Abstract
karsinomer skrive seg fra en kompleks mikromiljøet som består av flere distinkte epitel-linjene som er omgitt av en rekke av stromale celletyper. Forstå kreft årsaker krever vurdering av forholdet mellom celletyper under sykdom initiering og gjennom progresjon. Genmodifisert mus (GEM) modeller lette prospektive undersøkelse av tidlig onkogene hendelser, som ikke er mulig i mennesker. Siden de fleste solide svulster havnen avvik i RB nettverk, utviklet vi en induserbar GEM tilnærming til etablering og vurdering av carcinoma innvielse i et variert utvalg av epitelvev og subtyper ved inaktivering av RB-mediert svulst undertrykkelse (RB-TS). Systemet tillater uavhengig vurdering av epiteliale undergrupper som uttrykker enten cytokeratins (K) 18 eller 19. Av Cre-avhengige uttrykk for et protein som dominant inaktiverer RB og funksjonelt overflødige proteiner p107 og p130, kan neoplasi initieres enten K18 eller K19 uttrykker celler av en rekke vev. Ved design, fordi bare én vei avvik ble konstruert, karsinom utviklet stokastisk først etter lang ventetid. Derfor dette systemet, som gjør det mulig for rettet celletype-spesifikke carcinoma initiering, letter videre definisjon av hendelser som kan utvikle svulster til aggressive kreftformer via konstruert, carcinogen-indusert og /eller spontan evolusjon
Citation. Song Y Gilbert D, O’Sullivan TN, Yang C, Pan W, Fathalizadeh A, et al. (2013) Carcinoma Initiation via Rb tumorsupressorproteinene Inaktive: En allsidig tilnærming til epithelial Undergruppe-avhengig kreft Innvielse i ulike vev. PLoS ONE 8 (12): e80459. doi: 10,1371 /journal.pone.0080459
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 22 juli 2013; Godkjent: 03.10.2013; Publisert: 02.12.2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Cancer Institute, National Institutes of Health, i henhold til kontrakt nummer HHSN261200800001E, og delvis av tilskudd RO1-CA046283 fra NCI og PC040619 fra det amerikanske forsvarsdepartementet, og Prostate Cancer Foundation til TVD. YS ble støttet av postdoktor trening award (PC050306) fra det amerikanske forsvarsdepartementet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Innholdet i denne publikasjonen gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene eller retningslinjer ved Institutt for helse-og omsorgs, heller ikke omtale av handelsnavn, kommersielle produkter, eller organisasjoner innebærer godkjennelse av den amerikanske regjeringen
Konkurrerende interesser.: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Ondartede kreftformer utvikles gjennom mekanismene for selektiv vekst, overlevelse, og invasive egenskapene i et mangfoldig mikromiljøet. Således, kreft er heterogen med en kompleks krets med flere celletyper. Genmodifisert mus (GEM) modellene gir en kraftig tilnærming for å vurdere både årsak /virkningsforhold og celletype mottakelighet. I løpet av de siste tiårene har det vært framgang i å identifisere molekylære avvik som kan bidra til tumorigenesis, og dermed tilby innsikt i mulige årsaksmekanismer og terapeutiske mål. Men siden mange hendelser har blitt utviklet sammen og ofte ikke starte sykdom, har relativt få studier undersøkt etiologien av svulst evolusjon fra initiering gjennom progresjon til avansert sykdom. Her, søkte vi å utvikle «GEM kreft-initiator» modeller som kan bli indusert til å initiere tumorgenese i et bredt utvalg av epitelvev og i forskjellige undertype rom for videre bruk i definere vev og celle-spesifikke mekanismer for carcinoma progresjon.
Cell subtyper av en epitel kan være preget av spesielt paret cytokeratin (K) uttrykk profiler [1] – [3]. Cytokeratins er cytoskjelettet proteinmellomfilamenter satt sammen av heterodimere subenheter av syrlig type I (K9-K28) og grunnleggende proteiner type II (K1-K8 og K71-K80) [4]. K18, vanligvis sammenkoblet med K8, er den første keratin uttrykt ved den åtte-cellestadiet av mus utvikling [5], [6], etterfulgt av K19 og K7 [7]. Imidlertid, K19, den minste kjente sure keratin, har ingen kjent enkel type II keratin partner. Selv om både K18 og K19 er uttrykt i enkelt epitel, de er uttrykt forskjellig i noen subtyper av epitel (f.eks K18 i paraplyceller og K19 i basal og mellomliggende celler av urothelium [2], [3], [8]). Derfor kan forskjellige keratin uttrykk mønstre benyttes som grunnlag for å målrette tumor initiering hendelser til bestemte epitel-subtyper.
Retinoblastoma en (RB) er en negativ regulator av proliferasjon i den eukaryote cellesyklus, særlig i løpet av cellulær differensiering [ ,,,0],9], og RB pathway spiller en avgjørende rolle i tumorigenesis. Avvikende RB pathway aktivitet, som følge av feil i RB selv, CDKN2A, CCND1, eller CDK4, er observert i de fleste solide kreft hos mennesker [10]. I de få krefttyper, karakterisert ved at begynnelsen av humant vev er rutinemessig tilgjengelig, slike avvik er ofte til stede, noe som antyder en rolle i initieringen [11] – [15]. Men i noen tilfeller, er den første krets av RB-reaksjonsveien aberrasjon fremgå i mer fremskreden kreft, og hevder en rolle i progresjon [16]. Faktisk, årsak og virkning relasjoner trolig avhenge av flere variabler, inkludert cellen og vev av opprinnelse og den stokastiske rekkefølgen av årsaks hendelser, understreker behovet for modellsystemer for å bestemme plausible roller i sykdom etiologi. På grunn av funksjonell redundans mellom RB og sine familiemedlemmer p107 og p130 i de fleste murine celletyper [17] – [20], vi har brukt en dominerende inaktive protein, T
121, for å inaktivere RB svulst undertrykkelse (RB-TS) i mus [21] – [25]. T
121 er avledet fra de N-terminale 121 aminosyrer av Simian Virus 40 (SV40) stort T-antigen, som utviklet seg til å inaktivere RB-mediert cellesyklus brems. Når ledet av vevsspesifikke promotorer i transgene mus, T
121 er tilstrekkelig til å igang tumorgenese i prostata [26], bryst-[27], eggstokk [28] og choroid plexus [29] epitelceller, samt i sentralnervesystemet system astrocytter [30], [31]. Initiering fenotype er avhengig av T
121 RB /p107 /p130 bindingssetet som vist ved punkt mutagenese [32]. I hvert tilfelle ble undersøkt hittil, er initiering assosiert med avvikende proliferasjon fulgt av apoptose, og tumorprogresjon har vært drevet av utviklet og /eller stokastiske avvik av spesifikke kreftassosiert molekylære nettverk [28], [31], [33].
Her beskriver vi transgene mus linjer som RB-TS inaktivering kan induseres i enten K19 eller K18-uttrykker epitelceller undergrupper i en Cre rekombinase avhengig måte. Transgene linjer ble etablert der Cre-betinget uttrykk for T
121 ble drevet i henhold cytokeratin18 eller 19 transkripsjonskontroll ved hjelp av bakterielle kunstig kromosom (BAC) transgener som beholder endogene uttrykk mønstre i ulike vev. Således kan en enkelt belastning for hver undertype brukes til å drive kreft initiering vev-spesifikt via organspesifikk Cre uttrykk etter kimlinje eller somatisk innføring av en
Cre
transgenet. Ved selektiv inaktivering av RB-TS i K18- eller K19-uttrykke celler, viser vi den brede nytten av disse «kreft-initiator» mus i mekanistiske studier av kreftutvikling og vise roller for RB-TS inaktivering og epitelial subtype spesifisitet ved neoplastisk initiering innenfor mange epiteliale organer.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Animal Care og bruk Committee (ACUC) av UNC-Chapel Hill (Permit Number: 04 til 232,0), og National Cancer Institute (NCI) -Frederick (Permit Number: 11-030). Alle dyrene i denne studien ble avlivet i henhold til «Retningslinjer for Avliving av mus og rottefostre og nyfødte» som definert av ACUC av UNC-Chapel Hill og NCI-Frederick å redusere smerte og lidelse.
generasjon subtype-spesifikke Keratin styrt BAC transgene mus
En floxed EGFP stoppe T
121 kassett (transgen kassett, figur 1A) ble avledet fra MFT
121 konstruere [34]. T
121 består av de første 121 aminosyrer (aa) av SV40 stort T-antigen, fulgt av 11 missense aminosyrer som følge av et 31 bp delesjon. Transgenet ikke kan uttrykke små t-antigen på grunn av en andre delesjon som fjerner dens spleiseakseptor området [35]. T
121 inaktiverer RB og familiemedlemmer p107 og p130 og ikke inneholder p53 og p300 inaktivere domene [36]. Den RPCI-22 mus genomisk DNA-bibliotek ble screenet med bestemte prober utformet for K18 (Krt1-18 på kromosom 15) og K19 (Krt1-19 på kromosom 11) via RPCI BAC screening tjeneste (Roswell Park Cancer Institute, New York). Positive kloner ble brukt for recombineering styrt innsetting [37], [38] av floxed EGFP-stop-T
121 kassetter i ekson 1 startkodonene av K18 og K19. BAC DNA ble renset (MTR Scientific, Ijamsville, MD) og injisert i befruktede egg høstet fra en B6D2F1 (JAX Laboratory, Bar Harbor, Maine) kryss i en konsentrasjon på 4 ng /ul uten linear som beskrevet [39]. Resulterende og etterfølgende generasjoner av transgene mus som ble identifisert ved PCR-amplifisering av et 215 bp-fragment ved bruk av primerne 5 «GAATCTTTGCAGCTAATGGACC 3» og 5 «GCATCCCAGAAGCTCCAAAG 3» og Digitalt styrte eller øre-avledet genomisk DNA som templat. Sykkelprofilen var: 94 ° C, 2 minutter; etterfulgt av 35 sykluser ved 94 ° C, 20 sekunder; 62 ° C, 45 sekunder; 72 ° C, 45 sekunder; og en endelig inkubering av 72 ° C, 2 minutter. Mus linjer ble opprettholdt ved å parre med villtype B6D2F1 mus og derfor er utpekt som
B6, D2-Tg (K18GT
121) TVD product: (
TgK18GT
121
) og
B6, D2-Tg (K19GT
121) TVD product: (
TgK19GT
121
)
A.. Transgen kassett: En EGFP stopp kassett ble flankert av loxP-seter og T
121 genet ble plassert nedstrøms. B. Keratin bakterielt kunstig kromosom (BAC) transgene konstruksjoner: et transgen kassett (A) ble satt inn oppstrøms for start ATG-kodon i ekson 1 av K18 (. Avledet fra mus kromosom (Chr) 15) og av K19 (avledet fra mus Chr 11) i BACS bruker recombineering. Innstikkstedet for loxP-EGFP-stop-loxP-T
121 kassett er angitt med en stiplet «V». Representative gener nedstrøms av keratin gener er angitt i bokser. Solid svarte striper indikerer eksoner (E). C. Transgene kopiere nummer per diploid genomet ble bestemt av qPCR.
Transgene Avl Strategier
TgK18GT
121 Hotell og
TgK19GT
121
mus ble krysset til
β-aktin Cre
mus (FVB eller C57BL6 /NCR bakgrunn), og
TgK19GT
121
til
K19CreER
mus ( C57BL /6 bakgrunn, levert av Dr. Guoqiang Gu ved Vanderbilt University) [40] for å bestemme startfasen evne på RB-TS inaktivering i K19 og K18 undergrupper.
Transgene Kopier nummer Bestemmelse
Tail genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp av Qiagen DNeasy blod og vev kit, og kvantitativ real time PCR ble brukt til å detektere transgene kopiere numre. PCR-amplifikasjoner ble utført i 96-brønners plater i ABI 7500-sekvensdetektoren. 30 pl prøver tatt 10 pl (50 ng) genom-DNA prøve og 20 ul PCR-reaksjonsblanding. Amplifisering ble med 10 minutter ved 94 ° C etterfulgt av 40 sykluser av 15 sekunder ved 94 ° C og 1 minutt ved 60 ° C. Grunning og probe sekvenser for T
121 genet var: forover: 5 «CTT TGC AGC TAA TGG ACC TTC 3», omvendt: 5 «TGC CTT TCT CAT CAG AGG AAT 3», og probe: 5 «Fam TC CCC CAG GCA CTC CTT TCA AGA C Tamra 3 «. De endogene p-aktin-genet kontroll primere var: forover: 5 «CTG CCT GAC GGC CAG GTC 3», omvendt: 5 «CAA GAA GGA AGG CTG GAA AAG A 3», og probe: 5 «Fam CA CTA TTG GCA ACG AGC GGT TCC G Tamra 3 «. Relative forskjeller i transgene kopiere numre ble beregnet ved hjelp av en standard dCt metode med en kjent mengde av kontroll plasmid.
Histopatologi og immundeteksjon
Transgene vev ble dissekert på angitte aldre og faste over natten i 10% nøytral bufret formalin, overført til 70% etanol, rutinemessig behandlet, og innstøpt i parafin. Vev ble seksjonert i 10 påfølgende lag på 5 mikrometer intervaller unntatt lymfevev (4 pm) og farget med hematoksylin og eosin (H E) for histopatologisk undersøkelse. Immunhistokjemi (IHC) og immunfluorescens (IF)-analyser ble utført på formalinfiksert parafininnstøpte seksjoner som tidligere beskrevet [26]. Antistoffer inkludert: anti-K8 /18 (1:500, marsvin polyklonale, GP11, Progen Biotechnik, GMBH, Heidelberg, Tyskland), anti-K19 (1:200, kanin monoklonalt, Epitomics, CA), anti-K14 (1 :1000, kanin polyklonale, pRB-155P, Covance), anti-GFP (1:500, b-2, mus monoklonalt, Santa Cruz), anti-SV40 T antigen (1:100, mus monoklonalt, DP02-200UG, Calbiochem ), og anti-Ki-67 (1:500, kanin polyklonale, 06-570, BD Pharmingen, San Diego, California). For dobbelt IF farging, ble den første primære antistoff (anti-EGFP eller anti-SV40 T-antigen) inkubert over natten, etterfulgt av den andre primære antistoff (anti-K19, anti-K14, eller anti-K18) inkubasjon i 2 timer ved romtemperatur . Blandet Alexa Fluor 488 og 594 (1:200 fortynning, Life Technologies) fungerte som sekundære antistoffer. Bilder ble tatt ved hjelp av lys, immunfluorescens eller Zeiss confocal mikroskoper. Apoptose nivåene ble funnet i seksjoner ved hjelp av terminal deoxynucleotidyltransferase-mediert dUTP-biotin nick ende merking (TUNEL) assay (ApopTag Peroxidase
In Situ
apoptose Detection Kit, S7100 Millipore) etter produsentens anvisninger [26]. For å kvantifisere Ki-67 positive celler, ble tilfeldig 5-10 Ki-67-positive felt med den samme forstørrelse ervervet ved hjelp av et Zeiss mikroskop, og Ki-67 positive og negative celler ble tellet manuelt. Positivitet ble beregnet som gjennomsnittet prosent av totale celler.
Statistiske analyser
Student t eller Mann-Whitney Rank Sum tester ble utført for å evaluere statistisk signifikans mellom genotyper og vev. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
transgene uttrykk gjenspeiler Epitelial Undergruppe spesifisitet
For å målrette RB-TS inaktive til epitelceller subtyper, vi ansatt keratin regulering innenfor BACS. å kjøre betinget transgene uttrykk. En Cre-betinget loxP-EGFP-stop-loxP (LSL) T
121 kassett (figur 1A) ble innført i det første exon av enten K18 eller K19-genet innenfor respektive BACS å generere
TgK18GT
121 Hotell og
TgK19GT
121
transgene mus (Figur 1b). Dermed EGFP ble uttrykt under K18 eller K19 regulering til uttrykk /aktivering av Cre, som formidlet
EGFP
sletting og indusert T
121 uttrykk. To sender grunnleggeren linjer for hver konstruksjon ble generert og karakterisert. Som vurdert av kvantitativ real time PCR, mus næret en transgen eksemplar i linjene
TgK19GT
121-34 Hotell og
-43, etter og
TgK18GT
121-36
, og 3 transgene kopier i tråd
TgK18GT
121-34
(figur 1C).
for å oppdage endogen K19 og K18 uttrykk, og dermed mønstre for nøyaktig transgen regulering, villtype epitelvev ble undersøkt av IHC eller IF. I samsvar med rapporterte resultater [2], [3], [8], både K19 og K18 ble allment uttrykt i en rekke mus epitelvev (Figur S1 og tabell S1).
TgK18GT
121 Hotell og
TgK19GT
121
EGFP transgene uttrykk ble visualisert i hele vev ved hjelp av en stereo fluorescens mikroskop (stereo Discovery.V20, Carl Zeiss Meditec, Inc). Sterk grønn fluorescens ble observert i noen vev av både linjer med
TgK19GT
121
mus (f.eks tarm, mage, urinblæren og galleblæren), men svak eller ingen grønn fluorescens i andre (f.eks melkekjertlene, eggstokk og bukspyttkjertel, Figur S2). Mange vev viste sterk grønn fluorescens i begge linjer med
TgK18GT
121
mus (f.eks tarm, mage, thymus, brystkjertel, eggstokk, spyttkjertel, urinblæren og sædlederen, epididymis, og galleblæren), men ikke i bukspyttkjertel, lunge og lever (figur S3). I
TgK19GT
121
mus, farging av vevssnitt konsekvent viste sterk og utbredt EGFP uttrykk i tarmen, mage, urinblæren, galleblæren, og nyrebekken epitel. Lett påvisbar farging ble begrenset til en mindre andel av celler i lungene, brystkjertel, og prostata (Figur S4 og tabell S1). Andre vev hadde meget svak eller ingen påvisbar EGFP ekspresjon (tabell S1). I
TgK18GT
121
mus, EGFP uttrykk var utbredt i de fleste K18-positive epitelvev (figur S5 og tabell S1). Viktigere, basert på dobbel IF, EGFP var co-uttrykkes med respektive endogene keratin i
TgK19GT
121 plakater (figur S4) og
TgK18GT
121
mus (figur S5), men ekskludert fra K14 celler (figur S6). Men ikke alle K19 eller K18 positive celler uttrykt EGFP. Begge linjer med
TgK19GT
121
mus viste lignende EGFP uttrykk. Vev fra
TgK18GT
121-34
mus viste mer intens EGFP farging sammenlignet med de fra
TgK18GT
121-36
mus (data ikke vist), muligens på grunn av høyere transgen kopiantall på linje 34 (figur 1C).
RB-TS Inaktive blir indusert i Specific epitelial Subtyper
for å avgjøre om T
121 uttrykk kan bli indusert i et bredt spekter av epitelvev med subtype spesifisitet og for å evaluere effekten av RB-TS inaktivering, krysset vi hemizygous transgene mus fra alle linjer til transgene
β-aktin Cre
homozygote mus. Sannsynligvis på grunn av bred RB-TS inaktivering i K19 uttrykke embryonale celler (se nedenfor), ble noen embryonale dødelighet observert i
TgK19GT
121; β-aktin Cre
mus. Levendefødte bi-transgene mus var underrepresentert i forhold til kull kontroller (34% vs. 66% for
TgK19GT
121-34
, 45% vs. 55% for
TgK19GT
121-43
, henholdsvis Tabell S2), noe som tyder på at RB-funksjonen i K19 celler kan være avgjørende for utvikling. I de overlevende mus, i samsvar med bredden av endogent K19 uttrykket (fig S1), T
121 ekspresjon ble lett observert i en rekke vev først vurderes ved 2 måneders alder (figur 2), selv om EGFP uttrykk hadde vært lav eller under IHC-deteksjonsnivået i noen av disse vev (f.eks eggstokk, brystkjertel og bukspyttkjertel, figurene S2 og S4, og Tabell S1). Viktigere, som EGFP trofast ble uttrykt i K19-celler, T
121 ble også uttrykt i K19-positive celler (ikke vist), men utelatt fra K14 celler (figur S6). T
121 uttrykk nivåer var sammenlignbare mellom
TgK19GT
121-34; β-aktin Cre Hotell og
TgK19GT
121-43; β-aktin Cre
mus (ikke vist).
Sterk brune flekker indikerer positive T
121 uttrykk.
I motsetning til
TgK19GT
121 ; β-aktin Cre
mus, begge linjene av
TgK18GT
121; β-aktin Cre
mus utviklet med normale mendelsk frekvenser (ikke vist). T
121 ble allment uttrykt i K18 uttrykke epitel av noen vev av to måneder gammel
TgK18GT
121; β-actin Cre
mus (f.eks thymus, melkekjertelen, og ovarie), men viste begrenset induksjon i andre, om enn i de aktuelle celler (for eksempel tarm, prostata og bukspyttkjertel; figur 3), selv om EGFP uttrykk hadde vært mer utbredt i noen tilfeller (Tall S3 og S5, og tabell S1). Viktigere, T
121 ble uttrykt i K18-positive celler (figur 3B), men utelatt fra K14 celler (figur S6). Intensiteten av T
121 uttrykk var sammenlignbar mellom
TgK18GT
121-34; β-aktin Cre Hotell og
TgK18GT
121-36; β-actin Cre
linjer (ikke vist) selv EGFP uttrykk var høyere i
TgK18GT
121-34
enn
TgK18GT
121-36
mus (ikke vist) . Denne observasjonen kan gjenspeile somatisk Cre-mediert kopi nummer reduksjon fra en tandem gen array.
A. T
121 uttrykk ved IHC. Svarte piler indikerer T
121 positive celler. Scale bar = 50 mikrometer. B. Double immunfluorescens farging av T
121 som grønn og endogen K18 som rød i vev vist som fusjonerte confocal bilder. Hvite piler indikerer intestinale epitelceller positive for både endogene K18 og T
121. . Scale bar = 25 mikrometer
RB-TS Inaktive Årsaker neoplasi
I forhold til villtype mus (figur S7A), alle
TgK19GT
121-43; β-aktin Cre
musene multifokale hyperplastic lesjoner i de fleste K19 positive epitelvev [f.eks bukspyttkjertel (bukspyttkjertel ductal epitel), melkekjertler, eggstokk (eggstokkene overflate epitelceller, OSECs), lunge bronchiole, lever galle ductule, galleblære, nyre (nyrebekken epitelceller), urinblære, prostata, tynntarm, tykktarm, mage kjertler foveolar celler; Figur 4 og tabell 1]. Denne fenotype var sammenfallende med høye priser proliferasjon i de påvirkede celler (Figurene 5 og 6) i forhold til villtype-vev (figur 6 og S8). Som i tidligere rapporter om begrensede vev [26], [27], [30], økt spredning i vev av
TgK19GT
121; β-actin Cre
mus ble ledsaget av en betydelig økning av apoptose (figur S9) sammenlignet med villtype-mus (figur S10). Disse resultatene indikerer at RB er viktig for å undertrykke hyperplasi av K19-positive celler. Noen
TgK19GT
121; β-aktin Cre
mus utviklet livstruende bilateral eller unilateral hydronefrose starter så tidlig som 2 måneders alder (figur S11A). Den hydronefrose ble tolket til å være sekundært til merket hyperplasi av overgangsordning celle epitel i krysset av nyrebekken og ureter fører til obstruksjon av urin utstrømning fra nyrene (figur S11A). Andre mus fra linjen 34 måtte avlives på grunn av forstørrede thymuses, noe som førte til livstruende thorax press, ved 7 måneders alder (figur S11B)
hyperplasia ble observert i de fleste vev (lunge og tykktarm.: angitt med svarte piler). Multifokal duktal hyperplasi ble observert i pankreas, så vel som mus prostata intraepitelial neoplasi (mPIN) i prostata, og hydronephrosis som antydet med hvite piler i nyre. Alle prøver ble farget med H . E
sprednings ble vurdert av Ki-67 IHC (brun) i vev av 2 måneder gamle mus. Pilene viser eggstokkene overflaten epitelceller (OSECs) positive for Ki-67. Scale bar = 50 mikrometer.
Formerinasanalyse priser av bukspyttkjertelen, brystkjertel, eggstokk, prostata (dorsolateral lapp), og blæren ble kvantifisert på vevssnitt farget med Ki-67. * Signifikant forskjellig fra WT-kontroll (p 0,001); #significantly forskjellig mellom
TgK19GT
121; β-aktin Cre og TgK18GT
121; β-aktin Cre product: (p = 0,007); @ Signifikant forskjellig mellom
TgK18GT
121; β-aktin Cre Hotell og WT (p = 0,043)
I likhet med
TgK19GT
121.; β-actin Cre
mus, inaktivering av RB-TS i K18-positive celler hovedsakelig ført til hyperplasi (figur 7 og tabell 1), som ble korrelert med T
121-ekspresjon i disse vev (figur 3). Med bred induksjon av
β-aktin Cre
allel, både
TgK18GT
121-34 Hotell og
TgK18GT
121-36
musene utviklet alvorlig thymus epitel hyperplasi og påfølgende lymfoid hyperplasi (tabell 1 og figur 7). Farging indikerte høy T
121 uttrykk i K18 kortikal thymus epitel (figur S12B) forbundet med høy spredning (basert på Ki-67 IHC) og apoptose (TUNEL) priser (Figur S12C). Fordi disse musene ble utsatt på grunn av livstruende thorax press fra forstørrede thymuses (Figur S12A) og krevde aktiv dødshjelp ved 6 måneders alder,
TgK18GT
121; β-aktin Cre
fenotyper i andre vev kan ikke undersøkes forbi denne alderen. På 1-6 måneders alder, ble mild fokal hyperplasi observert i melkekjertlene, eggstokk overflaten epitel, tarm og prostata (figur 7 og tabell 1), som korrelert med forhøyede spredning priser og økt apoptose (figur 6, 8 og S13 ). For det meste, sammenlignet med
TgK19GT
121; β-aktin Cre
mus, omfanget av hyperplasia var mindre utbredt i
TgK18GT
121; β-aktin Cre
mus som korrelerte med liten grad av T
121 uttrykk i disse vev. Høy forekomst spredning ble observert i både K19 og K18 positiv bryst epitel og ovarie flate epitel (38,6% vs. 49,2% i mammary, og 51,2% vs. 34,2% i eggstokk, henholdsvis figur 6), noe som kan forklares ved ko- uttrykk for K19 og K18 i disse vev (Figur S1). Dette er imidlertid ikke tilfelle for andre områder av co-uttrykk (f.eks prostata, figur 6), noe som tyder på at vev-spesifisitet kan spille en rolle i Cre rekombinasjon effektivitet.
hyperplasia ble observert i noen vev (eggstokk og prostata: angitt med piler). Alle mus ble avlivet ved 1-7 måneders alder på grunn av livstruende thorax press forårsaket av forstørret thymuses. Alle prøver ble farget med H . E
sprednings ble vurdert som i figur 5 i to måneder gamle mus. Det ble observert tilsvarende spredningsnivået i tynntarm, tykktarm, mage og eggstokkfollikelen som den for villtype-mus er vist i figur S8. Svarte piler indikerer Ki-67 positive celler. Scale bar = 50 mikrometer.
Inaktivering av RB-TS i voksen-bundne K19 + Cells er tilstrekkelig for startfasen
For å omgå de utviklingsmessige defekter i
TgK19GT
121; β-aktin Cre
mus og å demonstrere nytten av disse modellene for å studere kreftutvikling hos voksne organer, vi krysset
TgK19GT
121-34
tamoksifen-induserbar
K19CreER
mus [40]. I motsetning til
TgK19GT
121; β-aktin Cre
mus,
TgK19GT
121; K19CreER
mus ble født med forventet mendelsk frekvenser (ikke vist), ytterligere støtte til den viktige rollen RB-TS i K19 positive celler under musen utvikling . Mus ble indusert med tamoksifen ved 6-8 ukers alder, og T
121-ekspresjon ble bestemt ved IHC. T
121 ble først lett påvisbar i galleblæren ved 2 uker etter induksjon (ikke vist) og var utbredt i forskjellige vev ved 4-6 uker etter induksjon (fig S14A). Videre T
121 ble samtidig uttrykt med K19 (figur S14B). I samsvar med uttrykk for EGFP før Cre uttrykk, og, typisk for transgene uttrykk, T
121 ble uttrykt i en undergruppe av K19 positive celler innenfor en gitt vev.
For å finne ut om RB-TS inaktive disponert voksen K19-uttrykke epitelceller til tumorigenesis, tamoxifen-indusert
TgK19GT
121; K19CreER
mus var alderen. I samsvar med den generelle hyperplastisk fenotype observert i
TgK19GT
121; β-actin Cre
mus, ble det observert en høy frekvens av atypisk hyperplasi i de fleste epitelvev (for eksempel mage kjertel epitel 85,7% hos menn og 90% hos kvinner, og lunge bronchiole epitelet 92,9% hos menn og 90% hos kvinner; tabell 2), i samsvar med økt forekomst sprednings (ikke vist). Mens en lav frekvens av ondartet neoplasi hos noen vev (for eksempel mage adenokarsinom 13,3% hos menn og 14,3% hos kvinner; tabell 3 og figur 9), lav karakter lesjoner til stede i de fleste organer indikerte at RB-TS inaktive var tilstrekkelig til å igang men ikke til fremgang sykdom. Dette er i overensstemmelse med våre tidligere resultater i mammary [27], prostata [26], choroid plexus [29] og eggstokkepitelet [28], og hjerne astrocytter [30], [31]. I likhet med
TgK19GT
121; β-aktin Cre
mus, ble nedsatt hydronefrose også observert i 75% av menn og 40% av kvinner i indusert
TgK19GT
121; K19CreER
mus på 9-16 måneder etter induksjon (Tabell 2 ). Men i motsetning til
TgK19GT
121; β-actin Cre
mus, dødsårsaken var blæren på grunn av høy ekspresjon av K19 i mellomliggende og basale celler av blæren epitelet (figur S7b) og en høy frekvens av adenom utvikling i blæren (tabell 3 og figur 9 ). Interessant, observerte vi tidligere utbruddet av urinblæren adenom hos menn enn hos kvinner (9 måneder kontra 14 måneder etter induksjon, Tabell 3). Den underliggende mekanismen er ukjent.
urinblæren adenom, lunge adenom, mage adenokarsinom, nyrekreft, og gut intraepitelial neoplasi (GIN), og mPIN lesjoner i prostata er vist ved lave og høye forstørrelser. Mild pankreasgang hyperplasi ble observert i bukspyttkjertelen som antydet med piler. Alle prøver ble farget med H . E
Diskusjoner
Studier som benytter vev-spesifikke genet targeting i genmanipulerte musemodeller har bidratt i stor grad til vår forståelse av kreft kompleksitet og den molekylære og cellulære basis av tumorigenesis. Her beskriver vi den generasjonen av transgene musemodeller (
TgK18GT
121 Hotell og
TgK19GT
121
) ved hjelp av keratin genet transkripsjons regulatorer å kjøre betinget epitelial subtype-spesifikke inaktivering av RB- TS. High fidelity av respektive keratin spesifikke uttrykk mønstre ble oppnådd ved hjelp BAC transgener som også ble utviklet for å vurdere vev av interesse via reporter GFP uttrykk. Vi viser at disse modeller kan brukes i kombinasjon med spesifikke Cre-drivere for å initiere tumorgenese i et bredt spekter av epitelvev i enten K19 eller K18 som uttrykker subtyper. Vi viser videre at RB-TS inaktive kan faktisk lokke fram forstadier til kreft celle selvstendig i alle testede epitelvev, herunder ved induksjon strengt i voksen organer, og at tidlig neoplasi er jevnt forbundet med avvikende spredning og apoptose.
ved hjelp av undertype-spesifikk målretting, et bredt spekter av K18 eller K19 positive undergrupper innenfor epitelvev var følsomme for neoplastisk induksjon av RB-TS inaktivering. Verken
TgK18GT
121; β-aktin Cre
mus (inntil 6 måneder) eller
TgK19GT
121; β-aktin Cre
mus (opp til 8 måneder) utviklet adenomer eller karsinomer. Disse resultatene bekrefter at RB-TS inaktivering i berørte epithelia bare initierer en neoplastisk fenotype. Basert på tidligere studier av tumorprogresjon hos T
121-initierte celler, forventer vi at flere lesjoner i spesifikke kreftgener vil være nødvendig for å drive denne tidlige neoplastiske fenotype i respektive kreft.
