Abstract
Bakgrunn
Colorectal-kreft (CRC) forskning har stor nytte av tilgjengeligheten av små dyr tumormodeller. Spontane og kjemisk indusert CRC-modeller er mye brukt, men begrenset i sin likhet til sykdom hos mennesker og er ofte langvarig, ikke nøyaktig repeterende, og forbundet med inflammatoriske bivirkninger. In-situ murine eller humane tumor implantering i mage-tarmkanalen hos mus er meget krevende, og begrenset av inter-dyr variabilitet og prosedyremessige komplikasjoner og dødelighet. Som et resultat, i hyppige studier CRC er implantert i distale steder, vanligst det subkutane område, en tilnærming som er sterkt begrenset av fravær av normal gastrointestinal tumor miljø og har betydelige effekter på tumorutvikling.
Mål
i denne studien vi forsøkte å utvikle et godt tolerert repeterende verktøy for å studere CRC i små dyr ved å tilpasse den murine kolonoskopi system for å tjene som en plattform for colonic sub-slimhinne ortotopisk implantasjon av humane og murine CRC tumorceller.
Resultater
Vi rapporterer etablering av en ny liten dyr CRC modell som er minimal invasiv, rask, godt tolerert, reproduserbar, og overfører nøyaktig kontroll av svulst antall, plassering og vekst sats. Videre viser vi at denne modellen unikt gjør side-by-side induksjon av forskjellige genetisk manipulerte svulster, slik at mekanistisk studie av tumor samhandling og krysstale innenfor den innfødte tarmmikromiljøet.
Konklusjoner
Ansettelse av denne nye tilnærmingen kan representere en viktig teknisk fremskritt for
in vivo
studie av CRC
Citation. zigmond E, Halpern Z, Elinav E, Brazowski E, Jung S , Varol C (2011) Utnyttelse av Murine Koloskopi for ortotopiske Implantasjon av tykktarmskreft. PLoS ONE 6 (12): e28858. doi: 10,1371 /journal.pone.0028858
Redaktør: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, USA
mottatt: 17 juli 2011; Godkjent: 16 november 2011; Publisert: 12.12.2011
Copyright: © 2011. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Crohns Foundation kolitt of America (CCFA) (til S.J., nummer – 7108160101; webside: www.ccfa.org). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Colorectal-kreft (CRC) er den nest største årsaken til kreftdødelighet i mange industrialiserte land [1]. CRC modeller i små dyr har gitt viktige verktøy for å undersøke de underliggende årsaks og patofysiologiske mekanismer for CRC utvikling og for preklinisk vurdering av nye terapeutiske modaliteter. Mange murine CRC modeller har blitt utviklet og beskrevet i litteraturen [2], [3]. De viktigste fremgangsmåter omfatter mutante mus som utvikler spontane tumorer, behandling med et bredt spekter av kreftfremkallende stoffer, med eller uten induksjon av kronisk betennelse, og ektopisk eller ortotopisk implantasjon av tumorceller.
Spontane CRC-transgene musestammer tett etterligne humane kreftsyndromer, så som arvelig nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) [4] og familiær adenomatosis polypose (FAP) [5]. Disse modellene har vist seg uvurderlig for studiet av effekten av kjente genetiske endringer i sykdomsforløpet. Men mange av disse musemodeller danne adenomer hovedsakelig i tynntarmen, og er vanligvis forbundet med en langsom vekst og betydelig inter-dyr variabilitet [3] Apc
Min /+ mus belastningen ble etablert basert på resultatene utledet fra en bakterie linje mutagenese studie med N-etyl-N-nitrosourea kombinert med fenotypisk screening [5]. Selv om denne modellen er forbundet med utseendet av et stort antall av godartede adenomer i tynntarmen, CRC tumorer utvikles i løpet av mindre enn halvparten av dyrene. Ikke desto mindre, behandling av disse musene med den kreftfremkallende middel azoxymethane (AOM) i vesentlig grad øker tumortilfeller i kolon til disse musene, og denne modellen har vist seg å være nyttige for å studere effekten av kjemopreventive forbindelser [6], [7].
Induserbare CRC musemodeller, på den annen side, er vanligvis basert på bruk av forskjellige kreftfremkallende forbindelser, slik som azoxymethane (AOM), 1,2-dimetylhydrazin (DMH) og andre [2]. Den kjemisk induserte etablerte tumorer har mange av de histopatologiske egenskapene av ikke-arvelig human CRC [2], [8]. Tumorutviklingen i disse modellene er blitt rapportert å være i området fra 30 uker. Spesielt, kombinasjon av de kreftfremkallende forbindelsen med kronisk betennelse slik som i tilfellet med AOM /dekstran-natriumsulfat (DSS) modell, har vist seg å redusere latens tid observert i den klassiske modell til 10 uker, og til å målrette induksjon av tumorer hovedsakelig til den distale colon [8], [9]. Disse fordelene, samt sin høye styrke, enkel modus av søknaden, bredt spekter av følsomhet, og relativ kostnadseffektivitet, har gjort denne modellen svært vanlig i CRC forskning, og en fremragende forskning verktøy for å studere tidlige kreftfremkallende hendelser og å vurdere potensielle terapeutiske tilnærminger [2], [8]. Men i denne modellen svulster utvikle seg under de miljømessige påvirkninger av kronisk betennelse, en tilstand som etterligner inflammatorisk tarmsykdom (IBD) -associated CRC, men ikke mye mer vanlig sporadisk menneskelig CRC. Viktigere, alle CRC
in- vivo
modellene nevnt ovenfor lider av en iboende manglende evne til å kontrollere kreft tall og vekstkinetikk.
Flere ortotopiske murine CRC modeller har blitt beskrevet, de fleste som krever et operativt tilnærming for injeksjon eller implantering av kreftceller i tykktarmen eller coecale lagene [10], [11]. Kompleksiteten i den kirurgiske prosedyren, som resulterer traume, prosedyrerelaterte betennelse og dødelighet, sterkt begrense verdien av disse systemene for studiet av medfødte og ervervede anti-tumor immunresponser.
Hos mennesker, endoskopisk undersøkelse av Tykktarmen er den viktigste metoden for oppdagelsen og oppfølging vare på CRC. Nylig,
in vivo
murine endoskopi er utviklet slik at høy oppløsning i tykktarmen i levende mus, og at forskerne å direkte visualisere og scorer patologiske vevsforandringer i tykktarmen [12], [13] og i intra Kin-buk organer [14]. Videre intervensjoner som repeterbare biopsi av tykktarm kreft i lever mus i løpet av oppfølgingsperioden av et eksperiment og deres påfølgende proteomikk analyser har innført nye kraftige verktøy for CRC forskning [15].
Vi presenterer her for første gang en tilpasning av murine koloskopi systemet og dets arbeid for etablering av en roman orthotopic musemodell for CRC. Denne tilnærmingen gir en enkel og grei løsning på de tekniske begrensninger knyttet til eksisterende CRC-modeller.
Resultater
Etablering av orthotopic musemodell for CRC utnytte murine koloskopi system
Liten dyr endoskopi regnes i dag som gullstandarden verktøy for overvåking av kolon inflammatoriske lidelser og CRC. For å tilpasse dette systemet for det formål å ortotopisk implantering av CRC tumorceller inn i det colonic sub-mukosa har vi spesielt utformet en hypodermisk nål som kan passere gjennom endoskopisk kappe arbeidskanalen av det Karl Storz Coloview miniendoscopic system. De sprøyte nåler ble skreddersydd i henhold til vår spesifikasjon av Cadence Inc. U.S.A., og er laget av åtte tommers lang fleksibel rustfritt fleksibel stål, med 30 sporvidde ytre diameter, og en kort skråkant i en 45 graders engel (figur S1). Denne nålen overfører flere design fordeler; den fleksible stål sammen med nål dimensjoner lindre injeksjons manøver og la den glatte spill gjennom arbeidskanal og luer lock, som skrus på den for å unngå luftlekkasje. Videre tillater den butte koniske injeksjon i sub-mucosa med redusert risiko for perforering eller søl av det injiserte materiale til lumen. Vi først undersøkte vev fordeling av injisert reagenser og vurderes riktig injeksjonsvolumet ved å injisere tusj merking fargestoff inn i colonic sub-mucosa lag. Et injeksjonsvolum på 50 ul ga den beste kombinasjon av minimal lekkasje og fokal spredning av trykkfargen under epitellaget (figur 1A). Spyling av colonic lumen ved å bruke saltløsning gjennom undersøkelse kappe av endoskopet bekrefter lokaliseringen av det injiserte blekk under epitellaget (film S1). Histologisk analyse bekreftet at tusj kan beholdes i colonic lamina propria selv fem dager etter at den orthotopic injeksjon (figur S2A). Viktigere, histologisk analyse av mus injisert med sterilt Dulbeccos Fosfatbufret saltløsning uten kalsium og uten magnesium (PBS
– /-) viste en normal sunn colonic arkitektur på injeksjonsstedet, som bekrefter at denne metoden er minimal invasiv (figur S2B)
(A) Koloskopi bilde presentere colonic under mucosal injeksjon av India-blekk fargestoff i C57BL /6 mus for vurdering av den aktuelle injeksjonsvolum og dens fordeling på colonic lamina propria. (B) Representative koloskopi bilder som viser den gradvise utviklingen av CRC svulst i samme C57BL /6 mus følgende orthotopic implantasjon av 1 × 10
5 MC38 CRC celler fra dag 5, gjennom dag 12 til dag 19. (C-D) representant bilde av histologi prøven farget med hematoxyline og eosin (H E) og isolert fra tarminjeksjonsstedet på dag 14 etter injeksjon av 1 x 10
5 MC38 CRC celler. Forstørrelser: C- [x40], D – [x100]. Legg merke til grenseområdet mellom tumor og tilstøtende normal slimhinne og projeksjonen av tumoren gjennom epitellaget inn i hulrommet. (E) Representant bilde som viser H E farging av histologi eksemplar av muse-CRC svulst generert 5 dager etter orthotopic implantasjon av MC38 CRC tumorceller i C57BL /6 mus (Forstørrelse x40). (F) Fluorescerende mikroskopiske bilde som viser GFP merkede tumorceller og deres spredning gjennom epitellaget mot lumen (forstørrelse X100). Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
MC-38 murine kolon svulsten er en klasse III adenokarsinom, som ble kjemisk indusert i en kvinnelig C57BL /6 mus og brukt siden da som en transplant mus svulst modell [16]. For å teste muligheten av ortotopisk tumorimplantasjon metode, injiserte vi 1 x 10
5 MC38 CRC-tumorceller inn i det colonic sub-mucosa fra syngene C57BL /6 mus. Gjentatte koloskopi av mottakerens mus avslørte progressive raske utviklingen av svulsten bryte seg inn i tarmlumen spesielt på injeksjonsstedet. Endoskopisk gradering i henhold til tumorstørrelsen i forhold til omkretsen av colon, som etablert av Becker et al [12], viste progressiv tumorvekst fra klasse 1 ved dag 5 til klasse 4 ved dag 12 og opp i grad 5, opptar nesten hele colonic omkrets, med bare dag 19 (figur 1B, og Movie S2). Hematoxyline og eosin (H 0,05) i alle tidspunkter for prosentandelen av colonic omkrets så vel som for svulst klasse. Eksepsjonell var sammenligningen av svulst klasse mellom 10E4 . 10E5 grupper i uke 3 som de fleste av svulster i disse gruppene var allerede klasse 5 som inkluderer alle svulster over 50% av colonic omkrets
(A) Representant koloskopi bilder som viser korrelasjonen mellom mengden av injiserte tumorcellene MC38 og størrelsen av de etablerte CRC tumor 3 uker etter ortotopisk tumorcelle implantasjon. (B) grafiske fremstillinger som oppsummerte vekstkinetikk, omkrets prosent og utviklingsgrad av kolon tumor i korrelasjon med mengden av injiserte MC38 CRC-celler. Legg merke til den raske etableringen av karakteren 5 svulster allerede 2 uker etter implantasjon av kun 1 × 10
5 MC38-CRC celler. Hver gruppe besto av 5 mus.
Kollektivt, vi her etablert en ny fremgangsmåte for effektiv ortotopisk implantering av CRC tumorer ved hjelp av murine endoskopi på en hurtig og minimal invasiv måte, med et begrenset antall celler som kreves for injeksjon, og med en absolutt kontroll på kreft sin forekomst, plassering og vekstkinetikk.
ortotopiske implantasjon av genetisk manipulerte CRC-tumorceller
en av fordelene med kreft implantasjon enn spontane utviklingstumormodeller er evnen til å genetisk modifisere den etablerte tumor. Som et bevis på prinsipp, injiserte vi BALB /c-mus med 1 x 10
5 CT26 murine CRC-celler, som tidligere hadde blitt genetisk manipulert til å uttrykke luciferase. Hele kroppen bioluminesens optisk imaging (Biospace Photon Imager) avslørte eksistensen av en CRC svulst spesielt rundt injeksjonsstedet som kan være ytterligere semi-kvantifisert i henhold til sin slippes luminescens (figur 3A). Spesielt, kan denne tilnærmingen være nyttige for vurdering av tumorbelastninger uten å måtte ofre musene. En ytterligere reell fordel med endoskopisk implantasjon modellen er evnen til å implantere flere tilstøtende ennå forskjellige svulster i den samme mus, som var genetisk modifisert til å over-uttrykke eller stillhet gener som er av interesse, slik at deres direkte sammenligning på en identisk vert miljø. Ved hjelp av en lentiviral reporter system, omformet vi to forskjellige fluorescerende reporter gener i MC38 cellelinje for å etablere MC38-GFP og MC38-RFP linjer (figur 3B øvre venstre panel). Injeksjon av MC38-GFP-celler og ved siden av dem MC38-RFP-celler resulterte i ko-dannelse av to genetisk identiske svulster som bare varierer etter deres plassering og ekspresjon av reportergener innført (figur 3B nedre venstre og høyre panel) .
(A), fargekodet representativt bilde av hele kroppen biolumine optisk avbildning av BALB /c-mus i 2 uker etter sub-slimhinne injeksjon av PBS
– /- (venstre mus) eller 1 x 10
5 CT26 CRC tumorceller uttrykker luciferase og 10 minutter etter ip injeksjon av D-Luciferin. Legg merke til luminescens utslipp spesielt fra området av injiserte CRC tumorceller (høyre mus). (B) Øvre venstre panel – fluorescerende stereo-mikroskopisk bilde kledde på et bilde grafisk bilde av mottakeren C57BL /6 mus kolon 3 uker etter sin orthotopic injeksjon med MC38 CRC celler som var genetisk manipulert av lentiviral reporter system for å uttrykke RFP, forstørrelse x10. Ned venstre panel – koloskopi bilde av C57BL /6 mus kolon følgende orthotopic implantasjon av 2 tilstøtende MC38 CRC tumorceller; MC38-RFP (rød pil) og MC38-GFP (grønn pil). Høyre panel – fluorescerende stereo-mikroskopisk bilde kledde på et bilde grafisk bilde av mottakeren C57BL /6 mus åpnet tykktarm 2 uker etter side-by-side orthotopic injeksjon av MC38-RFP (distal) og MC38-GFP (proksimale) CRC tumorceller, forstørrelse x10. Legg merke til induksjon av 2 tilstøtende CRC svulster som skiller seg bare ved ekspresjonen av transdusert reportergen. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
Vi beskriver her en roman orthotopic murine CRC modell basert på tilpasning av den kommersielt tilgjengelige miniendoscopy system som overfører mange fordeler sammenlignet med kjente murine CRC modeller. Det er en lett å bruke, minimalt invasiv, og meget reproduserbar fremgangsmåte som kan brukes på mus fra en hvilken som helst genetisk bakgrunn. I denne modellen både murine og humane CRC-svulster kan induseres. Modellen gir også nøyaktig kontroll av svulst forekomst og plassering i tykktarmen. I tillegg gir denne fremgangsmåten absolutt kontroll på tumorvekstkinetikk; det kan være veldig rask å nå klasse 5 i 2 uker etter implantasjon av kun 1 × 10
5 tumorceller, eller en kan bremse den ved å injisere lavt antall celler. Viktigere, denne tilnærmingen unngår sivile skader og betennelser sett i mange av de andre tiden ansatt modeller. Videre entydig gjør det induksjon av genetisk manipulerte CRC-tumorer og sammenligningen av flere forskjellige tumorer etablert side-ved-side i den samme mus unngå inter-animalsk variabilitet.
ektopisk subkutan implantasjon av tumorcellelinjer er mye brukt som et forskningsverktøy, særlig for vurdering av cytostatika terapeutiske intervensjoner [17]. Imidlertid ser bort ektopisk implantasjon kompleksiteten av den unike egenskap sammensetningen av den opprinnelige mikromiljøet. Faktisk har det blitt vel etablert at inkongruent vert stroma kan påvirke tumorgenisitet og cellesyklusregulering, sammenlignet med implantering i det native vev sengen [18], [19]. Fordelen med å velge en orthotopic tilnærming er av særlig betydning for tarm miljøet, som er hjemmet til unike immunologiske cellulære og molekylære enheter som befinner seg i kontinuerlig samspill med microbiota og konstituerende eksponering for kosttilskudd antigener.
Utførelse av flere enn 200 ortotopiske CRC implantasjoner benytte denne metoden har sørget for at denne modellen er godt tolerert og reproduserbar. Likevel, en mulig komplikasjon av fremgangsmåten er perforering av tykktarmen og muligens lekkasje av luft og celler til bukhulen. For tiden er i våre hender, er denne komplikasjonen sjeldne, utgjør mindre enn 5 prosent av alle prosedyrer. Dødelighet under prosedyren er svært sjelden, og kan skje som følge av anestesi eller perforasjon. Tumor forekomst i overlevende mus (95%) er 100%, alltid kulminerte i en eneste svulst utvikling spesielt på injeksjonsstedet. Av notatet, tillater bruk av en stiv ramme adgang bare til den distale halvdel av tykktarmen og således begrenser ortotopisk implantasjon med denne tilnærming til dette området.
CRC er fortsatt den andre ledende årsaken til dødelighet i kreft mange industrialiserte land. Eksperimenter utført i små dyr har vist seg å være avgjørende for forståelsen av patofysiologien av sykdommen, så vel som for preklinisk evaluering av nye terapeutiske modaliteter. Ikke desto mindre er murine modeller CRC er begrenset i deres likhet med humane sykdommer. Dette gjelder spesielt når det gjelder dannelsen av CRC tumormetastaser. En viktig ulempe med CRC murine modeller er den generelle mangelen på invasiv og metastatisk fenotype [2]. I AOM /DSS modell infiltrerende snorer av epitelceller ble beskrevet å bryte muskularis slimhinner og nå også underslimhinne lymfesystemet, selv om svært sjelden [20]. På samme måte vi sjelden vitne lokal invasivitet av tumor-avledet celler, men aldri oppdage distal metastaser ved hjelp av vår tilnærming. De relativt rask vekst kinetikk i forbindelse med vår modell, som tvinger tidlig offer implantert mus omsorg karakteren 5 CRC svulst, er trolig bli en ulempe for induksjon av en metastatisk svulst. Ja, selv ortotopisk implantasjon av humane CRC-celler, er kjent for å være aggressivt metastatisk, klarte ikke å indusere en metastatisk svulst. Den vanlige hindring deles av murine CRC modeller for å etablere en metastatisk svulst kan tyde på at tarm murine miljøet er ikke støttende av metastaser formasjon. Likevel kan dette være slå inn en ønsket modellsystem for de som ønsker å undersøke den potensielle rolle maligne gener. Til støtte for dette, kan systemet vårt brukes til å indusere dannelsen av genetisk manipulerte svulster der vi over uttrykte eller stillhet gener av interesse.
Vi tror at denne nye orthotopic CRC modell representerer et stort teknisk fremskritt for
i-vivo
studie av CRC, og kan særlig brukes til å undersøke nye behandlingsformer, tumor genetikk og vekstmekanismer, og dens interaksjoner i sammenheng med det naturlige tarmmikromiljøet.
Metoder
Etikk erklæringen
Alle dyrestudier ble godkjent av Tel Aviv Sourasky Medisinsk senter etisk komité for dyrestudier og dannet til de høyeste internasjonale standarder for human behandling av dyr i biomedisinsk forskning. Komiteen godkjenningsnummer -. 037_b3428_8
Dyr
8-10 uker gamle hanner C57BL /6, Balb C og atymiske nakne mus ble hentet fra Harlan biotech (Rehovot, Israel). 8-10 uker gamle hanner NOD SCID-mus ble vennlig levert av prof. Tsvee Lapidot (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel).
atymiske nakne mus ble under lethaly bestrålt (450 rad) før orthotopic implantasjon av menneskelige CRC cellelinjer for å eliminere immun-avvisning. Dyr hadde fri tilgang til mat og vann, ble plassert i temperatur og fuktighetskontrollerte rom, og ble holdt på en 12-timers lys /mørke syklus.
Colo-rektal tumorceller
Murine C57BL /6 CRC tumorceller (MC38) ble vennlig levert av Dr. Avi Eisenthal (Tel Aviv Sourasky Medical Center). Luciferasepreparater stably- transfekterte muse CRC tumorceller (CT26) ble vennlig levert av Prof. Lea Eisenbach (Weizmann Institute of Science Rehovot, Israel). De menneskelige CRC tumorcellelinjer SW620, SW480 og LS174T ble vennlig levert av prof. Zelig Eshhar (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel). HT-29 human CRC cellelinjen var den generøse gaven av Dr. Isabel Zvibel (Tel-Aviv Sourasky Medical Center, Tel-Aviv, Israel). Alle cellelinjer ble holdt i 5% CO
2 ved 37 ° C i høy glukose DMEM-medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin streptomycin antibiotisk oppløsning, 1% L-Glutamin-oppløsning, og 1% natrium pyruvat løsning.
Generering av MC38 CRC tumorceller uttrykker GFP eller RFP
MC38-GFP og MC38-RFP CRC tumorceller ble generert ved transduksjon med pCSC-SP-PW-IRES-GFP /RFP lentiviruses designet for å uttrykke GFP eller RFP med MOI av 50 (vennlig levert av Dr. Alon Chen, Weizmann Institute of Science Rehovot, Israel). Deretter ble MC38 celler som uttrykker GFP eller RFP sortert til høy renhet ved hjelp av en høyhastighets FACSAria II sorter (Beckton-Dickinson).
Murine endoskopisk system
Vi ansatt en høyoppløselig mus video endoskopisk system ( » Coloview system ») som tidligere er beskrevet for murine endoskopiske prosedyrer [12] – [14], som består av en miniatyr endoskop (scope 1,9 mm ytre diameter), en xenon-lyskilde, en trippel chip kamera, og en luftpumpe for å oppnå regulert inflasjon muse tarmen (Karl Storz, Tuttlingen, Tyskland). Den endoskopisk prosedyre ble vist på en fargeskjerm og digitalt innspilt på bånd.
ortotopiske colonic under mucosal implantasjon av CRC celler
Mus ble bedøvet ved hjelp Ketamin /xylazin. Underslimhinne injeksjoner ble utført ved hjelp av rustfritt fleksibel rustfritt stål; 8 tommer lang, 30 sporvidde og 45 graders skrå sprøyte nåler skreddersydd i henhold til vår spesifikasjonen (Cadence Inc. U.S.A.). Nålen ble satt inn gjennom Luer lock (Söllner, GmbH) skrudd på arbeidskanalen av omfanget for å unngå luftlekkasje. Deretter ble omfanget innsatt i mus tykktarm og etter at den inflasjon nålen ble ført gjennom arbeidskanalen til omfanget front. CRC celle implantasjon fremgangsmåten ble utført ved to koordinerte personer; en person var navigering koloskopi mens den andre personen ble opererer injeksjons manøver. Injeksjonen ble utført under observasjon av en meget mild sub-slimhinne penetrasjon med den åpne side av den skrå posisjon opp i en flat vinkel. Et volum på 50 mikroliter CRC svulster cellene ble deretter injisert i colonic underslimhinnen.
In-vivo
bildebehandling
Hvis du vil følge luciferase-uttrykke CT26 CRC svulst implantasjon og vekst i BALB /c-mus, 50 pl D-Luciferin (30 ug /ml) var ip injisert 10 minutter før og deretter mus ble satt inn i det lukkede mørke kammeret av hele kroppen avkjølt CCD-kamera Photon Imager system (Biospace Lab, Frankrike) . For
in vivo
visualisering av GFP og RFP positive tumorer Leica MZ16F fluorescerende stereomikros systemet ble brukt (Leica Microsystems, Tyskland).
Histologi
Vev ble fiksert i 4% paraformaldehyde natten ved 4 ° C, innstøpt i parafin, serielt seksjonert (15 mikrometer), og farget med hematoxylin og eosin (Sigma).
Lysbilder ble observert ved hjelp av Olympus BX51 mikroskop og bilde oppkjøpet ble gjennomført med Olympus DP70 kamera og DP-manager.
CRC tumorvekst kinetikk
C57BL /6 mus ble orthotopically sub-slimhinnene injisert med 10
3, 10
4, eller 10
5 MC38 celler. Svulsten er colonic omkrets og utviklingsstadiet ble overvåket over tid ved koloskopi hver uke i 3 uker etter celle implantasjon. Endoskopisk gradering ble utført i henhold til tumorstørrelsen i forhold til omkretsen av tykktarmen som er fastsatt av Becker et al [12]. Kort sagt, ble tumorstørrelse gradert slik: Grad 1 (bare påvisbar tumor), grad 2 (tumor dekker opp til 1/8 av colonic omkrets), grad 3 (tumor dekker opp til 1/4 av colonic omkrets), Grade 4 (tumor dekker opp til 1/2 av colonic omkrets) og 5. klasse (svulst som dekker mer enn 1/2 av colonic omkrets).
Statistical Analysis
resultatene ble analysert ved enveis ANOVA og etter analyse med Bonferroni er flere sammenligningstester.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Spesielt tilpasset sprøyte nåler som brukes til å orthotopically injisere tumorceller til colonic sub-mucosa. De sprøyte nåler er laget av åtte tommers lang fleksibel rustfritt stål, med 30 sporvidde ytre diameter, og en kort skråkant i en 45 graders engel. Merk at nålen er satt inn gjennom Luer lock som senere skrudd på arbeidskanalen til endoskopet for å unngå luftlekkasje
doi:. 10,1371 /journal.pone.0028858.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Underslimhinne injeksjoner av PBS
– /- og tusj. Representative bilder av histologiske prøver farget med hematoxyline og eosin (H E) og isolert fra tarminjeksjonsstedet på dag 5 etter injeksjon av 50 ul (A) tusj (Forstørrelse X40), (B) India blekk (Forstørrelse x100), (C) PBS
– /-, merk normal sunn arkitektur i tykktarmen. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0028858.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
ortotopiske induksjon av menneskelige CRC svulster i immuno-mangelfull mus. (A) Representative bilder av histologiske prøver farget med hematoxyline og eosin (H E) og isolert ved dag 35 etter ortotopisk injeksjon (2 x 10
5 celler hver) av de humane CRC-cellelinjer: SW620, SW480, LS174T og HT29 i NOD /SCID eller sub-lethally bestrålte nakne mus. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (B) Histo-patologisk sammenligning mellom menneske CRC svulster fastsatt av orthotopic implantasjon av SW620, HT29, og LS174T inn immun-mangelfull mus og menneskelige tykktarms adenokarsinom
doi:. 10,1371 /journal.pone.0028858.s003
(TIF)
Movie S1.
Endoskopisk levende avbildning av under mucosal injeksjon av India blekk fargestoff. Representant endoskopisk video bildebehandling viser prosedyren for India-blekk fargestoff injeksjon i colonic under slimhinnene i C57BL /6 mus ved hjelp av musen koloskopi system. Merk midt sub-epitelial fordeling av injisert fargestoff og dens gjenværende etter colonic spyling
doi:. 10,1371 /journal.pone.0028858.s004 plakater (WMV)
Movie S2.
Endoskopisk levende avbildning av den progressive lokaliserte veksten av en CRC-tumor etter sin orthotopic implantasjon. Endoskopisk videoavbildning som viser ortotopisk implantasjon av CRC-tumorceller og den progressiv vekst av det resulterende tumor, spesielt på injeksjonsstedet, og på forskjellige tidspunkter i løpet av den samme mottaker
doi:. 10,1371 /journal.pone.0028858.s005 product: (WMV)
takk
Vi vil gjerne dypt takke Elinor Elmaliah for vev kultur assistanse, Michael Kaplan for husdyrhold, Elias Shezen for histologisk arbeid, og ido Kilemnik (CEO Medi -Tate, Israel) for hans generøse bidrag i utformingen av sprøytespisser. Vi ønsker også å takke Prof. Lea Eisenbach og Prof Zelig Eshhar (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) for CT26-luciferase murine CRC cellelinje og SW480, SW620 LS174T menneskelige CRC cellelinjer, henholdsvis.
