medlem av varmesjokkproteinfamilie [7] og funnet å være overuttrykt i flere kreftformer, inkludert PCa. HSP90 har over 200 dokumenterte klienter, inkludert AR, hvor HSP90 hindrer proteasome degradering og stabiliserer AR konformasjon klar for ligandaktivering [7]. Fordi HSP90 samhandler med flere klient proteiner, er det oppleves at hemming av HSP90 kan forsterke en større katastrofal anti-tumor effekt i forhold til mer direkte målrettet terapi. I pre-kliniske studier, HSP90 inhibering alene [8], [9], eller mer nylig, i kombinasjon [10], [11] lovende resultater ved behandling av PCA-celler. Dessverre gjorde første generasjon HSP90-hemmere ikke medføre betydelig effekt i kliniske studier [12] – [14]. Disse første HSP90-inhibitorer kjent som geldanamycin analoger, 17-allylamino-17 demethoxygeldanamycin (17-AAG) og 17- (dimethylaminotheyl-amino) -17-demethoxygeldanamycin (17-DMAG) ble tilskrevet svikte i klinikken på grunn av dårlig oppløselighet og farmakokinetikk , levertoksisitet, mottakelighet for P-glykoprotein utstrømning og mangel på metabolismen av NQO1 /DT-diaforase enzymer [15].
NVP-AUY922 (AUY922) er en resorcinlyic isoksazoi amid (fig. 1A) vist seg å være en potent inhibitor av HSP90 [16]. AUY922 er en ikke-geldanamycin analog, og utviser ikke begrensninger i geldanamycin analoger, derfor gjør denne agenten mer lovende for klinisk testing. AUY922 medierer dens virkning ved å binde den ATPase domenet til HSP90 N-terminus for å inhibere anstand funksjon av HSP90. Denne virkning fører til proteosomal nedbrytning av mange former for kreft aktuelle klient-proteiner [16], inkludert AR [17]. AUY922 har vist anti-tumor-aktivitet i en rekke av fast tumor prekliniske musemodeller, inkludert PC3 prostatakreft celle og xenotransplantater [16], [18]. I det siste har nye generasjon HSP90-inhibitorer, inkludert AUY922 blitt rapportert å oppnå biologiske responser i prostatakreftcellelinjer og humane prostata cancer vev sammenlignet med den geldanamycin analoge 17-AAG [17]. Fase I og II studier i hematologisk kreftsykdom og solide tumorer, inkludert brystkreft og multippelt myelom, er pågående med AUY922.
(A) Kjemisk struktur av NVP-AUY922. (B) kastrere resistente (MYC-cap /CR og PTEN-cap /CE2) cellelinjer ble behandlet med angitte konsentrasjoner av AUY922 for 48t. Adherente celler ble fiksert med 70% EtOH. Cellevekst ble bestemt ved farging av fikserte celler med krystallfiolett og måling av absorbansen ved 570 nm. Hvert punkt ble normalisert til den ubehandlede kontroll (0) og representeres av 3 uavhengige eksperimenter, gjennomsnitt ± SE. (C) MYC-cap /CR og PTEN-cap /ce2 celler ble behandlet med angitte konsentrasjoner av AUY922 for 48t. Adherente og ikke-adherente celler ble samlet opp og vasket i 1 x PBS. Celler ble inkubert med propidiumjodid og celledød ble bestemt ved flow-cytometri. Hvert punkt representerer gjennomsnitt ± SE av 3 uavhengige eksperimenter. * Angir p 0,05 sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe (0), ved to-halet t-test
Formålet med denne studien var å teste evnen til AUY922 til å antagonisere den transkripsjonelle og /eller protein. stabilitet av AR i kastrering bestandig MYC-cap /CR og PTEN-cap /ce2 prostatakreft cellelinjer samt en transplantasjon musemodell nylig utviklet i vårt laboratorium [19], [20]. Videre ønsket vi å undersøke antitumor og terapeutisk effekt av AUY922 som monoterapi og i kombinasjon med docetaxel kjemoterapi.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Instituttet Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Roswell Park Cancer Institute (RPCI) godkjent alle muse protokollene som brukes i denne studien. Vår godkjenning /protokoll ID er 1137M.
Cell kultur og reagenser
Isolering av en kastrering bestandig MYC-Cap cellelinje.
Den MYC-cap /CR cellelinjen var generert fra vår tidligere rapportert MYC-Cap kastrering motstandsdyktig transplantasjon tumor modell [19]. MYC-CAP /CR tumorstykker (~4 mm
2) ble plassert i en 6 brønners kulturplate og fjernes etter å ha vært dyrket i 24 timer i DMEM supplert med høy glukose medium (10% FBS, 1% penicillin /streptomycin). Heftende celler var en blandet befolkning av MYC-Cap /CR tumorceller og fibroblaster. Disse cellene ble dyrket til tilnærmet 80% sammenflytende. Seriell aging av disse heterogene kulturene ble utført, inntil en homogen monolag av MYC-CAP /CR-celler var til stede. MYC-CAP /CR-cellelinjer ble deretter dyrket i DMEM-medium (Gibco) supplementert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C, 5% CO
2. PTEN-CAP /cE2cE2 celler var en velvillig gave fra Dr. Roy-Burman (University of California, Los Angeles) og dyrket i DMEM-medium (Gibco) supplementert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C, 5% CO
2. PC3-celler ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC) og holdt i RPMI 1640 medium (Gibco) supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C, 5% CO
2.
in vitro
eksperimenter, NVP-AUY922 (Novartis) ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) for fremstilling av stamløsninger (10 mM). Den syntetiske androgen, methyltrienolone (R1881, Sigma-Aldrich) ble oppløst i etanol for fremstilling av stamløsninger (10 mM). Den proteasominhibitor, MG132 (Sigma-Aldrich) ble oppløst i DMSO for fremstilling av stamløsninger (10 mM). Oversettelsen inhibitor, cykloheksimid (Sigma-Aldrich) ble oppløst i etanol for fremstilling av stamoppløsninger (5 mg /ml). Antistoffer brukes for immunoblotting og /eller immunhistokjemi (IHC) var anti-androgen reseptor (Santa Cruz), GAPDH (Cell Signaling), c-MYC (Epitomics) og aktivert caspase 3 (Cell Signaling). For
in vivo-studier
, docetaxel ble oppnådd fra Roswell Park Cancer Institute apotek og fortynnet til 1 mg /ml i PBS før administrering til dyr. NVP-AUY922 ble oppløst i 5% dekstrose i destillert vann (D5W) i en konsentrasjon på 4 mg /ml.
cellevekst og celledød analyser
MYC-cap /CR eller Pten- CAP /ce2 celler (4 × 10
4 /ml) ble forlatt til å følge over natten i 24 brønners plater (BD Biosciences) og inkuberes med angitte konsentrasjoner av NVP-AUY922 for 24 og 48 timer. Celleveksten ble målt ved fiksering og farging av adherente celler med 10% metanol i krystallfiolett i 30 min. Fargede celler ble gjort oppløselig i absolutt metanol, og absorbans ble registrert ved en emisjons lengde på 570 nm. Livskraftig (celledød) ble målt ved inkubasjon tilhenger og ikke-heftende celler med en mikrogram /ml propidiumjodid (Sigma-Aldrich) opptak og kvantifisert med en FACS Caliber strømningscytometer.
Western blot
MYC-cap /CR eller PTEN-cap /ce2 cellene ble vasket i PBS og lysert i RIPA buffer (Sigma-Aldrich) inneholder 1 × protease og fosfatase hemmere (Sigma-Aldrich). Like mengder protein ble separert ved elektroforese ved å bruke 4-15% gradient SDS-PAGE-geler (Bio-Rad), og proteinet ble overført til nitrocellulosemembraner (Biometra). Sekundære HRP konjugerte antistoffer var fra Dako. Deteksjon ble utført med Chemiluminescence reagenser (PerkinElmer).
Androgen reseptor transkripsjonsaktivitet
androgen respons status av MYC-Cap /CR-celler ble bestemt ved bruk av en kommersielt tilgjengelig lentiviral baserte luciferase rapporterte kit (Cignal Lenti AR Reporter (Luc) kit; SABioscience) i henhold til produsentens anvisninger
kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert ved TRIzol (Invitrogen) i henhold til produsentens anvisninger.. Ett mikrogram RNA ble brukt til å utføre cDNA syntese av iScript cDNA syntese kit (Bio-Rad). En mikroliter av cDNA syntese reaksjon ble så underkastet PCR-amplifisering ved å bruke iQ SYBR grønn kit (Bio-Rad). PCR-signaler ble registrert og analysert ved hjelp av Bio-Rad CFX Connect real-time PCR deteksjon system. Sekvensene til primerne er: FKBP5 fremover, 5 «GCCGACTGTGTGTGTAATGC 3», og omvendt, 5 «CACAATACGCACTTGGGAGA 3»; GAPDH fremover, 5 «GTCTTCACCACCATGGAGAAG 3», og omvendt, 5’CAAAGTTGTCATGGATGACCTTGG 3 «. ΔΔCt verdier ble beregnet og benyttet for å bestemme fold endringer av mRNA.
Histologi /Immunohistochemistry
Mus ble ofret av CO
2 kvelning ved definerte tidspunkter. Tumorvev ble fiksert i 10% bufret formalin over natten, etterfulgt av ytterligere 24 timer i 70% etanol. For antigen gjenfinning, ble slides kokt i 10 minutter i 10 mM natriumcitrat pH 6 løsning for alle antistoffer. ImmPRESS deteksjonssystem (Vector Laboratories) ble anvendt for påvisning av alle primære antistoffer. Farging ble visualisert ved hjelp av 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) (Sigma, St. Louis, MO, FAST 3,3′-Diamino benzidin) og lysbilder ble kontra med hematoksylin. For kvantifisering av IHC-farging representative bilder (3-6) ble oppnådd ved anvendelse av et Zeiss lys mikroskop (Zeiss). Positiv atom farging for c-MYC og aktivert caspase 3 ble kvantifisert ved Aperio ImageScope (v11.1.2.760).
In vivo
dyrestudier
Instituttet Animal Care og bruk komité ved Roswell Park Cancer Institute godkjent alle muse protokollene som brukes i denne studien. Mus ble plassert i et dyr anlegget opprettholdes på en 12-timers lys /mørke-syklus, ved en konstant temperatur (22 ± 2 ° C) og relativ fuktighet (55 ± 15%). Vann fra springen og mat var tilgjengelig
ad libitum
. FVB hannmus (4-6 uker gamle) ble anskaffet fra NCI Frederick (Maryland, USA). SCID-mus ble kjøpt fra en i huset koloni opprettholdes ved Roswell Park Cancer Institute. Alle mus ble kirurgisk kastrert opp til 10 dager før tumorinokulasjon. Kirurgisk kastrering ble utført ved å barbere operasjonsstedet. Et snitt ble gjort i pungen og i tunica av testiklene med saks. Testis, sædlederen og festet testiklene fett puten ble fjernet ved snittstedet. Snittet området vil bli stengt med Agraff. Den LuCaP23 androgen uavhengig (AI) xenograft modell [21] var en generøs gave fra Dr Robert Vessella (University of Washington, Seattle WA). Denne modellen ble opprettholdt ved serieaging av svulstvevet til forhånds kastrerte SCID hannmus.
Therapy studier.
Pre-kastrerte hann FVB hannmus ble inokulert med MYC-cap /CR celler ( 1 × 10
6) suspendert i PBS ved subkutan injeksjon. Likeledes ble pre-kastrerte hann SCID-mus inokulert med PC3 (1 × 10
6) celler suspendert i PBS ved subkutan injeksjon, eller implantert med en LuCaP 23 AI svulst piece (4 mm
2) subkutant. For docetaxel enkelt behandlingsstudier, svulst bærende mus fikk docetaxel terapi (10-50 mg /kg én gang ukentlig, intraperitoneal injeksjon). For kombinasjonsstudier, tumorbærende dyr mottatt kjøretøy (D5W), docetaxel (10 mg /kg, en gang ukentlig, intraperitoneal injeksjon), NVP-AUY922 (40 mg /kg, 5 dager på 2 fridager, intraperitoneal injeksjon) eller kombinasjon. I alle studier ble mus veiet ukentlig for å overvåke for toksisitet. Tumorvekst ble vurdert ved serie caliper målinger to ganger ukentlig.
Statistical Analysis
Data vises som gjennomsnitt ± SE. Forskjeller ble bestemt ved hjelp av én eller to-veis ANOVA og to-tailed paret t tester der det er angitt ved hjelp GraphPad Prism programvare. P-verdier mindre enn 0,05 ble tildelt statistisk signifikant.
Resultater
Response av kastrering resistente prostata kreft celler til AUY922 behandling
in vitro
MYC-cap kastrere resistente (MYC-cap /CR) og PTEN-Cap kastrat resistente (PTEN-cap /CE2) celler ble eksponert i 48 timer til økende konsentrasjoner av AUY922. Som vist på fig. 1B, lave nanomolare konsentrasjoner av AUY922 var tilstrekkelig til å hemme veksten av MYC-cap /CR og PTEN-cap /ce2 celler. Videre AUY922 induserte en doseavhengig økning i celledød av MYC-cap /CR og PTEN-cap /ce2 celler med konsentrasjoner på 50-500 nM basert på PI opptak analyse (p 0,05, Fig. 1C).
AUY922 induserer proteasome nedbrytning av AR og hemmer AR transkripsjonen aktivitet i MYC-cap /CR og PTEN-cap /cE2Pten-cap /ce2 celler
det er dokumentert at HSP90 hemming resulterer ofte i proteasome degradering av sin klient proteiner [16]. Vi har derfor ønsket å bestemme AR proteinstabilitet og /eller transkripsjonen aktivitet ble dempet ved AUY922 i våre kastrering resistente modeller. MYC-CAP /CR og PTEN-CAP /CE2 celler behandlet med økende konsentrasjoner av AUY922 i 48 timer viste en doseavhengig tap av AR-protein, mest merkbart ved konsentrasjoner på 100 nM og 500 nM (fig. 2A og 2C). Samtidig behandling med AUY922 og proteasominhibitor, MG132 (0,5 mm), bekreftet at AUY922 mediert tap av AR protein var proteasome degradering (Fig. 2A). Effekten av AUY922 på AR transkripsjonen aktivitet ble vurdert ved hjelp av MYC-cap /CR celler med stabil uttrykk for en luciferase reporter drevet av androgen responselementer (ARE-Luc). MYC-cap /CR /ER-Luc celler ble inkubert med økende konsentrasjoner av AUY922 og 1 nM R1881 samtidig over natten eller forbehandlet med 1 nM R1881 for 4 timer etterfulgt av økende konsentrasjoner av AUY922 over natten. På grunn av den konstitutive ekspresjon av luciferase i PTEN-CAP /CE2-celler, bedømmes vi mRNA ekspresjon nivået av AR-genet nedstrøms, FKBP5, for å undersøke effekten av AUY922 på AR transkripsjonen aktivitet. Våre resultater viser at AUY922 inhiberer AR transkripsjonen aktivitet i det lave nanomolare konsentrasjoner i både kastrering resistente cellelinjer (Fig. 2B og 2C). Videre indikerer disse resultater også at AR proteinnedbrytning ikke er nødvendig for å antagonisere AUY922 AR transkripsjon. I tillegg benyttet vi cycloheximide å blokkere nye proteinsyntesen til videre foreslå at lav nanomolar AUY922 er i stand til å redusere AR transkripsjonen aktivitet uten at det påvirker AR proteinnivå (Fig. 2D).
(A) MYC-Cap kastrering motstandsdyktig celle ble behandlet i 48 timer med økende konsentrasjoner av AUY922 eller økende konsentrasjoner av AUY922 samtidig med proteasominhibitor MG132 [0,5 uM]. Ekspresjon av AR-protein ble undersøkt ved western blot. (B) MYC-CAP /CR cellelinjer med stabil transfeksjon av en AR-reporter plasmid (ER-Luc) ble inkubert i utladet androgen celledyrkningsbetingelser i 6 timer. Celler ble behandlet samtidig med 1 nM R1881 og indikerte konsentrasjoner av AUY922 over natten eller forbehandlet med 1 nM R1881 i 4 timer før tilsetning av de angitte konsentrasjoner av AUY992 Luminescence intensitet ble målt og kvantifisert. Kolonner representerer 3 uavhengige eksperimenter; gjennomsnitt ± SE. (C) PTEN-CAP /CE2-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av AUY922 i 48 timer. Ekspresjon av AR-protein ble undersøkt ved western blot. Transkripsjonen aktivitet av AR ble utført ved å måle FKBP5 mRNA uttrykk nivå. Celler ble inkubert i androgen ferdigproduserte celledyrkningsbetingelser i 6 timer, og deretter behandlet samtidig med 1 nM R1881 og indikerte konsentrasjoner av AUY922 over natten. Eksperimenter representerer 3 uavhengige eksperimenter, gjennomsnitt ± SE. (D) MYC-cap /CR og PTEN-cap /ce2 celler ble behandlet samtidig med 5 mikrogram /ml cycloheximide og økende konsentrasjoner av AUY922. Ekspresjon av AR-protein ble undersøkt ved western blot. GAPDH tjente som protein lasting kontroll. Den densitometry ble utført av bilde j analyse. Tallene ble vist under bandene i forhold til kontrollcellene.
Co-behandling av AUY922 og docetaxel øker celledød av MYC-cap /CR og PTEN-cap /ce2 celler
Vi først undersøkt følsomheten av MYC-cap /CR og PTEN-cap /ce2 celler til veksthemming evner av docetaxel. Medikamentell behandling oppviste evnen til å inhibere celle vekst ved lave nanomolare konsentrasjoner i begge cellelinjer (Fig. 3A-B).
Kastrere resistente cellelinjer ble behandlet med den angitte konsentrasjon av docetaxel og /eller AUY922 i 48 timer. MYC-cap /CR (A) og PTEN-CAP /CE2 (B) cellelinjer ble behandlet med angitte konsentrasjoner av docetaxel for 48 timer. Adherente celler ble fiksert med 70% EtOH. Cellevekst ble bestemt ved farging av fikserte celler med krystallfiolett og måling av absorbansen ved 570 nm. MYC-cap /CR (C) og PTEN-CAP /CE2 (D) celler ble behandlet med angitte konsentrasjoner av AUY922 og /eller docetaxel i 48 timer. Celler ble trypinized og vasket i 1 x PBS og inkubert med propidiumjodid (PI). Prosentandeler av døde celler (PI positive celler) ble bestemt ved flow-cytometri. Kolonnene representerer gjennomsnitt ± SE, * angir signifikant større i kombinasjonen, sammenlignet med behandling med hvert medikament alene (p = 0,03 som bestemt ved en-veis ANOVA).
Vi valgte å behandle MYC-Cap /CR-celler i 48 timer med 10 nM AUY922 (en konsentrasjon hvor AR-protein ikke degraderes men AR transkripsjonen aktivitet inhiberes) og 100 nM AUY922 (en konsentrasjon hvor AR-protein degraderes og AR transkripsjonen aktivitet inhiberes) med 500 nM docetaxel. Fig. 3C viser at kombinasjonen av 10 nM AUY922 med docetaxel øker betydelig celledød i forhold til behandling med enten stoffet alene. Kombinasjonen av 100 nM AUY922 med docetaxel fortsatt øket celledreping i forhold til hver enkelt behandling selv om det ikke var signifikant. Videre behandlet vi PTEN-cap /ce2 celler med 30 og 40 nM AUY922 (konsentrasjoner av AUY922 som ikke drastisk påvirke AR protein uttrykk) med 500 nM docetaxel, viser at disse kombinasjonsbehandlinger AUY922 og docetaxel er i stand til å indusere økt celledød i forhold til hver enkelt behandling (fig. 3D). Disse dataene indikerer at HSP90 er potensielt involvert i transkripsjonen aktivitet av AR og at forstyrre AR interaksjon med HSP90 via sin hemming motvirker betydelig AR aktivitet i MYC-cap /CR og PTEN-cap /ce2 cellene uavhengig av AR protein uttrykk, noe som åpner for større induksjon av celledød i kombinasjon med docetaxel.
MYC-cap /CR svulster er motstandsdyktig mot docetakselbehandling
in vivo
for å vurdere muligheten av docetaxel anti-tumor aktivitet
in vivo
mot MYC-cap /CR svulster, kastrerte FVB mus med MYC-cap /CR svulster ble behandlet med varierende doser av docetaxel. Som kontroller vi behandlet også kastrerte SCID mus med menneskelig xenografttumorer, LuCaP23.1 AI og PC3, som er kjent for å svare på docetakselbehandling
in vivo
. Fig. 4B og 4C viser at LuCaP23.1 AI og PC3 svulster var følsomme for docetaxel behandling. Videre har hver dose ikke genererer signifikant toksisitet under behandlingen (fig. 4E og 4F). I motsetning til dette, MYC-lokket /CR tumorene var resistent mot alle doser av docetaxel behandling (Fig. 4A), og toksisitet ble indikert i mus behandlet med 50 mg /kg docetaxel (fig. 4D).
(A ) MYC-cap /CR celler (5 × 10
6), (B) LuCaP23.1 AI svulst del (~ 5 mm
2) og (C) PC3 celler (5 × 10
6) ble injisert eller plassert subkutant i flanken av kastrerte hann FVB (MYC-cap /CR) eller SCID (LuCaP23.1 AI og PC3) mus. Behandlingen ble igangsatt da tumorer målt ca 50 mm
2. Docetaxel ble mottatt fra apoteket ved RPCI som en vandig oppløsning (20 mg /ml) og fortynnet til 1 mg /ml i 1 x PBS daglig. Mus ble behandlet med docetaxel doser på 10, 25 og 50 mg /kg ukentlig av intra-peritoneal (i.p.) injeksjon for varighet på 2 sykluser (MYC-cap /CR) eller 3 sykluser (LuCaP23.1 AI og PC3). Tumorvekst ble overvåket av serie caliper målinger bi-ukentlig. Tumorstørrelse ble beregnet ved L x W. Alle behandlingsgrupper bestod av 3-4 mus. Hver behandlingsgruppe var normalisert til forbehandling målingene og konvertert til prosent tumorvekst. Hvert punkt representerer gjennomsnittlig tumorstørrelse ± SE. (D-F) Alle mus ble veiet 2 ganger /uke for å overvåke docetaxel toksisitet. Toksisitet ble ansett for å ha oppstått når musekroppsvekten ble redusert ≥20%. Hver kolonne er representert med 3-4 individuelle mus /behandling og representert som prosent kroppsvekt endring i forhold til pre-behandling målinger, gjennomsnitt ± SE.
AUY922 avtar AR uttrykk i MYC-cap /CR svulster og kombinerer med docetaxel å øke terapeutisk effekt
Den anti-tumor aktivitet av AUY922 og docetaxel
in vivo
ble undersøkt ved behandling av kastrerte FVB mus med MYC-cap /CR svulster. Tumor bærende mus ble behandlet med kjøretøy (D5W; 5d på 2d av), AUY922 (40 mg /kg ip: 5d på 2d av), docetaxel (10 mg /kg ip: en gang ukentlig) eller kombinasjon for 2 sykluser (14 dager) . Ingen signifikant toksisitet ble observert i alle behandlingsgrupper slik som vist med kroppsvektmålingene (Fig. 5B). Som vist i fig. 5A, sammenlignet med vehikkel behandling, en to ukers behandling med AUY922 eller docetaxel alene hadde ingen signifikant redusere tumorvekst. Spesielt kombinasjonen av AUY922 med docetaxel terapi betydelig avskaffet veksten av MYC-Cap /CR svulster i forhold til hver enkelt behandling (AUY922, p = 0,002; docetaxel, p = 0,009). Videre histokjemisk analyse av behandlet MYC-cap /CR svulstvev for AR uttrykk avslørte at både kjøretøy og docetaxel behandlede tumorer vises sterk AR nukleær farging (Fig. 5C). Interessant, AUY922 som en enkelt behandling, og i kombinasjon med docetaxel viste at HSP90 inhibering hadde en heterogen effekt samlet på tumor AR uttrykk. Fig. 5D og 5E viser representative farging av MYC-Cap /CR tumorsnitt, som viser deler av tumor thatremained positivt for AR atom uttrykk, mens tilstøtende deler av svulster viste tap av kjernefysisk AR uttrykk.
(A) MYC- CAP /CR-celler (5 × 10
6) ble injisert subkutant i flanken av kastrerte hann FVB mus. Behandlingen ble igangsatt da tumorer målt ca 50 mm
2 (L x W). Mus ble behandlet med kjøretøy (D5W, ip,
n = 6
), docetaxel (10 mg /kg, ukentlig, ip,
n = 7
), AUY922 (40 mg /kg, 5d på 2d off, ip,
n = 5
) eller kombinasjon (
n = 6
) i 2 uker. Tumorstørrelse ble overvåket av serie caliper målinger annenhver uke. Tumorstørrelse ble beregnet ved L x W. Hver behandlingsgruppe var normalisert til forbehandling målingene og konvertert til prosent tumorvekst. Hvert punkt representerer gjennomsnittlig tumorstørrelse ± SE. Toveis ANOVA: ** p = 0,009 docetaxel versus kombinasjon, p = 0,002 AUY922 versus kombinasjon. (B) Ukentlig kroppsvekt målinger tyder på at behandlingen ikke var giftig. Hvert punkt representerer gjennomsnitt ± SE. (C-E) Tumor vev ble oppsamlet ved avslutningen av behandlingen, fikseres i 10% normalt formalin og innstøpt i parafin. Fire micron (4 mm) deler av svulstvev ble vurdert ved immunhistokjemi for androgen reseptor uttrykk. Forstørrelse (x40), skala bar = 500 mikrometer. Positiv atom farging for AR ble kvantifisert ved hjelp aperio imagescope analyse av 6 tilfeldige felt på x40 forstørrelse. Scale bar = 500 mikrometer. Uparet tosidige t-test med Welch korreksjon: **** p 0,0001 kombinasjon versus docetaxel; ** P = 0,0016 docetaxel versus AUY922.
AUY922 synker AR transkripsjonen aktivitet i MYC-cap /CR svulster og kombinerer med docetaxel å øke tumor celledød
For å vurdere aktiviteten av AUY922 på dempningen av transkripsjonen aktivitet
in vivo
, som vi anvendte farging for å bestemme ekspresjon av c-MYC transgenet, som i denne tumormodellen er drevet av AR transkripsjon via en probasin promoter [22], [23 ]. Docetaxel behandling induserte ikke et tap av c-myc ekspresjonen (42,3%) sammenlignet med bærerbehandlede tumorer (41,2%, Fig. 6A), som var konsistent med AR-ekspresjon i tumorvevet. I motsetning til dette, tumorer behandlet med AUY922, viste betydelig reduksjon av c-myc ekspresjonen sammenlignet med vehikkel-behandling (42,3% vers 24,6%; p 0,0001) og docetaxel behandling (41,2% vers 24,6%; p = 0,006). Videre kombinasjonsbehandling viste lignende tap av c-MYC uttrykk sammenlignet med AUY922 enkelt behandling, og var betydelig sammenlignet med docetaxel enkelt behandling (28,7% vers 41,2%, p = 0,03, Fig. 6A).
( A) representant c-MYC farging. Positiv atom farging for c-MYC ble kvantifisert ved hjelp aperio imagescope analyse av 6 tilfeldige felt på x40 forstørrelse. Scale bar = 500 mikrometer. Tosidige t-test: **** p 0,0001 AUY922 versus kjøretøy; ** P = 0,006 AUY922 versus docetaxel; * P = 0,03 kombinasjon versus docetaxel. (B) Representant kløyvde caspase-3 farging. Positiv atom farging for kløyvde caspase-3 ble kvantifisert ved hjelp aperio imagescope analyse av 6 tilfeldige felt på x20 forstørrelse. Scale bar = 500 mikrometer. Tosidige t-test: **** p 0,0001 kombinasjon versus enkle behandlinger
Vev ble neste vurdert for induksjon av celledød ved immunstaining for kløyvde caspase-3.. Et lavt nivå av celledød ble observert i kjøretøyet behandlet vev (3,3%) uten noen vesentlig økning i celledød følgende docetaxel (2,1%) eller AUY922 (4,4%) enkeltbehandlinger. Men kombinasjonsbehandlingen økt betydelig antall spaltede caspase-3 positive tumorceller sammenlignet med docetaxel (14,5% vers 2,1%, p 0,0001) og AUY922 (14,5% vers 4,4%, p 0,0001) enkle behandlinger (Fig. 6B) .
Diskusjoner
Docetaxel kjemoterapi fortsatt en primær standard for omsorg for pasienter med kastrering resistent prostatakreft. Dessverre, utvikler sykdommen til tross for docetaxel behandling eller ikke svarer i det hele tatt. Derfor identifisering av nye legemidler, noe som kan forsterke eller sensitize pasienter med docetaxel kjemoterapi, er sterkt nødvendig. Mekanismene bak motstand mot docetaxel er blitt demonstrert å være faktorer i cellelinjer og kliniske prøver av forskjellige tumortyper [24]. Identifiserte mekanismer inkluderer nedsatt cellulær akkumulering på grunn av effluks-proteiner, herunder P-glykoprotein (P-gp) /MDR1 og MDR2 [25], og mutasjoner som inhiberer docetaxel fra direkte binding β-tubulin [26]. I denne studien viser vi at de andre generasjons HSP90-inhibitor AUY922 induserer potent inhibering av AR transkripsjon i forbindelse med antitumoraktivitet, og øker celledød i kombinasjon med docetaxel i kastrering motstandsdyktig prostatakreft-cellelinjer. Videre viser vi at AUY922 /docetaxel kombinasjonsbehandling resulterer i signifikant antitumoraktivitet.
