Abstract
Connexins (Cx), som utgjør gap junction inter kanaler i virveldyr, har vist seg å undertrykke transformert cellevekst og tumorigenesis , men mekanismen (e) fortsatt i stor grad spekulativ. Her definerer vi den molekylære basis av hvilken Cx26, men mindre hyppig Cx43 eller Cx32, selektivt gi veksthemming på kreftceller. Funksjonell intercellulære kopling er vist å være nødvendig, å produsere deler av blokker av cellesyklus på grunn av langvarig aktivering av flere mitogene kinaser. PKA er både nødvendig og tilstrekkelig for Cx26 indusert veksthemming i lavt serum og fravær av forankring. Aktivering av PKA var ikke assosiert med forhøyede cAMP-nivåer, men viste seg å resultere fra en omfordeling av cAMP i hele cellepopulasjon, slik cellesyklus svingninger i cAMP som kreves for effektiv cellesyklusprogresjon. Cx43 og Cx32 mislykkes i å mediere denne omfordeling som, i motsetning til Cx26, er disse kanalene lukket i løpet av G2 /M-fasen av cellesyklusen når cAMP-nivåer topp. Sammenligninger av tumorcellelinjer tyder på at dette er et generelt mønster, med veksthemming ved connexins som forekommer når cAMP oscillerer med cellesyklusen, og det gap junction være åpen hele cellesyklusen. Dermed gap junctional kopling, i fravær av eksterne signaler, gir en generell måte å begrense mitotisk rate av cellepopulasjoner
Citation. Chandrasekhar A, Kalmykov EA, Polusani SR, Mathis SA, Zucker SN, Nicholson BJ (2013) inter Omfordeling av cAMP ligger til grunn Selektiv bekjempelse av kreft celle vekst ved Connexin26. PLoS ONE 8 (12): e82335. doi: 10,1371 /journal.pone.0082335
Editor: David M. Ojcius, University of California Merced, USA
mottatt: 30 august 2013; Godkjent: 30 oktober 2013; Publisert: 03.12.2013
Copyright: © 2013 Chandrasekhar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av følgende: NIH – R01 CA048049, P30 CA54174, P01 AG19316, og P30 AG013319. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Gap veikryss er matriser av inter kanaler som er de eneste mediatorer av direkte inter utveksling av små metabolitter og signalmolekyler i flercellede systemer [1,2]. I virveldyr, er disse kanalene består av integrerte membranproteiner kalt connexins (Cx), med fire trans domener og cytoplasma N og C -termini. Seks connexins kommer sammen for å danne en hemichannel eller connexon, og to slike hemichannels fra opposisjonelle celler dock for å opprette inter gap junction kanal [3]. Den integrerte, men spesialiserte rolle gap junctions i ulike vev lettes ved nærværet av minst 21 forskjellige connexin isoformer hos mennesker, med forskjellige proteiner som er klassifisert i henhold til deres molekylvekt [4], og et gen nomenklatur som er beskrevet i [5 ]. De Cx43, Cx32 og Cx26 proteiner studert her er kodet av
GJA1
,
GJB1 Hotell og
GJB2
gener, henholdsvis.
Nesten siden deres oppdagelse, gap veikryss har vært innblandet som tumor suppressors i flere vev [6]. Dette har blitt bekreftet i genetiske skjermer av mange krefttyper, inkludert brystkreft [7], prostatakreft [8], og føflekkreft [9]. Et mangfold av tumortyper og transformerte cellelinjer demonstrere redusert connexin protein uttrykk og /eller gap junction-funksjonalitet (anmeldt i 10). Videre er det flere dokumenterte tilfeller hvor det eksogene ekspresjon av connexins i en transformert cellelinje kan dramatisk undertrykke dens transformerte egenskaper og dets evne til å danne tumorer i nakne mus [Cx43 i C6 glioma-celler [11]; Cx43 i 10T1 /2 embryonale mesenchymale celler [12]; Cx43 og Cx32 i LNCaP prostatakreftceller [13]; Cx26 i HeLa livmorhalskreftceller [14]; Cx26 og Cx43 i MDA-MB-231 brystcancerceller [15,16], og; Cx32 i SKHep1 hepatomceller [17]. Sistnevnte er også i overensstemmelse med en økning i levertumordannelse observert i Cx32 – /- mus [8,18]
Vekst undertrykkelse av transformerte celler ved å Cx ekspresjon har vært knyttet til regulering av pro- og anti-apoptotiske. proteiner (f.eks BCL-2) [19,20] eller endringer i cellesyklusproteiner som november (CCN3) [21], Skp2 [22] og p21 [23,24]. Men å etablere en direkte forbindelse mellom noen av disse hendelsene og utveksling av signalmolekyler mellom celler gjennom gap veikryss har vist seg unnvikende. Fremgang i denne forbindelse har vært begrenset av begrenset informasjon om både permeabilitet egenskaper connexins og rom-tid-distribusjon av lavmolekylære metabolittkonsentrasjoner i flercellede populasjoner. I noen tilfeller har connexins blitt foreslått å undertrykke vekst, selv i fravær av påviselige gap junction kanalaktivitet [15,21,24,25,]. Dette kan skje gjennom interaksjoner med andre proteiner som er kjent for å bindes til connexins (gjennomgått av [26]), ved sin funksjon som hemichannels, noe som kan bidra til økt celledød [27], eller til og med gjennom mis-lokalisering av deler av proteinet ( 25). Imidlertid endelige forbindelser mellom en hvilken som helst av disse prosesser og anti-onkogene faktorer holdes skal etableres.
Mens rollen til cellen kobling, sammenlignet med andre connexin funksjoner, er fremdeles et emne for debatt i tumor suppresjon, koblingen mellom gap junction kopling og mitogenesis har vært etablert i flere ikke-patogene forhold. Flere vekstfaktorer, slik som EGF [28] og PDGF [12] er blitt vist å indusere transient frakopling av celler som en del av den umiddelbare tidlige responsen som går forut for initiering av mitose. Onkogener som
v-src
har vist seg å ha lignende, men mer langvarige effekter på koblingen [29].
In vivo
, som en del av regenerativ respons følgende delvis hepatectomy, en akutt tap av gap veikryss mellom hepatocytter er sett til umiddelbart forut den første bølgen av mitose [30]. Men som har vært tilfelle i tumorer, forblir det molekylære grunnlaget for mitogen hemming forbundet med celle kobling løses. I denne studien, søkte vi å definere den molekylære mekanisme for veksthemming av connexins i HeLa-celler, en meget godt karakterisert transformert livmorhalskreft cellelinje, og teste generalisering av slike mekanismer med andre celletyper. Våre resultater viser at Cx26 spesifikt tillater passasje av cAMP mellom cellene, å utjevne de topper og bunner av cAMP som inntreffer i løpet av cellesyklusen og, via PKA aktivering, forårsaker forsinkelser av cellesyklusen. Effekten er connexin spesifikk, som andre connexins, som Cx43 og 32, lukker i løpet av cellesyklusen på nøyaktig det tidspunkt da cAMP-nivåer akkumulere. Undersøkelse av flere tumorcellelinjer viser et generalitet til denne effekten, så lenge cAMP-svingninger blir sett og kanalene være åpen hele cellesyklusen.
Resultater
Cx26, men ikke Cx32 eller 43, hemmer forvandlet vekst av HeLa-celler
HeLa-celler er en bredt studert livmorhalskreft cellelinje som mangler endogene gap veikryss, men tillate robust uttrykk, hensiktsmessig menneskehandel, og behandling av eksogent uttrykt connexins. Vi utnyttet dette systemet for å karakterisere connexin vekstegenskaper ved å forberede sammenslåtte kloner av HeLa-celler som uttrykker Cx43 (HeLa43), Cx32 (HeLa32), og Cx26 (HeLa26). Hver av HeLa-transfektanter uttrykke connexins på tilsvarende nivåer, og i henhold til den forutsagte MW på Western-blots (figur S1). De danner typisk gap junction plaques ved celle-celle grensesnitt (figur 1A), og viser lignende forekomst av overføring av pre-lastet calcein fargestoff til omkringliggende umerkede celler, med ~ 95% av belastede celler som er koplet til minst én nabo, og 73-83% av første ordens naboer som får fargestoff (tabell 1).
(A) immunfluorescens farging, ved hjelp av riktig anti-Cx antistoff, viser karakteristisk uttrykk for connexins i plakk mellom celler. HeLaPar testet negativt med alle de tre anti-Cx antistoffer (anti-Cx26 antistoff Resultatene er vist her) (skala barer, 10 um).
(B) Vekst av HeLaPar (ruter) med bassenger av Jakten kloner transfektert med Cx26 (sirkler), Cx32 (omvendt trekant) eller Cx43 (stående trekant), utsatt for 3 dager med serum sult (dager 0-3) etterfulgt av 3 dager i 1% serum (dager 3-6), avslører selektiv vekst undertrykkelse av Cx26. Representative data fra en av tre eksperimenter er vist, med punkter som representerer gjennomsnitt ± SEM av triplikate metallovertrekket.
(C) Topologi diagram av Cx26, med ekstracellulær overflate øverst, viser plasseringen av to punkt mutanter benyttes i denne studien at forstyrre ulike aspekter av kanalfunksjon (R75Y og T135A).
(D) Immunoflourescence farging med et anti-Cx26 antistoff viser at både muterte connexins skjema plaketter på celleoverflaten, med R75Y å ha litt mindre, mindre hyppige plaketter, og T135A ha større og hyppigere plakk enn w.t. Cx26 (panel A) (skala barer, 10 um).
(E) Hemichannel funksjon ble analysert ved LY farveopptaks i et fargestoff slippe assay (Scout et al., 2002). Det venstre panelet viser fasekontrastrikt bilde (stjernetegn indikere celler tar opp fargestoff) og høyre panelet viser fluorescerende bilde (skala barer, 20 um). Merk at noen dye-positive celler synes å ha fått fargestoff gjennom inter overføring fra den opprinnelige cellen som tok opp fargestoff i HeLa26 kulturer.
(F) Sammenligning av veksten i lav serum (jfr panel B) mutant Cx26 uttrykke celler (Cx26T135A – diamanter, Cx26R75Y – trekanter) med de som uttrykker vekt HeLa26 (sirkler) og HeLaPar celler (firkanter) viser at den funksjonelle inter kanaler w.t. Cx26 er nødvendig for veksthemming. Representative data fra ett av tre forsøk er vist, med poeng som representerer gjennomsnitt ± SEM av tredoble platings.
Gap Junction
Hemichannel
HeLa Celletype
% Sammen
en
% Første Bestill
b Coupling
% Cells Påfylling av ekstracellulær Dye
c
Parental000Cx 4395 ± 1,3273 ± 10.43NTCx 3296 ± 2,0180 ± 9.53NTCx 2693 ± 0,6783 ± 8,283 ± 1.7Cx26 R75Y006 ± 1.2Cx 26T135A000Table 1. Funksjonsanalyse av gap junctions og Hemichannels.
en prosentandel av celler forhåndslastede passerer fargestoff til i det minste en mottaker celle.
b prosentandelen av første-ordens-celler (dvs. de umiddelbart tilstøtende til donor celle) motta fargestoff etter 6 timer med platekledning.
c prosentandelen av celler som viser farveopptaks av Lucifer gult (LY) (se figur 1E). Resultatene inkluderer ikke cellene mottar LY sekundært gjennom kobling (dvs. Cx26) .NT: Ikke testet CSV ned CSV
Effekten av connexin uttrykk på de transformerte vekst karakteristikkene av HeLa-celler ble vurdert under lav (1%) serum forhold og på poly (2-hydroksyetylmetakrylat) (poly-HEMA) belagte plater som ikke støtter celle-substratadhesjon [31]. Til tross for de tilsvarende nivåer av kopling i alle connexin transfektanter, fant vi at bare HeLa26 viste veksthemming, i samsvar med tidligere studier (Mesnil et al., 1995). HeLa26 viser tre ganger lengre doblingstider i lave serum betingelser (figur 1B), og ≥2-fold lavere forankringsuavhengig vekst (figur S2) sammenlignet med foreldre HeLa-celler (HeLa Par) eller andre connexin transfektanter, som vist i tre uavhengige HeLa26 kloner. Alle data som vises her er hentet fra bassenger av kloner blandet i like forhold for hvert forsøk.
inter kommunikasjon ved Cx26 er nødvendig for vekst undertrykkelse
Den spesifikke funksjon Cx26 ansvarlig for veksthemming ble vurdert ved hjelp Cx26 punktmutasjoner som ablasjon kanal funksjon. Den Cx26T135A mutasjon på den cytoplasmiske enden av den tredje transmembrandomenet (figur 1C) hindrer åpning av enten gap junction kanaler eller hemichannels [32]. Den Cx26R75Y mutasjon i første ekstracellulære sløyfe (figur 1C) hindrer gap junction kanal formasjon, men etterlater hemichannel fungere stort sett uendret [33]. Gap junction og hemichannel egenskaper av alle Cx26-konstruksjoner, så vel som Cx43 og 32, ble bekreftet ved hjelp av Lucifer gult transport mellom celler, eller opptak fra mediet etter mekanisk stimulering (figur 1E), henholdsvis (oppsummert i). Begge Cx26 mutanter danner plakk i HeLa celler (figur 1D), som dokumenterer at disse mutasjonene støtter fortsatt montering av gap junction strukturer [32]. Plakk syntes å være mer tallrike i tilfelle av HeLa26T135A, og mindre i tilfellet av HeLa26R75Y (jfr fig 1 A og D), i samsvar med tidligere indikasjoner på at Cx26R75Y kan redusere stabiliteten og størrelsen av gap junction plaques [34].
I motsetning til villtype (w.t.) Cx26, ingen av Cx26 mutanter forårsaket veksthemming av HeLa-celler, enten i lav serum (figur 1F), eller under forankringsuavhengig forhold (figur S2). Således er intercellulær kommunikasjon nødvendig for veksthemming av Cx26. Mens hemichannel funksjon av HeLa26R75Y gjorde redusere metningstetthet, noe som antyder en rolle for delvis hemichannels i graden av celle pakking, ble effekten av en moderat 20%, i forhold til w.t. Cx26, som reduserte metningstetthet med 60%. Selv om inter kopling var strengt nødvendig for connexin mediert reversering av de transformerte vekstegenskaper, kopling gjennom andre connexins (Cx43 og Cx32) var ineffektive, noe som indikerer en unik rolle for Cx26 kanaler.
Vekst effekter av Cx26 gap veikryss blir formidlet av reversible cellesyklus blokker
Som et første skritt i å identifisere den mekanismen som Cx26 gap junction kopling undertrykker forvandlet vekst av HeLa-celler, vi spurte om dette var en konsekvens av økt celledød eller nedsatt celledeling. HeLa26 celler viste ingen økning i TUNEL-farging, eller caspase-3 aktivitet (ikke vist), noe som indikerer at Cx26 ikke økte apoptose i HeLa-celler (tabell S1). Det var en viss økning i Annexin V og Hoechst merking av HeLa26 celler, men disse cellene viste ikke morfologisk trekk karakteristisk for celledød ved apoptose, nekrose eller autofagi. I stedet viste de egenskaper som samsvarer med celler som kan ha blitt blokkert i cytokinese (se nedenfor), som typisk viser større membran permeabilitet. FACS analyse av HeLa Par og Cx26 transfektanter følgende utslipp til 1% serum fra tymidin /nocodazol blokk (G2 arrest), avslørte en langvarig exit fra mitose i HeLa26 celler, med åpenbare forsinkelser i alle faser av cellesyklusen. (Figur 2A). HeLa43, HeLa32, og de to mutante Cx26 HeLa transfektanter viser cellesyklus distribusjoner som ligner HeLa Par (data ikke vist). Lignende studier som sammenligner vekst etter løslatelse fra G1 blokade indusert ved å dobbelt tymidin blokk ga lignende resultater, med utgang fra G1 /S blir særlig forsinket i HeLa26 celler sammenlignet med HeLa43, HeLa32, og mutante Cx26 Jakten transfektanter (data ikke vist).
(A) cellesyklus distribusjon av HeLaPar (topplaten) og HeLa26 (nedre panel) ble analysert ved FACS [skille celler i G1 (lys grå søyler), S (mørk grå søyler) og G2-M (sort barer) faser] ved de angitte ganger etter 1% serum tillegg følgende serum sult. HeLa26 celler viser en langsommere progresjon gjennom cellesyklus (f.eks tid til å vende tilbake til G2: 24 timer sammenlignet med 16 timer for HeLaPar), så vel som et betydelig tap av synkronisering. Dataene er middelverdier ± SEM av tre uavhengige eksperimenter.
(B) Farging av kjernen med DAPI (venstre kolonne) avslører en mye høyere frekvens av flerfliket kjerner i Cx26 uttrykker celler (10-14% – paneler III, V og VII) enn HeLaPar celler (2 – 5% – panel i). Co-flekker de samme cellene for gamma-tubulin (høyre kolonne) viser enten en (hvilende celler) eller to (dele celler) centrosomes i HeLaPar celler (panel ii). I motsetning, HeLa26 celler (paneler iv, VI og VIII) ofte dele en enkelt sentrosomen mellom flere kjerner (piler), eller har en klynge av flere Sentrioler (pilspiss) (skala barer, 10 um).
(C ) den prosent av multi-lobet celler bestemmes på forskjellige dager etter tilsetning av 1% serum, er gjennomgående høyere i HeLa26 (fylte søyler) enn HeLaPar (åpne søyler), med den maksimale forskjell på en dag. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. * Betegner betydning for p-verdi 0,05. ** Betegner betydning for p-verdiene 0,005.
Hoechst eller DAPI flekker i 1% serum viste en signifikant akkumulering av polymorfe kjerner, eller flerkjerneholdige celler i HeLa26 (≥10% 24 timer etter at serum tillegg) sammenlignet med det man ser i HeLa Par ( 4%) (figur 2B). Disse cellene er betydelig større og flatere enn de med enkle kjerner, og vises i samsvar med manglende fullføre M fase og /eller cytokinese. Disse atom abnormiteter er forbundet med enten enkel (piler i figur 2B, IV og VI) eller flere (pilspiss i figur 2B viii) centrosomes innenfor en enkelt celle, deles av flere kjerner eller kjernefysiske fliker. Dette er i motsetning til de vanlige to centrosomes forbundet med delende HeLa-celler Par (åpen pil i figur 2B ii), og antyder at de HeLa26 cellene har problemer med regulering av sentrosomen duplisering. Intakte kjernefysiske membraner, mangel av kondensert kromatin, og fraværet av TUNEL merking i HeLa26 (tabell S1), viser at cellene ikke angir apoptose, men til slutt avslutte mitose. I samsvar med dette, mens multi-flikete eller flerkjerneholdige celler er alltid mer rikelig i HeLa26 kulturer, har de ikke akkumuleres over tid (figur 2C).
Cx26 gap junction kopling påvirker nivåer og aktivitet av flere mitogen signalmolekyler
i samsvar med de observerte effektene av Cx26 på cellesyklus av HeLa-celler, ble aktiveringstilstand flere mitogene regulatorer funnet å være kronisk økt i HeLa26 forhold til HeLa Par celler og andre Cx transfektanter (Cx26R75Y vist som et eksempel) i løpet av vekst i 1% serum (figur 3 og figur S3). Spesielt er nivåene av CDK-inhibitorer, p21 og p27, som direkte regulerer G1 (p21 og p27) og G2 (p27) progresjon, var 1,5- til 2-ganger høyere i HeLa26 cellene under serum sult (0 tidspunkt), og holdt seg høyere i 48 eller 24 timer etter 1% serum tilsetning, henholdsvis.
(AG) Protein nivåer i HeLaPar (åpne søyler), HeLa26 (lukkede barer) og HeLa26R75Y (rutete barer) ble kvantifisert fra digitaliserte bilder av Western blot (figur 2, Supplerende Data) umiddelbart etter serum sult (dag 0), og daglig etter 1% serum tilsetning. Nivåer for hvert protein ble normalisert til at av HeLaPar celler på dag 0. Actin fungert som den interne lasting kontroll. Nivåer av CDK-inhibitorer, p21 (A) og p27 (B), og forholdet mellom fosforylert (aktivert) til totale nivåer av familiemedlemmene MAPK og deres regulatorer, MEK (C), ERK (D), JNK (E) p38MAPK (F) og den katalytiske subenheten til PKA (G) ble hver høyere i HeLa26. Denne høyden, tydelig under serum sult, vedvarte fra 1 – 3 dager, avhengig av proteinet.
(H) cAMP-nivåer ble vurdert ved ELISA i HeLaPar (åpen bar), HeLa26 (lukket bar) og HeLa26T135A (rutete bar). I motsetning til PKA aktivitet, trenger cAMP-nivåer ikke vise konsistente økninger i HeLa26 sammenlignet med de andre celletyper. HeLa26R75Y cellene vise cAMP nivåer tilsvarende HeLa26T135A. Dataene er gjennomsnitt ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter. Stjernene viser tilfeller der aktiviteten i HeLa26 er betydelig høyere (* = p 0,05, ** = p 0,005) enn både HeLaPar og HeLa26R75Y eller T135A celler
Flere medlemmer av den mitogen aktivert. protein kinase (MAPK) familie, kjent for å regulere p21 og P27 nivåer (Erk 1/2, p38 og JNK) (figur 3 CE), viste vedvarende øker (2 til 3 ganger) i HeLa26. To kinaser videre oppstrøms, MEK og protein kinase A (PKA) katalytisk subenhet alfa (figur 3 F og G), viste enda større langvarig økning i aktiviteten i HeLa26 (3 til 5 ganger i over 72 timer etter serum tillegg). Disse økningene ble ikke sett på alle mitogen trasé som ble observert noen endringer i Akt eller p70 S6 kinase.
Mens langvarig aktivering av MAPK er assosiert med redusert celledeling [35,36], er deres akutt aktivering typisk pro-mitogen. I samsvar med dette, i de første 2 timene etter 1% serum stimulering, HeLa Par-celler viste en forbigående aktivering av JNK og Erk og en reduksjon i p38, etterfulgt av gjenopptakelse av den basale tilstand. I kontrast, gjorde HeLa26 ikke vise disse forbigående endringer i aktivitet (figur S4), men bare en tregere utbruddet aktivering start ~ 2 timer etter serum tillegg.
Aktivering av PKA er både nødvendig og tilstrekkelig for vekst undertrykkelse av Cx26
den funksjonelle bidrag heving av disse kinaser til Cx26 veksthemming ble vurdert av siRNA knockdown studier av Erk, JNK og PKA katalytiske subenheten alpha. sirnas tilsettes under innledende serum sult, 24 timer før tilsetning av 1% serum, forårsaket en fem gangers reduksjon av JNK og en to-gangers reduksjon av Erk og PKA (figur 4A). Høyere siRNA-nivåer ble ikke brukt for å unngå toksiske effekter på cellene, som hver av disse signalveier er også nødvendig for basal celledeling.
(A) Lysater av HeLa26 (venstre panel), behandlet med tilfeldig sekvens siRNA (kontroll), eller sirnas spesifikk for kinaser som er angitt, ble fremstilt 24 timer etter tilsetning serum og probet med antistoffer mot totalt protein som indikert til venstre for hver klatt. Nivåer av alle kinaser ble redusert med JNK avtar være mest dramatiske. Lysates av HeLaPar celler (panel høyre) transfektert med en CA-PKA (konstitutivt aktiv) konstruksjonen viste mye høyere uttrykk av PKA enn utransfekterte kontroller. Actin tjente som en kontroll lasting.
(B) Vekst av de forskjellige siRNA behandlede HeLa26-celler (åpne søyler) eller HeLaPar-celler med og uten konstitutivt aktiv PKA uttrykket (lukkede søyler) er sammenlignet som et forhold mellom celle nummer 24 etter, og ved tidspunktet for, serum tilsetning. Rollen til konstitutiv aktivering av hver av de mitogene kinaser i vekstinhibering av HeLa26 er tydelig i reversering av Cx26 indusert veksthemming av deres respektive sirnas. Dette er mest dramatisk når det gjelder PKA, hvor veksten vender tilbake til samme nivå som HeLaPar celler. Veksthemming av HeLaPar celler, i samme grad som vist på HeLa26, til CA-PKA uttrykk angir at PKA alene kan mediere denne effekten. Signifikante forskjeller i vekst er merket med en stjerne (p 0,05).
I løpet av de første 24 timene i 1% serum, HeLa Par celler fordoblet i antall, mens HeLa26 celler viste ingen signifikant vekst (figur 4B ), i samsvar med forsinkelsen i cellesyklusutvikling observert i FACS-analyse i figur 2A. Behandling med siRNA av tilfeldig sekvens hadde ingen virkning på denne vekstmønster. ERK og JNK sirnas hver for seg, eller sammen, forårsaket et delvis tap av veksthemming i HeLa26 celler, men siRNA til PKA forårsaket en fullstendig reversjon til den vekstmønster av HeLa-celler Par. Videre er over-ekspresjon av PKA katalytiske subenhet alfa i HeLa-celler (figur 4A, til høyre panel) undertrykt veksten til samme hastighet som den for HeLa26 celler (figur 4B). Således, mens aktivering av andre nedstrøms kinaser bidrar til regulering av HeLa cellevekst, synes PKA aktivering for å være den dominerende innflytelse faktor, som er både nødvendig og tilstrekkelig for effekten av Cx26 på HeLa vekst i lavt serum.
Aktivering av PKA av Cx26 gap junctional kobling skyldes omfordeling av cAMP, ikke ved heving i sitt nivå
Den primære rolle PKA vist ovenfor sterkt impliserer cAMP som en sannsynlig vekst regulatorisk signal. Men sammenligninger av globale cAMP-nivåer i HeLa26, HeLa Par og HeLa26R75Y kulturer (Figur 3H) viste ingen konsistente forskjeller mellom cellelinjene over tre dager med vekst i 1% serum. Men cAMP har vist seg å være gjennomtrengelig gjennom Cx26 gap junction kanaler mellom HeLa celler [37,38]. Siden funksjonsinter kanaler er nødvendig for PKA aktivering og veksthemming, førte dette oss til å undersøke om en spredning av cAMP fra celler med høye konsentrasjoner til celler med lavere konsentrasjoner kan føre til en større del av celler med aktivert PKA, uten krav om ytterligere cAMP-produksjon.
for å visualisere direkte cAMP-nivåer romlig, et FRET reporter anvender EPAC som cAMP føle domene inneklemt mellom CFP og YFP fluoroforer, ble introdusert inn i cellene ved transfeksjon. Bleking av YFP (akseptor) fluorphore resulterte i en økning i CFP (donor) fluorescens (23%) (figur 5A), som ikke ble sett når CFP og YFP ble uttrykt alene (2%) eller sammen, men på forskjellige molekyler ( ~ 4%). Heving av cAMP ved 8-Br cAMP (cAMP agonist), forskolin (adenylcyklase aktivator) og 3-isobutyl-1-metylxantin (fosfodiesterase inhibitor) forårsaket et tap av FRET til 10%, antagelig på grunn av forlengelse av EPAC molekylet på cAMP-binding (data er oppsummert i figur 5B). FRET målinger fra enkeltceller i ikke-synkronisert HeLa Par og HeLa26 kulturer fotografert i en konfokalmikroskop var korrelert med DNA innhold og kjernefysisk morfologi. Leiren nivåene i HeLa Par celler økt ~ 2 ganger fra inter til mitose. Denne forskjellen ble nesten helt borte i HeLa26 celler, på grunn av økt interfasenivå og redusert nivå i mitotiske celler (figur 5C). Sporing av cAMP nivåer gjennom en normal cellesyklus i HeLa par celler synkronisert ved å dobbelt tymidin blokk, bekreftet at cAMP-nivåer forbli lav i G1 og S, økning i G2, topp i metafase, og deretter avta i siste del av mitose (figur 5D) . Disse «topper og daler» av cAMP synes å være eliminert i HeLa26 cellene på grunn av diffusjonen av cAMP fra de relativt få M faseceller, til de fleste av G1 /S-faseceller. Den resulterende økning i cAMP i G1 /S faseceller induserer aktivering av PKA, som er veksthemmende på dette stadiet av cellesyklusen [39]. Dette forklarer resultatene i figur 4B, hvor knock-down av PKA (særlig under G1 /S fase) kan eliminere Cx26 vekst undertrykkende virkninger av Cx26, mens dens aktivering kan etterligne den.
(A) representasjon akseptor fotobleking FRET, viser en økning i donor (CFP) fluorescens følgende komplett akseptor (YFP) fotobleking.
(B) FRET effektivitet er minimal når CFP og YFP er uttrykt separat, eller sammen, men ikke knyttet sammen gjennom en felles transportør. FRET effektiviteten av dobbelt merket EPAC konstruere øker med nesten 10 ganger, men synker til bare 3-4 ganger over bakgrunnen når cAMP-nivåene øker.
(C) FRET målinger en dag etter serum tillegg fra enkeltceller i enten inter eller mitose viser at endringene i cAMP-nivåer med cellesyklus sett i HeLa-celler elimineres ved ekspresjon av Cx26.
(D) FRET analysen av en populasjon av celler som HeLaPar synkroniserte i G1, viser svinge mønster av cAMP med cellesyklus, med nivåer gjenværende lav gjennom hele inter, og nådde en topp i løpet av metafase del av mitose.
Scale bar representerer ~ 40μM. Et minimum av 25 celler ble i gjennomsnitt for hver celletype og cellesyklus scenen for FRET.
(E) Immunocytochemistry av aktiv fosfor-PKA (katalytisk subenhet alfa) en dag etter 1% serum tillegg (øverste rad) avslører et heterogent fargemønster i HeLaPar-celler og celler som uttrykker Cx43 eller gap junction kanal mangelfull Cx26R75Y mutant. Derimot er p-PKA nivåer i HeLa26 er høyere og mer ensartet på tvers av alle celler. Scoring individuelle celler for netto p-PKA signal og DNA innhold som vurderes av DAPI flekker avslører en sammenheng (lavere grafer), med p-PKA nivåer å være lav i G1 /S (lavere DNA-innhold) og høy i G2 /M (høyere DNA innhold). Denne forskjellen er dramatisk redusert i HeLa26 kulturer.
For å bekrefte om denne omfordeling av cAMP var i samsvar med den generelle økningen i PKA fosforylering ved aktivering Thr197 stedet [40] vi hadde observert (figur 3G), vi også undersøkt de romlige mønstre av p- PKA flekker i HeLa Par, 26, 43 og 26R75Y kulturer (figur 5E). Farging av individuelle celler var svært heterogen i alle kulturer som viser sterk vekst i lav serum (HeLa Par, Cx43 og Cx26R75Y). Co-farging med DAPI viste en klar korrelasjon mellom intensiteten av P-PKA merking av hver celle med dets DNA-innhold (figur 5E – plott nedenfor hvert immuno-bilde), med høyere nivåer av P-PKA etter DNA-replikasjon er konsistent med den observerte topp i cAMP-nivåer i M fase er vist på figur 5B. HeLa26 celler presenterte et unntak fra dette mønsteret ved at farging av cellene var mer ensartet. Ikke overraskende korrelasjon av P-PKA intensitet med DNA-innholdet ble også dramatisk redusert, i samsvar med de minimale forskjeller vi ser i cAMP-nivåer mellom M fase og S-faseceller i disse kulturer (figur 5C). Disse resultatene er bare lett forklares ved en omfordeling av cAMP via Cx26 kanaler, fra celler med høyere konsentrasjoner (M fase), til celler med lavere konsentrasjoner (G1 /S fase). Denne tilsynelatende resulterer i en mye høyere andel av celler som når cAMP-nivåer tilstrekkelig til å indusere fosforylering av PKA, som fører til aktivering og en samlet oppregulering av PKA-aktivitet i kulturen uten faktisk økning i totale cAMP-nivåer.
Cx43 og Cx32 kanaler var ineffektive i undertrykkelse av vekst som disse kanalene tett i cellesyklusen
Fordi HeLa43 og HeLa32 cellene vise robust inter kobling, og gitt før bevis for at cAMP kan passere effektivt gjennom både Cx43 og Cx26 kanaler i disse celler [37], forsøkte vi å finne ut hvorfor Cx43 og 32 var ineffektive i å undertrykke vekst. Siden cAMP-nivåer bare øke i løpet av M fase, hvor det har blitt rapportert at gapet junctional kopling kan redusere, undersøkte vi om disse tre connexins er regulert forskjellig i løpet av cellesyklusen. Celler ble synkronisert i S-fasen av dobbelt tymidin blokk i normal (10%) serum. I motsetning til virkemåten i lavt serum (figur 1), er alle HeLa-cellelinjer ble med samme hyppighet i normalt serum. Graden av synkroni, samt cellesyklusprogresjon etter frigjøring fra blokken, ble funnet å være den samme for alle tre connexin transfektanter i normale serumforhold. .
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
