Abstract
Klinisk bevis tyder på at lymphangiogenesis og lymfatiske metastaser er viktige prosesser i løpet av utviklingen av prostatakreft. Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) -C ble vist å være en viktig regulator i disse prosessene. Våre tidligere undersøkelser vist at lysofosfatidisk syre (LPA), en lav-molekylvekt-lipid vekstfaktor, forbedrer VEGF-C-ekspresjon i humane endotelceller. Vi har tidligere vist at LPA-reseptoren spiller en viktig rolle i utvikling lymfatisk i sebrafisk embryoer. Imidlertid er virkningene av LPA på VEGF-C-ekspresjon i prostatakreft ikke kjent. Heri, viser vi at LPA oppregulert VEGF-C uttrykk i tre forskjellige menneskelige prostata kreft cellelinjer. I PC-3 human prostatacancerceller, ble det forsterkede effektene til LPA mediert gjennom både LPA1 og LpA3. I tillegg ble det reaktive oksygenarter (ROS) produksjon og linse epitel-avledet vekstfaktor (LEDGF) ekspresjon er involvert i LPA
1/3-avhengige VEGF-C-uttrykk. Videre autotaxin (ATX), et enzym som er ansvarlig for LPA syntese, deltar også i regulering av VEGF-C-uttrykk. Ved å avbryte LPA
1/3 av PC-3, kondisjonert medium (CM) indusert menneskelige navleveneendotel celle (HUVEC) lymfatiske markører uttrykk ble også blokkert. I sammendraget, fant vi at LPA forbedrer VEGF-C uttrykk gjennom aktivering LPA
1/3, ROS- og LEDGF-avhengige veier. Disse nye funnene kan potensielt kaste lys på å utvikle nye strategier for å forebygge lymfatisk metastaser fra prostatakreft
Citation. Lin C-E, Chen S-U, Lin C-C, Chang C-H, Lin Y-C, Tai Y-L, et al. (2012) lysofosfatidisk Acid Forbedrer vascular endothelial growth factor-C Expression i Human Prostate Cancer PC-3 celler. PLoS ONE syv (7): e41096. doi: 10,1371 /journal.pone.0041096
Redaktør: Masuko Ushio-Fukai, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 9 april 2011; Godkjent: 21 juni 2012; Publisert: 20.07.2012
Copyright: © 2012 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskningen ble støttet med tilskudd (NSC97-2311-B-002-002-My3, NSC 99-2120-M-002-004 og NHRI 101-EX101-10130BI) fra National Science Council og National Health Research Institutes of republikken Kina . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en av de hyppigst forekommende kreftformer hos menn. Progresjonen av svært metastatisk prostatakreft involverer prosesser, for eksempel tap av celle-adhesjon, forbedret lokal invasjon, angiogenese, og lymphangiogenesis [1]. Lymphangiogenesis ble nylig funnet å spille en viktig rolle i prostata cancer metastase, og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) -C er en stor lymphangiogenic regulator. VEGF-C binder til VEGF-reseptor (VEGFR) -3 og aktiverer lymphangiogenesis-assosierte signalveier [2]. Mye kliniske bevis avdekket en sammenheng mellom VEGF-C uttrykk og regional lymfeknutemetastase i prostatakreft [3], [4]. Over-uttrykke VEGF-C i LAPC-9 prostatakreftceller forbedret svulst lymfatisk metastase [5]. I CWR22Rv-en prostatakreft-cellelinje, celler som over-uttrykker VEGF-C oftere spredning til lymfeknutene og lungene. Men frekvensen av tumorvekst og angiogenic oppførsel ble ikke påvirket av over-uttrykk for VEGF-C [6]. Wu et al. i 2008 viste også at en VEGF-C ligand felle og VEGFR-3 antistoff betydelig redusert prostatakreft lymphangiogenesis og metastaser til lymfeknuter og fjerntliggende organer. Alle disse resultatene tyder på at lymphangiogenesis medierer prostata cancer metastase.
lysofosfatidisk syre (LPA) er en lav-molekylvekt-lipid vekstfaktor som binder seg til EDG familien G-protein-koblede reseptorer (GPCR) og regulerer flere cellulære funksjoner [7], [8]. LPA syntetiseres ved enzymatisk spaltning av membranen fosfatidinsyre. Når en inflammatorisk respons utløses, er LPA løslatt fra blodplater og induserer flere cellulære responser som celle migrasjon, spredning, og sårtilheling [9]. I tillegg har kreftceller over-uttrykker LPA-reseptorer også oppviste økt tumorinvasjon og metastase [10]. Svitsje ekspresjon av LPA
1 og LPA
3-reseptorer er funnet å være forbundet med prostatakreft utvikling [11]. I prostatakreft-cellelinje, stimulerer LPA PC-3-celler motilitet gjennom LPA
1 [12]. I tillegg beskytter LPA PC-3 fra sult-avledet apoptose gjennom en nukleær faktor (NF) -κB-avhengige reaksjonsveien [13]. Alle disse resultatene tyder på at LPA spiller viktige roller i utvikling og progresjon av prostatakreft.
Autotaxin (ATX) er et 125 kDa glykoprotein som tilhører ectonucleotide Pyrophosphatase /fosfodiesterase (ENPP) familie som har evnen å hydrolysere fosfodiesterbindinger
in vitro
. I tillegg ble ATX også rapportert å ha lysophospholipase D (LysoPLD) enzymatisk funksjon, som hydrolyserer lysofosfatidylcholin (LPC) for å generere LPA [14], [15]. I ATX-over-uttrykke transgene mus, er tilstrekkelig til å igang tumorgenese og generere svært metastatisk kreft [16] brystepitel. I tillegg, i kliniske prostatakreft studier ble høy uttrykk nivåer av ATX assosiert med både ondartede potensialer og dårlige resultater [17].
Det ble rapportert at etter serum deprivasjon, VEGF-C messenger (m) RNA uttrykk kreftceller ble forbedret ved behandling med 10% serum. Disse resultatene tyder på at det er en serumfaktor som regulerer ekspresjonen av VEGF-C [18]. I tillegg, etter banket ned zLPA
1 i sebrafisk, embryonale thorax kanal utvikling var defekt [19]. I menneskelige navleveneendotel celler (HUVECs), kan LPA indusere tube dannelse og lymfatiske markør uttrykk gjennom LPA
1/3 [20], [21]
. Disse resultatene tyder på at LPA-avledede signaler som er nødvendige for lymfatiske kar utvikling. Men rollene til LPA i lymphangiogenesis indusert av kreftceller forblir usikre.
I våre dagens resultater, viser vi at LPA oppregulert VEGF-C mRNA i ulike menneskelige prostata kreft cellelinjer. Ved å bruke en LPA
1/3 antagonist, vi vist at disse styrke virkninger i PC-3 celler var LPA
1 og LPA
3 avhengig. Videre ROS generering og transkripsjonsfaktor, epitel linse-avledet vekstfaktor (LEDGF), var involvert i LPA regulering av VEGF-C-uttrykk. ATX, et enzym som er ansvarlig for LPA generasjon, reguleres også VEGF-C-ekspresjon og sekresjon. Bruke HUVECs, viser vi at betinget media (CM) fra PC-3 celler forbedret uttrykk for lymfatiske markører som Prox-en og LYVE-1. I tillegg forbehandling med Ki16425, LPA
1/3 antagonist blokkerte forsterke virkningene av disse CM. Våre resultater tyder på at LPA og ATX regulere VEGF-C uttrykk i prostatakreftceller, og det kan føre til lymphatic metastasering. Derfor kan det hende at blokaden av LPA og VEGF-C signale være en effektiv strategi for prostata kreft behandling.
Resultater
LPA Stimulerer VEGF-C uttrykk på forskjellige Prostate Cancer Cell Lines
for å undersøke om LPA er en stimulator for VEGF-C uttrykk i prostata kreft, valgte vi LNCaP, DU145, og PC-3 menneskelige prostata kreft cellelinjer for å teste muligheten. LNCaP er en androgen-avhengig og lav metastatisk prostatakreft-cellelinje. I motsetning til dette, DU145 og PC-3 er begge androgen-uavhengig og svært metastatisk. Alle tre cellelinjer ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av LPA, og RNA-prøver ble samlet inn. Fra sanntids-PCR-analyse, har vi funnet at LPA stimulert VEGF-C transkripsjon på en doseavhengig måte i alle tre prostatakreft-cellelinjer (Fig. 1 A-C). Vi brukte PC-3 celler for å analysere hvorvidt LPA forbedrer VEGF-C protein uttrykk og påfølgende sekresjon. For å bestemme den translasjonelle nivået av VEGF-C, ble PC-3-celler behandlet med LPA, og cellelysater ble oppsamlet ved hjelp av RIPA-buffer. Cellelysater ble løst med SDS-PAGE og oppdaget med en VEGF-C antistoff. Intracellulære VEGF-C-proteinnivåer ble forbedret med 1 og 5 uM LPA behandling (Fig. 1D). For å bestemme VEGF-C-sekresjon, ble PC-3-celler behandlet med 5 uM LPA i 12 timer, og kondisjonert medium ble oppsamlet. Det kondisjonerte mediet ble analysert ved hjelp av en VEGF-C ELISA kit. Vi fant ut at LPA stimulerer også VEGF-C sekresjon (Fig. 1E).
LPA-forbedret VEGF-C Expression er formidlet gjennom LPA
1 og LPA
3 i PC-3 celler
i prostatakreftceller, reseptorer LPA 1-3 uttrykk profiler er godt studert og er tenkt å assosiere med prostatakreft utvikling og progresjon. Men i forskjellige prostatakreft-cellelinjer, forskjellige profiler av LPA-reseptorer er forskjellige. PC-3 celler uttrykker den høyeste LPA
1 uttrykksnivået og den laveste LPA
3 uttrykk nivå mens sammenlignet med LNCaP og DU145. I motsetning til dette, LNCaP-celler uttrykker det høyeste nivå av LPA
3, og det laveste nivået av LPA
1 blant de tre prostatakreft-cellelinjer [11]. I vår forrige undersøkelse, LPA
1/3 er ansvarlig for LPA forbedret VEGF-C uttrykk i HUVEC celler [20]. Derfor må vi først brukt Ki16425, en antagonist for LPA
1 og LPA
3, for å finne ut om disse to lysofosfatidisk reseptorene er ansvarlig for LPA effekt på VEGF-C uttrykk i prostatakreftceller. I forrige undersøkelse, har Ki16425 allerede vist seg å være i stand til å blokkere ATX indusert motilitet i PC-3 celler [12]. Etter Ki16425 behandling ble forsterke effekten av LPA på VEGF-C-ekspresjon betydelig redusert i LNCaP, DU145 og PC-3-celler (fig. 2A). For ytterligere å bekrefte observasjon, ble PC-3 celler transient transfektert med enten LPA
1 eller LPA
3 siRNA. LPA1-3 uttrykk profilen ble testet i LPA1 og LpA3 forbigående knockdown celler. Våre resultater foreslo siRNA sekvens valgte vi kunne bestemt mål LPA
1 og LPA
3 reseptor uten å avbryte de to andre reseptorer (Fig. 2B). Under 10% FBS RPMI i kultur, basal mRNA-nivåer av VEGF-C i LPA
en eller LPA
3 knockdown-celler ble begge redusert med 51% og 37% hver for seg. I RPMI bare kultur, basal mRNA-nivåer av VEGF-C i LPA
en eller LPA
3 knockdown-celler ble begge redusert med 58% og 36% henholdsvis i forhold til egge siRNA transfeksjon kontrollceller (Fig. 2C). Dette innebærer at LPA er en stor induser av VEGF-C i serum. Videre kan celle avledet LPA også være en regulator for VEGF-C i PC-3 celler. Ved direkte behandling med LPA, vi også observert at LPA-forbedret VEGF-C uttrykk ble redusert i PC-3 celler transient transfektert med enten LPA
1 eller LPA
3 siRNA (Fig. 2D). Resultatene antydet at både LPA
1 og LPA
3 er involvert og kritisk i å kontrollere VEGF-C uttrykk
. Dessuten er det betydelige forskjeller mellom vekstraten til LPA
1, LPA
3 knockdown celler og kontrollceller under LPA og serum behandling (fig. S1).
(A, B og C ) Den LNCaP, DU145 og PC-3 human prostatacancercellelinjer ble behandlet med forskjellige doser LPA i 2 timer. mRNA ble reverstranskribert og analysert ved hjelp av en sanntids-PCR. Den relative nivået av VEGF-C normalisert til GAPDH vises. (D) PC-3-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av LPA i 4 timer. Cellelysater ble oppløst ved 12% SDS-PAGE og analysert med Western blotting ved å bruke en anti-VEGF-C-antistoff. GAPDH tjente som lasting kontroll. (E) PC-3-celler ble behandlet med 5 uM LPA i 12 timer. Det kondisjonerte medium ble oppsamlet og målt med en VEGF-C ELISA kit. * Statistisk forskjellig i forhold til kjøretøy inkuberes prøven behandles med LPA (*
p
0,05).
(A) LNCaP, DU-145 og PC-3 celler behandlet med 10 uM Ki16425, en antagonist av LPA
1 og LPA
3, etterfulgt av 5 uM LPA i 2 timer (L5: 5 uM LPA). Relative VEGF-C-mRNA-nivåer ble målt. (B) PC-3 celler ble transient transfektert med LPA
1 og LPA
3 siRNA. (C) Den basale VEGF-C-mRNA-ekspresjon i PC-3-celler transfektert med LPA
en eller LPA
3 siRNA ble målt i en 10% FBS og uten serum betinget cellekultur. (D) PC-3-celler transfektert med LPA
1 og LPA
3 siRNA ble behandlet med LPA, og VEGF-C-mRNA ble målt. mRNA ble reverstranskribert og analysert ved hjelp av en sanntids-PCR. De relative nivåer av VEGF-C normalisert til GAPDH og β-aktin er vist. * Statistisk forskjellig i forhold til kjøretøy inkuberes prøven behandles med LPA (*
p
0,05; **
p
0,01; ***
p
0,05)
LPA
1/3 formidler VEGF-C Expression gjennom inducing. LEDGF
Lens epitel-avledet vekstfaktor (LEDGF /p75) ble identifisert som en stress-respons protein indusert av serum fratatt sult, termisk stress, og oksidativt stress [24], [25]. I prostatakreft, ble LEDGF videre identifisert som en resistens genet for å dempe Docetaxel-indusert caspase og lysosomale trasé [26]. Nylig, oksydativt-og termisk stress-fremkalt VEGF-C transkripsjon ble funnet å være formidlet av LEDGF i lungekarsinom [22]. Videre er gonadotropin-regulert lymphangiogenesis også formidlet av LEDGF-indusert VEGF-C uttrykk i eggstokkreft [27]. Så, hypotese vi at LPA-indusert VEGF-C uttrykk formidles gjennom LEDGF. Våre resultater viste at LPA indusert LEDGF mRNA og protein ekspresjon (Fig. 4A, 4B). Videre våre resultater viste at LPA indusert LEDGF mRNA er forbigående og raskt avvist. Resultatene sterkt antydet at en post-transkripsjon mekanisme kan også være involvert i å opprettholde LPA indusert LEDGF protein ekspresjonsnivå. Forbehandling med Ki16425 og NAC helt blokkerte styrke effekten av LPA på LEDGF uttrykk (Fig. 4C, 4D), noe som tyder på involvering av LPA
1/3 reseptorer og ROS. I tillegg ble LEDGF siRNA transfektert inn i PC-3-celler for å bekrefte hvorvidt LEDGF er involvert i LPA-indusert VEGF-C-ekspresjon (fig. 4E). Resultatene tydelig vist at LEDGF er nødvendig for forsterkningseffekten av LPA på VEGF-C-ekspresjon (fig. 4F).
PC-3-celler ble behandlet med LPA og mRNA (A) og protein (B) ekspresjonsnivåer av LEDGF ble bestemt. LEDGF proteinm ble samlet etter to timers LPA behandling. Forbehandling med 10 uM Ki16425 og 10 mM NAC i 1 time og undertrykket effektene av LPA (L5: 5 uM LPA) på LEDGF uttrykket (C og D). LEDGF siRNA ble transfektert inn i PC-3-celler (E) og undertrykket LPA største effekter på VEGF-C uttrykket (F). mRNA ble reverstranskribert og analysert ved hjelp av en sanntids-PCR. De relative nivåer av LEDGF og VEGF-C normalisert til GAPDH er vist. * Statistisk forskjellig i forhold til kjøretøy inkuberes prøver behandlet med LPA (*
p
0,05; **
p
0,01; ***
p
0,001).
Blokkering av LPA
1/3 Receptor og knockdown av ATX Expression Reduser VEGF-C transkripsjon og sekresjon av PC-3 celler
LPA er høy konsentrasjon serum og blodplater; imidlertid mange rapporter viste at brystkreft, gliom, og prostatakreft kan selv syntetisere LPA og fremme tumorprogresjon [28], [29], [30]. ATX er en lysoPLD-hydrolyserende LPC som genererer LPA. LPA utskilt av ATX øker invasivitet og progresjon av brystkreft. I hjernesvulst, lysoPLD aktivitet ATX også fremmer kreft celle adhesjon og invasivitet. Basert på disse tidligere rapporter, ble vi også prøver å finne ut om prostata kreft celler syntetiserte ATX kan selv regulere VEGF-C uttrykk. Derfor ble PC-3-celler dyrket i RPMI-1640-medium bare for å unngå en serum effekt. Ved å blokkere LPA
1/3 med Ki16425, ble basal VEGF-C-mRNA (fig. 5A) og sekresjon (fig. 5B) i PC-3-celler i betydelig grad redusert. Disse resultatene antydet at LPA skilles ut av PC-3 celler aktiveres LPA
1/3 og derfor regulert VEGF-C uttrykk. Videre ATX siRNA og dens inhibitor, S32826 [31] (fig. 5C, 5D), ble anvendt for å bestemme om ATX er involvert i regulering av VEGF-C. Resultatene viste at nedregulering av ATX genekspresjon og aktiviteter redusert VEGF-C-mRNA (fig. 5C, 5D) og sekresjon (fig. 5E). Resultatene tyder på at ATX er involvert i selvregulerende VEGF-C-ekspresjon i prostatakreftceller.
Etter 16 timer av sult, ble PC-3-celler behandlet med 10 uM Ki16425 i RPMI1640 med 0,005% fettsyre BSA for 8, 12, 24 og 48 timer. Det relative nivå (A) og sekresjon konsentrasjon av VEGF-C-mRNA (B) i prøvene ble bestemt. Videre ble PC-3 celler transfektert med ATX siRNA i 24 timer for å slå ned på ATX-genet. PC-3-celler ble dyrket i RPMI-1640 med 0,005% fettsyrefri BSA i ytterligere 24 timer, og prøven RNA ble oppsamlet. I tillegg inhibitor, S32826, ble også brukt til å inaktivere ATX aktivitet i 12 timer. ATX og VEGF-C mRNA uttrykk (C og D) ble målt. Ved å følge den samme protokoll, ble PC-3-celler transfektert med ATX siRNA og behandlet med S32826 sultet og dyrket i RPMI-1640 med 0,005% fettsyrefri BSA i 48 timer. VEGF-C sekresjon konsentrasjoner (E) av prøvene ble bestemt. Prøve mRNA ble revers-transkribert og analysert av en real-time PCR. Relative nivåer av gener normalisert til p-aktin er vist. VEGF-sekresjon C-konsentrasjoner ble målt ved en ELISA. * Statistisk forskjellig i forhold til kjøretøy inkuberes prøven behandles og transfektert med Ki16425 og ATX siRNA (*
p
0,05; **
p
0,01; ***
p
. 0,001)
ved å avbryte LPA
1/3 av PC-3, kondisjonert medium (CM) indusert HUVEC lymphatic Marker Expression ble blokkert
for å etterligne mikro mellom prostatakreftceller og endotelceller, brukte vi HUVECs som en modell for å undersøke mekanismer som prostatakreftceller induserer lymphangiogenesis. HUVECs ble behandlet med fortynninger av PC-3 CM. Uttrykket nivåer av lymfatisk markører, inkludert Prox-en og LYVE-1 ble oppregulert i HUVECs (Fig. 6A) etter CM behandling. For å avgjøre om VEGF-C utskilles av prostata kreft celler er nødvendig for å stimulere lymfesystemet markører, PC-3 celler stabilt transfektert med VEGF-C shRNA ble valgt (Fig. 6B). Ved hjelp av CM fra VEGF-C knockdown PC-3 celler til å behandle HUVECs ble lymfatisk markør uttrykk i HUVECs betydelig redusert i forhold til vektor kontrollgruppe CM (Fig. 6C). Dette resultatet indikerer at VEGF-C er viktig for å utløse lymfatisk markør ekspresjon av PC-3-celler. Våre resultater er i samsvar med tidligere funn om at VEGF-C spiller en nøkkelrolle i prostatakreft-indusert lymphangiogenesis. Videre forbehandlet vi PC-3 celler med Ki16425 før innsamling av CM (Fig. 6D). Resultatene viste at ved å avbryte den LPA
1/3, kapasiteten av PC-3-CM til å indusere lymfatiske markør ekspresjon ble redusert med 32% i forhold til kontrollgruppen. Imidlertid forbehandling av HUVECs med Ki16425 påvirket ikke induksjon av lymfatiske markør uttrykket (fig. 6D), som tyder på at den induserende evne i CM er sannsynligvis på grunn av VEGF-C. For ytterligere å klargjøre rollene til LPA
1 og LPA
3 i PC-3
, samlet vi kondisjonert medium fra LPA
1 eller LPA
3 midlertidig knockdown celle til å behandle HUVEC celler. I våre resultater, klimaanlegg media fra LPA
1 eller LPA
3 knockdown celler hatt begrenset kapasitet til å indusere lymfatisk markør uttrykk i HUVEC (Fig. 6E).
(A) PC-3 celler dyrket i RPMI-bare medium i 24 timer etter at 16 timer av sult. Den 24 h CM ble oppsamlet og fortynnet for å behandle HUVECs i 4 timer. Etter behandling, ble HUVEC lymfatisk markør ekspresjon observert. (B) PC-3-celler stabilt transfektert med VEGF-C shRNA ble testet for VEGF-mRNA C og sekresjon uttrykk. (C) VEGF-C knockdown PC-3-CM ble brukt til å behandle HUVECs følge fremgangsmåten beskrevet ovenfor. (D) PC-3-celler ble behandlet med 10 uM Ki16425 mens den er dyrket i RPMI-medium kun i 24 timer før CM ble brukt til å behandle HUVECs. Ki16425 ble også brukt til å teste om LPA eksisterende i PC-3 CM er avgjørende for HUVEC lymfatisk markør regulering. Ki16425 (10 uM) ble forhåndsbehandlet i 1 time før PC-3 CM behandling av HUVECs. (E) CM fra PC-3-celler transfektert med LPA
en eller LPA
3 siRNA ble brukt til å behandle HUVEC-celler som fremgangsmåtene beskrevet ovenfor. Prøve mRNA ble revers-transkribert og analysert av en real-time PCR. Relative nivåer av gener normalisert til GAPDH og β-aktin er vist. * Statistisk forskjellig i forhold til kjøretøy inkuberes prøver og prøver behandlet med PC-3 CM (*
p
0,05; **
p
0,01; ***
p
. 0,001)
Diskusjoner
i denne studien undersøkte vi rollene til LPA i regulering VEGF-C uttrykk i prostatakreft. Våre resultater viste tydelig at LPA indusert VEGF-C uttrykk i ulike prostatakreftcellelinjer. LPA
1 og LPA
3 ble begge identifisert som å være involvert i LPA-indusert VEGF-C signalveien. For nedstrøms signaler, ble LPA-indusert ROS produksjon og LEDGF uttrykk identifisert som deltar i reguleringen av VEGF-C. Videre ATX genet knockdown redusert basal VEGF-C uttrykk. Dette indikerer at LPA og ATX er begge viktige for regulering av VEGF-C-ekspresjon i prostatakreftceller.
lysophospholipids ble foreslått for å fremme prostatakreft progresjon. LPA induserer PC3 cellemigrering gjennom LPA
1, p42 og p38 alfa trasé og fremmer også Matrigel invasjon [32]. Nylig, det viser også at CD97 heterodimerized og funksjonelt synergized med LPA
1 implisere i kreft progresjon [33]. Dessuten, LPA indusert prostatakreft overlevelse og invasjon er blitt vist å assosiere med kalpain-formidlet proteolyse av FAK [34]. Videre er VEGF uttrykk aktiveres ved LPA gjennom aktivering av hypoksi-induserende faktor (HIF) -1α uttrykk i PC-3 celler [35]. Imidlertid er rollen til LPA i prostatakreft-indusert lymphangiogenesis fortsatt dårlig forstått.
VEGF-C er ansett som en nøkkel lymphangiogenic faktor i å initiere lymphangiogenesis og lymfatiske metastaser i prostatakreft. I LNCaP-celler, ble VEGF-C er identifisert å være negativt reguleres av androgen inn i insulin-lignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF-IR) og FOXO sti [36]. I tillegg, med androgen-ablasjon, stimulerer Rala VEGF-C-syntese ved å øke ROS generasjon [23]. Siden Rala aktivering utløses av LPA
1 i HEK293 celler [37], er forholdet mellom LPA reseptor aktivering og androgen effekter om regulering av VEGF-C verdig videre undersøkelser. Våre resultater antydet at både LPA
1 og LPA
3 er ansvarlig for LPA-indusert VEGF-C uttrykk. Videre, i LPA
1 og LPA
3 stabilt slått ned PC-3 celler, basal VEGF-C genekspresjon ble vist å ha avslått. I vår nylig publisert studie, LPA-indusert VEGF-C og lymphangiogenesis i HUVECs var også LPA
1 og LPA
3 avhengig [38]. Disse resultater antyder at aktivering av LPA
1 og LPA
3 regulerer VEGF-C-ekspresjon i både kreft og endotelceller.
I prostatakreft, VEGF-C oppregulering ble vist å være assosiert med ROS generasjon [22], [23]. Resultatene antydet en rolle ROS i LPA-indusert VEGF-C uttrykk. Våre resultater viste at ROS-generasjon ble indusert ved LPA og deltar i LPA-indusert VEGF-C transkripsjon. Videre er LEDGF, en transkripsjonsfaktor aktivert av ROS, er involvert i LPA-indusert VEGF-C-uttrykk. I klinisk forskning, ble LEDGF uttrykk forhøyet hos 93% av kliniske prostata tumorprøver, og det svekket docetaxal-indusert celledød [39]. Heri viste vi at LEDGF ekspresjon ble indusert ved LPA behandling i en LPA
1/3-avhengig måte. Disse resultatene støtter videre LPA være en viktig regulator i prostata kreft progresjon.
Expression nivåer av ATX, en LPA-produserende enzym, er høyere i androgen-uavhengig prostatakreftceller [40]. I tillegg kliniske data indikerer at ca 50% av prostatakreftpasienter viste sterkt uttrykk for ATX. Videre er ATX ekspresjonsnivået ble signifikant korrelert med den primære Gleason grad av kreft foci og tilstedeværelsen av prostata kapsel invasjon [17]. Våre resultater tyder på at VEGF-C er regulert av ATX uttrykk i PC-3 celler. Derfor kan prostatakreft-syntetisere LPA danne en autokrin sløyfe for å stimulere VEGF-C uttrykk og fremme kreft progresjon. Basert på disse funnene kan en ATX-hemmer være en potensiell kandidat til å hindre lymphangiogenesis-indusert metastaser fra prostatakreft.
Kondisjonert medium samlet fra kreftceller er mye brukt til å etterligne lokale microenvironmental interaksjoner mellom maskiner og svulster. Ved hjelp av en HUVEC in vitro modell ble kreftcellene vist til hemmelig interleukin (IL) -1α for å stimulere IL-8-sekresjon av endoteliale celler [41]. Videre kondisjonert medium av kreftcellen A549 lungelinjen regulerer endotelial celleblodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) uttrykk som er avhengig av VEGF [42]. Alle disse resultatene tyder på at HUVEC celle er en skikkelig
in vitro
modell for å undersøke aktive komponentene i kondisjonert medium kreftcellekulturer. PC-3-kondisjonert medium induced lymfatisk endotelceller (LEC) spredning, tube-formasjonen, og sårheling. Dessuten, VEGFR-2-signalering er også kjent for å spille en kritisk rolle i LMUene respons på behandling med PC-3-kondisjonert medium [43]. Heri, demonstrerte vi at VEGF-C er en viktig induserer ekspresjonen av HUVEC lymfatiske markører i PC-3-kondisjonert medium. Våre resultater er i samsvar med tidligere studier som PC-3-celler som stabilt uttrykker VEGF-C siRNA redusert intratumoral lymphangiogenesis [44]. Videre har vår forskning videre vist at aktivering av LPA
1/3 regulerer PC-3 VEGF-C uttrykk, og kondisjonert medium fra PC-3 var i stand til å indusere ekspresjon av endotelcelle lymfatisk markører.
i sammendrag viser vi at det å øke effekten av LPA og ATX aksen på VEGF-C-ekspresjon i prostatakreftceller. Derfor antagonister av LPA
1/3 og ATX kan være gjennomførbare terapeutiske strategier for å hemme prostatakreft-indusert lymphangiogenesis og derfor forhindre metastaserelaterte kreftdødsfall.
Materialer og metoder
Cell kultur
PC-3, DU145, og LNCaP human prostatacancercellelinjer oppnådd fra ATCC, ble dyrket i RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin ( 100 U /ml), og streptomycin (100 U /ml) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2. Menneskenavlestrenger ble vennlig levert av National Taiwan University Hospital (Institutional Review Board godkjenning nr. 9561709146). HUVECs ble dyrket på 1% gelatin-belagt (Sigma, St. Louis, MO, USA) 10 cm plater i 60% M199 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) medium supplert med 100 U /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin, 20% FBS, og 20% endotelial vekstmedium (EGM). Celler gjennomgikk en passasje ukentlig. Cellene ble sub-dyrket etter trypsinering og anvendt i eksperimentene inntil passasjen 4. PC-3 stabilt transfektert med VEGF-C small-hårnål (sh) RNA ble opprettholdt og forsterkes i fullstendig medium supplementert med puromycin (0,25 ug /ml) i 6 uker før forsøkene ble utført.
LPA Stimulering
LPA (Sigma, St. Louis, MO, USA) ble fremstilt i kloroform og metanol (01:09) og lagret ved -20 ° C. Ett hundre tusen celler ble dyrket i 3,5 cm diameter plater med komplett medium. Etter 24 timer fra implantering, ble PC-3-celler sultet med serumfritt RPMI-1640 i 16 timer. Etter sult, ble LPA tilsatt til serumfritt RPMI med 0,005% fettsyrefritt bovint serumalbumin (BSA) som en bærer. Den LPA
1/3 antagonist, Ki16425 (Cayman, Ann Arbor, Michigan, USA) og ATX-hemmer, S32826 (Echelon, Salt Lake City, UT, USA) ble begge oppløst i DMSO. Arbeidskonsentrasjonen for Ki16425 og S32826 var 10 uM og 200 nM.
Western Blot analyse
Etter behandling ble cellene vasket med iskald fosfatbufret saltløsning (PBS) og lysert på is med RIPA-buffer (50 mM Tris ved pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksykolat, og 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS)). Lysatene ble sentrifugert ved 4 ° C og 14000 rpm i 15 minutter, og klar supernatanter ble oppsamlet. Like mengder av prøvene ble separert ved 12% SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE) og deretter overført til polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Bellerica, MA, USA). Følgende antistoffer ble brukt for blotting: geit monoklonalt anti-hVEGF-C antistoff (AF752, R D, Minneapolis, Minnesota, USA), geitepolyklonalt anti-hLEDGF antistoff (sc-33371, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), geit polyklonalt anti-beta-aktin-antistoff (Santa Cruz), og anti-geite-immunglobulin G (IgG) antistoff (HAF109; R & D).
