Abstract
Bakgrunn
avledet Pasient xenografter (PDXs) for hode- og halskreft (HNC ) og andre kreftformer representerer kraftige forskningsplattformer. De fleste grupper implantere pasient vev inn i immunodefekte mus umiddelbart selv om betydningen av dette tidsintervallet er anekdotisk. Vi testet hypotesen om at tiden fra svulsten excision til implantasjon er avgjørende for PDX aging og etablering.
Metoder
Vi undersøkte om tid eller lagringsmedium påvirket PDX levedyktighet for aging to etablerte HNC PDXs ( UW-SCC34, UW-SCC52). Svulster ble høstet, som er lagret i iskald media eller saltvann i 0-48 timer, og implantert inn i nye mus. Tumorveksten ble sammenlignet med to-veis ANOVA med hensyn til tid og oppbevaringsbetingelser. Tre nye HNC PDXs (UW-SCC63-65) ble generert ved å implantere pasientens vev i mus umiddelbart (Time 0) og 24 timer etter mottak av vev fra operasjonssalen.
Resultater
Lignende mengder av tumor ble implantert i hver mus. Ved slutten av eksperimentet, ble ingen signifikant forskjell sett i midlere tumorvekt mellom mediene og saltvann lagringsbetingelser for UW-SCC34 eller UW-SCC52 (p = 0,650 og p = henholdsvis 0,177,). Ingen forskjell i utbredelsen av tumordannelse ble observert på basis av tiden fra avlingen til implantering (≥13 av 16 tumorer vokste på hvert tidspunkt). Histologisk analyse viste sterk likhet med den opprinnelige tumor i alle grupper. Svulster utviklet på både tid 0 og 24 timer for UW-SCC63 og UW-SCC64.
Konklusjoner
Vi har vist at verken lagringsmedium eller tid fra tumor excision implantering (opptil 48 timer) påvirket levedyktighet eller histologisk differensiering i en etterfølgende passasje for to HNC PDXs. Videre avslørte vi at fersk pasientvev er levedyktig opptil 24 timer etter reseksjon. Denne informasjonen er viktig fordi det gjelder utvikling og deling av PDXs
Citation. Stein AP, Saha S, Liu CZ, Hartig GK, Lambert PF, Kimple RJ (2014) Influence of håndtering på etablering og Propagation of Head and Neck Cancer Patient Avledet xenografter. PLoS ONE 9 (6): e100995. doi: 10,1371 /journal.pone.0100995
Redaktør: Jay F. Dorsey, University of Pennsylvania, USA
mottatt: 24 mars 2014; Godkjent: 02.06.2014; Publisert: 26 juni 2014
Copyright: © 2014 Stein et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av R00 CA160639 (RK), UWCCC og UWCCC /MIR /WID institusjonelle tilskudd (PL), og en UW ICTR- Shapiro fellesskap (AS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
En godt etablert, men nå gjen nye modellen for menneskelig kreft er pasienten avledet xenograft (PDX) system. PDXs er utviklet ved å skaffe tumorprøver direkte fra pasienter og deretter implantering og aging disse svulstene i immunsvikt mus [1]. Prosessen ble først dokumentert i 1969 da Rygaard og Povlsen injiseres en tumorcellesuspensjon fra en pasient med kreft i tykktarmen subkutant i atymiske nakne mus og kontrollmusene [2]. De viste økt tumorvekst i atymiske mus sammenlignet med kontroll, noe som fører til bruk av immundefekte mus blitt vanlig praksis for PDX utvikling [3]. Nylig har PDXs er blitt generert for en rekke kreftformer, inkludert pankreatisk [4] – [6], bryst [7], lunge [8], [9], renal [10] og hode og hals [1], [11] . Disse studiene viste at PDXs beholde egenskapene til den primære svulsten over seriepassasjer både ved den histologiske [7], [8] og molekyl [1], [7], [11] nivåer. Daniel et al. også demonstrert at deres primære småcellet lungekreft PDX (bare passert i mus) beholdt større likhet med pasientens tumor sammenlignet med en cellelinje som genereres fra samme PDX [9]. Videre vår gruppe [1] og andre [12] har lykkes cryopreserved og reanimated PDXs på et senere tidspunkt, øker nytten av denne modellen systemet. Dermed PDXs representerer en validert og pålitelig modell for å studere en rekke humane kreftformer.
En kraftig bruk for PDXs er testing av standard og nye behandlinger i en
in vivo
system med større heterogenitet enn genetisk modifiserte musemodeller og en mer relevant tumormikromiljøet enn cellelinjer [1], [4], [11]. Når etablert, PDXs forsterkes
in vivo
, injisert i mange mus, og musene deretter delt i ulike behandlingsgruppene. Kapasiteten til en spesiell behandlingsregime for å forsinke eller stanse tumorvekst kan bli vurdert ved å sammenligne den gjennomsnittlige tumorvekst over tid for hver gruppe sammenlignet med kontroll (ubehandlede) mus. På denne måte kan undersøkere evaluere effekten av mange alternative terapier på en bestemt tumortype som stammer fra en enkelt pasient. I tillegg kan molekylære forandringer indusert av de forskjellige behandlinger bli analysert ved å innhøste etter behandlingen viste prøver, enten ved flash-frysing tumor biter i flytende nitrogen for genom brede studier eller festing av tumorer i formalin etterfulgt av parafin innebygging for biomarkør analyse. Det har også blitt hevdet at dette modellsystem kan bli anvendt i tilpasset behandling av kreft ved å generere PDXs fra en pasients kreft, testing av en rekke kjemoterapeutiske på mus med deres tumor, og så velge en ny behandlingsregime for pasienten basert på disse
resultat~~POS=TRUNC vivo product: [13].
Det finnes en rekke varianter i de prosedyrer som brukes til å etablere PDXs. For eksempel har noen grupper beskrive kirurgisk implantering av små (2-3 mm) tumor biter inn i flankene [14], mens andre fingrene tumorene for å lage en cellesuspensjon og injiserer suspensjonen subkutant gjennom en stor gauge nål [15]. Videre er visse grupper bare bruke atymiske nakne mus [3], og benytter ikke-obese diabetic alvorlig kombinert immunsvikt (NOD-SCID) mus [7] og noen benytter begge stammer [1]. Betydelig har disse forskjellige teknikker alle førte til vellykket tumorvekst. Et annet gjennomgangstema som fremkommer i PDX utvikling er at svulster blir tatt så raskt som mulig (senest innen 3 timer) fra tidspunktet for biopsi og deretter injisert i immunsvikt mus [1], [2], [8], [10 ], [16]. Vår gruppe og andre fortsette på denne måte på grunn til å tro at tiden fra tumor xenograft eksisjon til implantering er viktig. Det er imidlertid ingen informasjon i litteraturen som tyder på at tumor biter må injiseres /implanteres så snart som mulig inn i de musene [17]. I tillegg, mens mus til mus passasjen er vanligvis utføres så raskt som mulig, det er nytt, lite data å støtte nødvendigheten av denne praksisen.
På grunn av usikkerhet om optimal høsting og implantasjonsteknikk, vi foretok denne studien er å finne ut om det var en sammenheng i vekstevnen i PDX basert på tidsforsinkelsen fra første tumor reseksjon til sin endelige implantering i mus. I tillegg, søkte vi å fastslå om lagringsmediet som brukes under behandlingen forsinkelse påvirket PDX levedyktighet. Dette arbeidet er viktig siden det er en rekke faktorer utenfor forskerens kontroll som kan påvirke muligheten til å skaffe tumor biopsier fra samtykket pasienter på en riktig måte. Dessuten, når PDXs er etablert, krever re-implantasjon tilgjengeligheten av mottakerens mus og deres spredning til andre laboratorier kan kreve forsendelsen. Begge disse problemene kan føre til forsinkelser i re-implantasjon. Våre resultater viser tumoren fremdeles er levedyktig og i stand til å vokse i den neste generasjon av mus opp til minst 48 timer etter den innledende tumor utskjæring og at innholdet i lagringsløsningen, det være seg vevskulturmedium eller saltoppløsning, og ingen virkning på tumorvekst. Videre har vi vist at frisk pasient vev fra operasjonssalen (OR) er levedyktig, og kan brukes til å etablere en ny PDX opp til minst 24 timer etter den innledende fjerning fra pasienten. Evnen til å utsette svulst implantasjon har viktige implikasjoner med hensyn til deling av disse ressursene, samt logistikk for første PDX etablering og påfølgende vedlikehold.
Materialer og Metoder
Mus
Seks til åtte uker gamle mannlige og kvinnelige NOD-SCID gamma (NSG, NOD.Cg-
Prkdc
SCID Il2rg
tm1Wjl Twitter /SzJ) mus (kjøpt fra Jackson Laboratories) ble brukt til PDX utvikling og forsterkning. Alle musene ble holdt i Foreningen for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care-godkjent Wisconsin Institute for Medical Research (WIMR) Animal Care Facility. Dyrene ble plassert i spesifikke patogen rom, og de levde i autoklaveres, aseptiske og mikroisolatorbur med maksimalt fire dyr per bur. Mat og vann ble gitt ad libitum. Alle studier av mus ble utført i henhold til et dyr protokoll godkjent av University of Wisconsin (Protocol Number: M02518). Under forsøkene ble hver musens vekt og klinisk helse vurderes på en ukentlig basis.
Tidligere Etablert Avledet Pasient xenografter
Våre PDXs ble avledet fra pasienter med nylig diagnostisert eller hode- og halskreft ( HNC) som fullførte en skriftlig tillatelse i henhold til IRB godkjennelse fra University of Wisconsin. Vi har tidligere beskrevet etableringen av vår PDX modell i større detalj [1]. Som tumorprøver fra OR ofte gir bare nok vev for implantering i to til fire mus, benyttet de viktigste studiene som er beskrevet i dette manuskriptet etablert PDXs på et tidlig passasje. Aging og implantering av PDXs ble utført ved å først høsting svulster fra NSG mus med tumoren av interesse, overføring av tumor i en steril måte til et 2,0 ml Eppendorf-rør med en 01:01 blanding av medium (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium med 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin /streptomycin, og 2,5 pg /ml amfotericin B) og matrigel (katalog # 354230, BD Biosciences, Inc.) og hakking svulsten til mindre enn 1 mm
3 stk. Til slutt ble svulsten suspensjon trukket inn i en 1 ml sprøyte gjennom en 18-gauge nål og injisert subkutant i to flanker av NSG mus.
Experimental Design
To PDXs som viste vedvarende vekst i tidlig passasjer (UW-SCC34 og UW-SCC52) ble valgt for dette eksperimentet. Prosessen ble gjennomført separat for UW-SCC34 og UW-SCC52 grupper, men en identisk protokoll ble fulgt begge ganger. Først ble fire NSG mus med to svulster hver av PDX av interesse avlives, og en timer ble startet da død ble bekreftet. Alle tumorer ble høstet fra fire mus på samme tid. Samlede kreft biter ble veid og fordelt likt over fjorten 2,0 ml eppendorfrør forhånds klimaanlegg på is: syv inneholder media og syv med saltvann. I tillegg ble en tumor mengde (referert til som pre-implantation prøve) fiksert i 10% nøytral bufret formalin i 48 timer og parafin innebygd for senere histologisk analyse. Deretter ble en media + svulst tube og en saltvann + svulst tube fjernet fra isen. Hver tumor del ble overført til sin egen, nye rør med en 01:01 blanding av friske medier og matrigel, hakket i 1 mm
3 stykker, og injisert i fire flanker av to NSG mus (n = 8). Tiden ble spilt inn etter at alle fire mus ble injisert (Time 0, 40 minutter). På denne måten, endte vi opp med to grupper på dette tidspunkt: «Time 0 Media» og «Time 0 Saline». Begge gruppene besto av to NSG mus hver med fire injeksjonssteder. Således har hver gruppe hadde mulighet til å utvikles åtte tumorer (figur 1). Denne prosessen ble gjentatt ved 1, 2, 4, 8, 24 og 48 timer etter timeren ble startet. I mellomtiden ble svulstene i media eller saltvann opprettholdt ved 4 ° C.
Flow diagram som viser den eksperimentelle oppsettet.
Svulster fikk vokse i 3 uker for UW- SCC34 og 6 uker for UW-SCC52. Varigheten av tumorvekst ble diktert av tumorvekstkinetikk og helse av musene. Ved slutten av hvert forsøk ble tumorene fra alle mus høstet, veiet og fotografert (høstede tumorer 1 og 2 dager senere for 24-timers og 48-timers-grupper, henholdsvis). Hver svulst ble fiksert i 10% nøytral bufret formalin i 48 timer og deretter parafin innebygd. En svulst ble tilfeldig valgt fra hver av de fjorten grupper for videre histologisk analyse
Histologi
tumorvev ble seksjonert (5 um) og hematoxylin og eosin (H E). Flekkene ble utført på hver femte delen. Alle lysbildene ble fotografert på en Olympus BX51 mikroskop (Olympus America, Inc). Sammenligninger ble gjort mellom histologi av pre-implantasjon prøven og svulster dyrket i neste generasjon av NSG mus. Likheten i histologi svulster på tvers av de fjorten ulike grupper innenfor de to forsøkene ble også vurdert. Et styre sertifisert patolog som spesialiserer seg på sykdommer i hode og hals (CZL) utføres histologisk analyse for å definere differensiering, keratinization, nekrose /cystisk forandring og infiltrerende mønster for hver svulst.
Nye Avledet Pasient xenografter
Når vi har fastslått at verken tid fra excision å re-implantasjon eller lagringsmediet påvirket PDX vekst i et påfølgende passasje, utførte vi en variant av dette eksperimentet anvendelse av frisk pasient vev fra operasjonsrommet. Tre nye pasienter med HNC ble gitt samtykke til å donere vev for PDX etablering (UW-SCC63, UW-SCC64, UW-SCC65). På grunn av den lille mengden av tumor vi mottar fra OR, kan det bare være to grupper for disse forsøk. Derfor fokuserte vi på tidsfaktoren for første PDX etablering. Når vi har mottatt den friske pasienten vev, ble det veid og fordelt jevnt i to rør med media. For en tube, ble matrigel lagt umiddelbart og svulsten ble kvernet og injisert inn i fire flankene av to NSG mus (n = 8, tid 0). Det andre rør (med tumor og media) ble lagret ved 4 ° C i 24 timer. Deretter ble tumor overført til et nytt rør med friske medier og matrigel, og tumoren ble hakket og injisert inn i fire områder av to NSG mus (n = 8, 24 timer). Den samme prosessen ble gjentatt for alle de tre nye pasientprøver.
Etter ni uker, ble tumorvekst vurdert og sammenlignet mellom tid 0 og 24 gruppetimer i hver nye PDX. Bare UW-SCC64 hadde svulster på en passende størrelse for aging. Derfor ble alle mus i UW-SCC64 eksperiment avlivet og tumorene skåret ut, veiet og fotografert (høstede tumorer 1 dag senere for 24-timers gruppe). For UW-SCC63 og UW-SCC65, ble musene palperes for tumorvekst på hvert injeksjonssted.
Statistical Analysis
Vi drevet denne studien å påvise en forskjell i PDX levedyktighet mellom første og siste tidspunkter (tid 0 og 48 timer, henholdsvis). Det eksisterer ikke noen informasjon i litteraturen om effekten av tid på PDX levedyktighet og vekst, slik at vi ikke har noen informasjon for å veilede våre estimering for forskjellen vi forventet å se mellom disse gruppene. Derfor vi konservativt anslått at det ville være en 50% reduksjon i tumordannelse etter 48 timer sammenlignet med tid 0. For å detektere en 50% reduksjon i tumordannelse ved et signifikansnivå på 0,05 og en kraft på 0,80, beregnet vi en prøvestørrelse fra 8 per gruppe [18]. For å evaluere effekten av lagringsmedium også, kreves vi et utvalg på åtte på hvert tidspunkt for både media og saltvann grupper.
For de UW-SCC34 og UW-SCC52 eksperimenter, alle svulster ble individuelt veiet på slutten. Tumor vekter som oppnås for disse PDXs fra de to vekst medier (media og saltvann) ble oppsummert ved hjelp av beskrivende statistikk, inkludert gjennomsnitt og standardavvik. Tumorvekter på tvers av de to vekst- medier ble sammenlignet ved bruk av Snedecor F-test fra en to-veis analyse av varians (ANOVA) modell der tiden som en faktor. Derav denne modellen justert for tiden når prøven ble implantert i mus. Forskjellen i midlere tumorvekt mellom mediene og saltvann vekstmedium prøvene ble beregnet med et 95% konfidensintervall. Disse statistiske analysene ble utført ved hjelp av SAS versjon 9.2.
For de nyetablerte PDX eksperimenter, ble alle svulster høstet og veid fra UW-SCC64 PDX. Midlere tumorvekter for tid 0 og 24 timers grupper ble sammenliknet med en to-utvalgs t-test med lik standardavvik. Denne analysen ble utført med Graphpad Prism v6.0d. For all statistisk analyserer en p-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Mus
I utgangspunktet hadde musene veide i gjennomsnitt 22,8 gram (g) (range 19,0 g-26.8 g). De var fri for mikroorganismer, og hadde ikke vært utsatt for noen forutgående behandling eller testing.
Pre-implantasjon Tumor Vekter
For å redusere forskjeller i mengden av svulsten implantert i hver gruppe, vi først distribuerte tumorer slik at like mengder ble injisert i mus ved hvert tidspunkt, og for hver lagringsbetingelser (figur 1). For de fjorten UW-SCC34 grupper var den gjennomsnittlige pre-implantasjon svulst veide 0,0906 g (range 0,0816 g-0,1027 g), og for UW-SCC52 middelverdien var 0,1298 g (range 0,1116 g-0,1487 g). Som avbildet av boksplott i figur 2A og 2B, var det ingen uteliggere blant pre-implantasjon tumor vekter for de fjorten grupper i enten eksperiment.
(A) Boksplott for fjorten UW-SCC34 pre-implantasjon svulst vekter viser fravær av uteliggere. (B) Boxplot av de pre-implantasjon tumor vekter for UW-SCC52 viser også at det ikke er noen uteliggere.
Effekt av lagringsmedium og Tid på PDX Vedlikehold
På enden av begge forsøk ble alle tumorer høstet, fotografert (figurene 3A og 3C) og veide fra 28 mus. Først undersøkte vi om lagringsmediet (media versus saltvann) påvirket tumorvekstpotensial. For UW-SCC34 den gjennomsnittlige tumorvekt for alle tumorer i media gruppe (n = 56) var 0,132 g (standardavvik (SD) 0,130 g), og for det saltgruppen (n = 56) middel var 0,142 g (SD 0.120 g). Forskjellen mellom de midlere tumorvekt for disse to gruppene var -0,010 g (95% CI: -0,056 g, 0,035 g), som ikke var statistisk signifikant. For å ta hensyn til noe forhold til den tid da tumoren var implantert, utførte vi en to-veis ANOVA med lagringsmediet og tid som de faktorer. Dette viser også at det ikke var noen statistisk signifikant forskjell mellom den midlere tumorvekt i media og saltvann gruppene (p = 0,650, figur 3B). Vi har gjennomført de samme analysene for UW-SCC52 eksperiment. For alle tumorer i media gruppen (n = 56) middelvekt var 0,146 g (SD 0,113 g), og for det saltgruppen (n = 56) middel var 0,119 g (SD 0,111 g). Igjen, med en forskjell mellom gjennomsnittene av 0,027 g (95% CI: -0,012 g, 0,067 g), var det ingen signifikant forskjell mellom de gjennomsnittlige tumorvekter basert på lagringsmediet. Til slutt, ved å benytte en to-veis ANOVA, var det ingen signifikant forskjell mellom tumorvektene for mediet versus saltvann lagringsmedium når man tar tiden i betraktning (p = 0,177, figur 3D). Således, basert på vår duplikate eksperimenter lagringsmediet ikke hadde noen effekt på tumorvekst potensial, selv ved innarbeiding av tid fra tumor eksisjon å re-implantasjon.
(A) Fotografier av alle tumorer høstet på slutten av eksperimentet for UW-SCC34. (B) boksplott for slutten av eksperimentet tumor vekter for UW-SCC34 eksperiment preget av lagringsmedium og tid. (C) Fotografier av alle tumorer høstes ved slutten av eksperimentet for UW-SCC52. (D) Slutt på eksperiment tumor vekter for UW-SCC52 også adskilt av lagringsmedium og tid.
Vi har også vurderes om tiden fra tumor reseksjon implantering hatt noen effekt på tumor levedyktighet. På hvert tidspunkt var det 16 potensielle svulster som kunne ha utviklet (8 fra media og 8 fra saltvann gruppe). Basert på tabell 1, for UW-SCC34 eksperiment er det åpenbart at tiden ikke påvirke evnen til PDX å vokse, fordi minst 13 av 16 tumorer utviklet ved hver av de syv tidspunkter. Interessant, på senere tidspunkter, 24 og 48 timer, 16 av 16 PDXs vokste. Tilsvarende for UW-SCC52 eksperiment, minst 15 av 16 tumorer utvikles ved hvert tidspunkt (tabell 1). Dermed gjorde lengden på forsinkelsen før re-implantasjon ikke påvirke tumorviabilitet for enten UW-SCC34 eller UW-SCC52 eksperimenter, innenfor den tidsrammen som studeres (dvs. opp til 48 timer med lagring ved 4 ° C). Dessuten var det ingen sammenheng mellom pre-implantation tumorvekten og endelig tumorutvikling (det vil si: den få mus som mislyktes i å utvikle en eller to tumorer ikke har de laveste pre-implantation tumorvekter). Dette ytterligere indikerte at mengden av tumor injisert ved begynnelsen av forsøkene var egnet til å fremme påfølgende tumorvekst.
Histologi
Som vist i tabell 2, den pre-implantation UW -SCC34 svulst ble moderat differensiert med 10% keratinization, 5% nekrose /cystisk forandring og et infiltrerende mønster på H E farging. Viktigere, alle svulster i den påfølgende passasje fra de syv ulike tidspunkt og to lagring medier viste de samme egenskapene til moderat differensiering med en infiltrerende mønster sammen med noen keratinization (range 5% -15%) og nekrose /cystisk endring (range mindre enn 5% -15%). Representative bilder fra de fargede objektglass er vist i figur 4. Deretter ble UW-SCC52 pre-implantation tumor evaluert og hadde moderat differensiering, ingen keratinisering, 20% nekrose /cystisk forandring og en infiltrerende mønster (tabell 3). Igjen, histologi av svulstene fra neste passasjen (alle tidspunkter og begge lagringsmedier) var ganske lik med hverandre viser moderat differensiering, ingen keratinization, noen nekrose /cystisk forandring (område 5% -25%) og et infiltrerende fenotype . Dermed histologisk vi har vist at den samme svulst utviklet uavhengig av tid eller lagringsmediet for både UW-SCC34 og UW-SCC52
Representative bildene fra H . E beiset lysbilder for hver gruppe i UW- SCC34 og UW-SCC52 eksperimenter.
Effekt av tid på ny PDX Etablering
Vi har undersøkt hvorvidt en 24 timers forsinkelse i implantasjon tid (tumor lagret i media ved 4 ° C i løpet av forsinkelsen) hadde noen effekt på PDX etablering for tre nye HNC PDXs (UW-SCC63, UW-SCC64, UW-SCC65). Omtrent like store tumorvolumer ble injisert inn i de to musene på tidspunktet 0 og 24 timer for hver av de tre PDXs. For UW-SCC63 pre-implantasjon tumor vekter var 0,0694 g og 0,0723 g, mens pre-implantasjon vekter var mye lavere for UW-SCC64 (0,0115 g og 0,0117 g) og UW-SCC65 (0,0085 g og 0,0093 g).
Ni uker etter innledende implantering, de mus som bærer hver ny PDX ble evaluert for tumorvekst. Bare mus med UW-SCC64 PDX hadde tilstrekkelig tumorvolumet for aging. Derfor ble disse musene avlivet, og alle tumorer ble individuelt fotografert og veid (figurene 5A og 5B). Gjennomsnittlig vekt for den tiden 0 svulstene var 0,104 g (SD 0,156 g) og 24 timer gjennomsnittlig var 0,060 g (SD 0,137 g). Det var ingen statistisk signifikant forskjell mellom de gjennomsnittlige tumorvekter mellom disse to gruppene (p = 0,564). Dessuten var det et tilsvarende antall tumorer som oppsto i hver av de to gruppene. Fire av åtte svulster vokste tid 0 og tre av åtte utviklet i 24-timers gruppen. For UW-SCC63, var det tre opplagte svulster i Time 0 gruppen og to i 24-timers kohort. På den annen side, UW-SCC65 ikke påvise noen palpable tumorer i noen av gruppene. Samlet sett ser det ut i PDXs som var i stand til å etablere seg, gjorde 24-timers tidsforsinkelsen ikke påvirke PDX levedyktighet. Interessant, gjorde pre-implantasjon tumorvekt ikke ut til å ha en viktig effekt på etterfølgende tumorvekst siden UW-SCC64 tumorer (som viste størst vekst) hadde omtrent seks ganger mindre svulst implantert i utgangspunktet i forhold til UW-SCC63.
(A) Fotografier av alle tumorer høstes ved slutten av eksperimentet for UW-SCC64. (B) Bar grafer som viser de gjennomsnittlige tumor vekter for tiden 0 og 24 gruppetimer i UW-SCC64 eksperiment.
Diskusjoner
PDXs representerer en viktig og validert modell for etterforskning av en rekke forskjellige kreft undergrupper, spesielt i rettssaken mot nye og standard kjemoterapeutika. Fordi pasienten vev er dyrebar og ofte vanskelig å få tak i, må etterforskerne ta stor forsiktighet for å optimalisere denne modellsystem. Av denne grunn vi ønsket å utforske videre potensielle grensene for PDX aging ved å teste hypotesen om at 1) time fra tumor reseksjon til ultimate implantering i ny NSG mus er viktig og 2) lagringsmedium har en effekt på PDX levedyktighet og vekst. Overraskende, har vi funnet at verken lagringsmedium (media eller saltvann) eller tid lagringsplass (opp til 48 timer ved 4 ° C) påvirket PDX vekst og etablering i en etterfølgende passasje. Videre har vi avdekket at forsinke implantasjon av frisk pasient vev opptil 24 timer (tumor lagret i iskaldt media i løpet av forsinkelse) ikke påvirker innledende PDX etablering.
For å forstå viktigheten og nødvendigheten av PDXs i fullt innen kreftforskning, er det verdifullt å vurdere andre tilgjengelige modeller sammen med sine styrker og fallgruver. Først har cellelinjer spilt en viktig rolle i historien til onkologisk forskning og medisiner. HeLa-celler som representerer de første humane kreftceller dyrket i laboratoriet, og analyser av disse celler og andre cellelinjer som fulgte har gitt mye av vår nåværende molekylær forståelse av kreft [19]. Videre standard pre-klinisk prosess for å undersøke nye kreft kjemoterapeutika av National Cancer Institute (NCI) begynner med vurderingen av
in vitro
aktivitet i 60 etablerte kreftcellelinjer (NCI-60) etterfulgt av
in vivo
vurdering av disse cellelinjene hos mus gjennom både den hule fiber analysen og xenotransplantater [20], [21]. Nylig har gyldigheten av å utnytte cellelinjer som surrogater for den primære svulsten blitt brakt inn spørsmålet [22]. Gillet et al. demonstrert gjennom genetiske analyser at ingen korrelasjon eksisterte mellom pasient svulster og etablerte kreftcellelinjer, og faktisk cellelinjene fødte større likhet med hverandre enn å kliniske prøver [23]. Andre grupper har også avdekket viktige forskjeller mellom primærsvulster og avledede cellelinjer [24]. Men etterforskerne også oppmerksom på at viktige spredningsveier endringer fortsatt eksisterer i disse kreftceller [25]. Derfor, til tross forskjeller med hensyn til den primære svulsten, genetiske uttrykk profiler kan brukes til å velge cellelinjer for spesifikke analyser [26] – [28]
På grunn av den økende bekymring over representativitet av cellelinjer til. den primære kreft, er det behov for flere modeller for å supplere dette arbeidet. Transgene musemodeller representerer en annen tydelig system som har blitt brukt i kreftforskning. Disse modellene er oftest brukt for å vurdere effekten av relevante onkogene mutasjoner til tumorigenesis og terapeutisk respons for en rekke menneskelige kreft inkludert pancreatic ductal adenokarsinom [29], [30], Bløtvevskreft [31], lunge adenokarsinom [32] , HNC [33] og mange andre. Omfanget av spørsmål som kan undersøkes av transgene mus er ganske bred som eksemplifisert ved tidligere studier på transgene mus som uttrykker humant papillomavirus (HPV) onkogener der interaksjoner mellom disse spesifikke onkogener med Fanconi anemi mangel gener [34], østrogen og livmorhalskreft progresjon [35], og oncoprotein uttrykk i forhold til lymfocytt handel [36] er belyst. Alt i alt, kan transgen muse forskning gir unik innsikt i mekanismene for kreftfremkallende mutasjoner og potensielle terapeutiske intervensjoner. Men disse modellene har en tendens til å ha kraftig kjøring onkogene mutasjoner og andre svært spesifikke genetiske endringer som kan begrense omfanget av deres egnethet for klinisk onkologi.
For PDX-modell, er hver pasients kreft unikt og representerer utallige genetiske endringer at påløpt over tid kreften utviklet. Disse cellene blir ikke med hensikt transformert eller tvunget til å overuttrykke spesifikke proteiner som cellelinjer og transgene musemodeller, respektivt. Ideelt sett betyr dette PDXs skal ligne den primære svulsten. Som beskrevet i innledningen, har mange grupper validert nytten av dette systemet, inkludert evnen til PDXs å rekapitulere den metastatisk potensial av primærtumor [7], [37]. Viktigere, Tentler et al. nylig gjennomgått translasjonsforskning track record for PDXs i onkologi narkotika utvikling for et bredt spekter av kreft, og fremtiden for PDXs i utviklingen av prediktive biomarkører for kliniske studier vises lovende [17].
PDXs kan injiseres i mus i enten en ortotopisk eller heterotop måte [17]. De PDXs at vi har generert, benyttet og beskrevet gjennom denne utredningen ble implantert i en heterotop mote siden HNCs ble dyrket subkutant i mus. Andre grupper som studerer pankreatisk [4], [6], lunge [9], [10], og nyre [10] kreftformer har også anvendt subkutan tumorimplantering for sitt arbeid. Subkutane svulster tillate enklere tilgang for størrelse målinger ved målepunktene under terapeutiske studier. Videre kan svulster være vokst til et mye større volum subkutant i forhold til ortotopiske nettstedene før forårsaker skade på musene. På denne måte subkutane tumorer tillate større forsterkning av dette verdifulle vev, som deretter kan bli høstet for histologisk samt molekylære analyser og for aging til nye mus. Orthotopic implantasjon, hvor kreftceller blir injisert på stedet av opprinnelse, representerer en annen levedyktig måte å forplante og studere PDXs. Denne teknikken har blitt beskrevet for bryst [7], hjerne [38], og HNCs [37], [39]. Det er antatt at denne modellen gjør at svulster å utvikle seg i en mer representativ mikro [39]. Faktisk er dette systemet er spesielt nyttig for å studere metastase [7], [37]. Men spesielt for hode og nakke regionen, bare små tumorvolumer kan genereres før forårsaker skade på musene. Qiu et al. dokumentert at etter to uker mus med orale PDXs nødvendig modifiserte dietter på grunn av problemer med å spise [37]. På grunn av disse små tumorstørrelser, er det vanskelig å forplante HNC PDXs dyrket orthotopically.
