Abstract
androgen reseptor (AR) er fortsatt en viktig bidragsyter til den neoplastiske utviklingen av prostatakreft (CAP). Cap progresjon er knyttet til flere somatiske AR mutasjonsendringer som gi gave på AR dramatiske gevinst-av-funksjon egenskaper. En av de mest vanlige somatiske mutasjoner som er identifisert er Thr877-til-Ala (T877A), som ligger i den ligand-bindende domene, som resulterer i en reseptor som kan promiskuøs binding og aktivering av en rekke steroidhormoner og ligander, inkludert østrogener, progestiner, glukokortikoider, og flere anti-androgener. I et forsøk på ytterligere å definere somatiske mutert AR gain-of-funksjon egenskaper, som en konsekvens av dens promiskuøse ligandbindende, foretok vi en proteomikk /nettverksanalyse tilnærming for å karakterisere proteinet interactome av den mutante T877A-AR i LNCaP-celler etter åtte forskjellige ligand-spesifikke behandlinger (dihydrotestosteron, Mibolerone, R1881, testosteron, østradiol, progesteron, deksametason, og cyproteronacetat). I å utvide analysen av våre multi-ligand komplekser av mutant T877A-AR observerte vi betydelig berikelse av spesifikke komplekser mellom normal og primærprostatasvulster, som ble videre korrelerte med kjente kliniske resultater. Videre analyser av visse mutante T877A-AR-komplekser viste bestemte befolknings preferanser skille primær prostatasykdommer mellom hvite (ikke-spanske) vs. afrikansk-amerikanske menn. Videre disse kreftrelaterte AR-proteinkomplekser demonstrerte prediktiv overlevelse utfall spesifikke for cap, og ikke for bryst, lunge, lymfom eller medulloblastoma kreft. Vår studie, ved å koble data generert av våre proteomikk til nettverksanalyse av kliniske prøver, har bidratt til å definere reelle og nye biologiske mekanismer i kompliserte gain-of-funksjon AR komplekse systemer
Citation. Zaman N, Giannopoulos PN , Chowdhury S, Bonneil E, Thibault P, Wang E, et al. (2014) proteomikk-Coupled-nettverk Analyse av T877A-androgen Receptor Interactomes kan forutsi klinisk Prostate Cancer Outcomes mellom Hvit (Non-spanske) og afrikansk-amerikanske grupper. PLoS ONE 9 (11): e113190. doi: 10,1371 /journal.pone.0113190
Redaktør: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, USA
mottatt: Mai 10, 2014; Godkjent: 04.09.2014; Publisert: 19.11.2014
Copyright: © 2014 Zaman et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle proteomikk data som presenteres i manuskriptet, vil bli lastet opp på vår AR reseptoren database (https://androgendb.mcgill.ca/) som en Excel-fil, sammen med supplerende Figurer /Tabeller forbundet med dette manuskriptet.
Finansiering: Denne studien ble støttet av den kanadiske Institutes for Health Research (https://www.cihr-irsc.gc.ca) driftstilskudd MOP-106477 (MT, MP, EW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Betydelige fremskritt innen genomisk sekvensering metodikk har tillatt en bedre vurdering av omfanget av somatiske mutasjoner påløpt i vanlige svulster [1], [2]. Mer viktig er erkjennelsen av at svulster betydelig variere genetisk fra en pasient til en annen, og i løpet av en enkeltstående pasient det eksisterer omfattende inter-tumor heterogenitet og intra-tumor heterogenitet [3], [4], [5]. Et betydelig antall av disse genetiske endringer er missense mutasjoner som provoserer nye gain-of-funksjon egenskaper som gjør et bestemt gen proaktiv til tumor evolusjon og omtales som driver mutasjoner. En bedre forståelse av disse nye egenskaper ville føre til en bedre tolkning av onkogenese, men dette er vanskelig på grunn av et stort antall forskjellige mutasjoner, den uforutsigbare natur forsterkning-av-funksjon egenskaper forbundet med somatiske mutasjoner, den mulige omfattende samspillet av forskjellig somatiske mutanter og de påfølgende utvelgelsesprosesser initiert av mikromiljøet eller terapi i seg selv. Slike komplekse «systemer» krever en mer global «omics» tilnærming og mer nettverksanalyse, snarere enn den klassiske enkelt gen tilnærming, for å samle mer kritisk informasjon relatert til neoplastisk evolusjon.
I tråd med den nylig definerte mutasjons landskap av svulster, prostatakreft (CAP) har også omfattende genetiske endringer som spenner fra enkle missense mutasjoner, kopiantall variasjon, spleisevarianter, genetiske rearrangements og korte DNA forandringer i et stort antall gener [1], [2], [6] [7], inkludert androgen reseptor (
AR)
genet. Det er ikke uventet at AR mutasjoner kan legge til proteinet repertoar av kraftige nye funksjoner [8], [9] og disse forsterkning-av-funksjon-egenskapene kan tillate at AR til å fungere på en avvikende måte. Et antall av somatiske Cap AR mutanter, spesielt den hyppigst forekommende Cap AR mutasjon, Thr877Ala (T877A), har unike gain-of-funksjon egenskaper: de kan binde flere klasser av steroider promiskuøst (f.eks østrogener, progestiner, glukokortikoider) med påfølgende trans , eller være hyperactivated ved vanlige ligander [10]. Klassiske anti-androgen behandling [f.eks flutamide, cyproteronacetat (CPA) eller bikalutamid] har generert gjennom seleksjonstrykk, spesifikke somatiske AR mutasjoner, f.eks Trp741Cys (W741C) og His874Tyr, noe som resulterer i undergravende ARS som er fullt aktive med disse legemidlene [11]. Selv neste generasjon av anti-androgen narkotika eksemplifisert ved enzalutamide (MDV-3100) har provosert spesifikke AR mutasjoner [12], [13]. Denne observasjonen samsvarer også med et dramatisk fall i PSA-nivå påfølgende anti-androgen tilbaketrekking [11]. De T877A-AR mutasjoner, som også er til stede i prostatacancercellelinje LNCaP, er blitt rapportert av ulike individer forekommer hos 25 til 33% av androgen-uavhengig eller kastrering-resistente tumorer [11], [14], [15] [16].
Nylig, tyder vårt eget arbeid sterkt at AR funksjon strekker seg utover sin klassiske rolle som en transkripsjonsfaktor og inkluderer nye egenskaper for RNA-spleising, DNA metylering, proteasomal samhandling og protein oversettelse på polyribosomes seg [17]. Videre er det store funksjonelle mangfold av komponentene i AR komplekser eksemplifiserer intrikate arten av protein-protein interaksjoner forbundet med å generere den passende AR biologisk utgang. Disse roman AR funksjoner kan megle cellulære prosesser og tilby nye områder der somatisk AR Cap mutanter kan «bort» og fremme Cap onkogenese.
I et forsøk på å beskrive nye gain-of-funksjon egenskaper knyttet til mutant Cap ARS ble det utført en proteomikk-koblet nettverksanalyse. Flere proteomikk-massespektroskopi undersøkelser ble gjennomført for å fullt karakterisere protein sammensetningen av T877A-AR «komplekser» (interactome) under ulike klasser av hormon /ligand forhold reflekterer promiskuitet av ligand binding forbundet med T877A. Kritisk, kan mutante Cap ARS har sin egen unike evne til å gjennomgå og definere nye interaksjoner. Koblingen av data generert av våre proteomikk skjermen til systembiologi analyse har vært nyttig i å definere reelle og nye biologiske endepunkter i AR komplekse systemer, innenfor en klinisk sykdom perspektiv.
Materialer og metoder
cellelinjer
LNCaP prostatakreftcellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC), Rockville MD.
Cell kultur, steroidhormoner, ligander og stimuleringsforsøk
LNCaP-cellelinjen ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med FBS (10%), ved 37 ° C, 5% CO
2 i T-75 plastkulturflasker. Når konfluent, ble mediet forandret til RMPI supplert med 10% trekull-dekstran strippet FBS og inkubert i ytterligere 24 timer. Dagen etter ble mediet endret til frisk RMPI /kull-dekstran strippet FBS for overnatting hormon /ligand stimulering studier for en 18 timers periode. Steroider hormoner ble anvendt ved de følgende sluttkonsentrasjoner, 10 nM dihydrotestosteron (DHT), 10 nM Mibolerone (MB), 10 nM R1881, 10 nM testosteron + 10 pM finasterid, 10 nM 17β-østradiol, 10 nM progesteron, 10 nM deksametason, og 100 nM cyproteronacetat (CPA).
Affinity rensing og Western blotting
LNCaP helcellelysater ble utarbeidet av fryse-tine-metoden med 1X PDG buffer som inneholder riktig hormon /ligand [18] . Lysates ble deretter overført til α-AR co-immunoutfellinger [AR (N20), Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA] natten ved 4 ° C. En 50% protein A-Sepharose-oppslemming ble tilsatt til hver prøve og inkubert ved romtemperatur i 90 min. Perlene ble vasket tre ganger med vaskebuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Tween 20) og resuspendert i 100 ul 1X SDS-gel lastebuffer. Prøvene ble denaturert ved koking, og løst i en 10% SDS-polyakrylamidgel før sølvfarging i henhold til produsentens retningslinjer (BioRad) eller overføring til en nitrocellulosemembran for Western blot-analyse ved bruk av monoklonalt antistoff AR (441) (NeoMarkers, Fremont, CA) .
Massespektrometri og peptid sammenligning
TCEP (tris (2-karboksyetyl) fosfin) ble tilsatt til proteinprøvene for å oppnå konsentrasjonen på 5 mM. Prøvene ble inkubert ved 37 ° C i 30 min. Ett ug trypsin ble tilsatt, og prøvene fordøyd over natten ved 37 ° C, deretter tørket ned på en speedvac og gjenoppløst i 50 ul av 5% ACN /maursyre (FA) 0,2%.
Alle MS-analyser var utføres ved hjelp av en LTQ-Orbitrap hybrid massespektrometer med en nanoelectrospray ion kilde (ThermoFisher, San Jose, California) kombinert med en Eksigent nano-LC 2D pumpe (Dublin, CA) utstyrt med en Finnigan AS autosampler (Thermo Fisher, San Jose, CA ). Tyve mikroliter av hver prøve ble injisert på en C18 forkolonne (0,3 mm indre diameter x 5 mm) og prøvene separert på en C18 analytisk kolonne (150 um i.d. x 100 mm) under anvendelse av en Eksigent nanoLC-2D-system. En 76-min gradient fra (A /B) 10-60% (A: maursyre 0,2%, B: acetonitril /0,2% maursyre) ble anvendt for å eluere peptidene med en strømningshastighet innstilt på 600 Nl /min. Den konvensjonelle MS spektra (undersøkelse scan) ble kjøpt i profil-modus med en oppløsning på 60 000 ved m /z 400. Hver fullt MS spekteret ble etterfulgt av tre MS /MS spektra (fire skanne hendelser), hvor de tre mest tallrike formere ladede ioner ble valgt for MS /MS-sekvensering. Tandem MS eksperimenter ble utført ved hjelp av kollisjon indusert dissosiasjon i den lineære ionefelle.
sammenligninger av peptid overflod på tvers av de ulike eksperimentelle paradigmer ble oppnådd ved hjelp label-free kvantitative proteomikk [19], [20]. Kort fortalt ble rådatafiler fra Xcalibur programvare konvertert til peptid kartfiler som representerer alle ioner i henhold til deres tilsvarende m /z-verdier, oppholdstid, intensitet og ladetilstand. Peptide overflod ble så vurdert ved hjelp av «peak top» intensitetsverdier. Intensiteter av peptider som eluerte seg over flere fraksjoner ble summert sammen, og bare en koeffisient av varians (CV) som tillater den maksimale ione-overføring ble ansett for å beregne peptid intensitet. Clustering av peptid kart over ulike prøvesettene ble utført på peptid-forbundet Mascot inntastingen med hierarkisk clustering med spesifikke toleranser (+/- 15 ppm av peptid masse og +/- 1 min peptid oppholdstid). Normalisering av retensjonstid ble utført på den opprinnelige peptid klyngen ved hjelp av en dynamisk og ikke-lineær korreksjon som begrenser oppholdstiden distribusjon til mindre enn 0,1 minutter i gjennomsnitt. Reproduserbarhet endringer i overflod over forholdene ble bestemt ved bruk av en to-tail homoscedastic
t
-test på prøven replikerer å identifisere peptid klynger med
p
-verdier 0,1 med fold endringer større enn 7 standard avvik. Peptide klynger som oppfyller disse kriterier ble inspisert manuelt for å validere identifisering og endringer i overflod. Ekspresjonsplasmider analyser ble utført på proteiner identifisert ved minst to forskjellige peptidsekvenser. Expression verdier og relativt standardavvik ble oppnådd ved gjennomsnitt intensitetsforskjeller og standardavvik for de fire mest intense peptid trill etter fjerning utkant peptid klynger. Normaliserte proteomikk data kan finnes i tabell S1.
datasett for nettutbygging og analyse av genuttrykk
Alle AR interactors fikk NCBI genet IDer. Menneskelig protein interaksjon informasjonen ble samlet fra diverse dataressurser og merknads databaser som biomolecular Interaksjon Network Database (BIND), Database for samspill proteiner (DIP), Humant protein Referanse Database (HPRD), intakt, og molekylær interaksjon database (MINT), de fleste som inneholder kuratert interaksjonsdata og high-throughput data. Vi ga en metadata av protein interaksjoner ved å flette disse dataene med vår egen manuelt kuratert menneskelige signalnettverk som inneholder 4000 proteiner og 22.000 signalforhold [21], [22], [23].
Et protein interaksjon nettverket ble konstruert for hvert hormon ved hjelp av vårt manuelt kuratert menneskelige signalnettverk og protein-til-protein interaksjon nettverk. Vi bare anses proteiner som var ≥2.5 ganger hormonet tilstanden overflod (signal) vs. bilen kontroll overflod fra MS datasettet, skal anses vesentlig til stede. I nettverket, en node og kobling representerer protein og interaksjon, respektivt. For å finne den sterkeste innbyrdes forbundne områder av nettet, for hvert hormon, mottok vi hvert par av interaksjon basert på antall av nærliggende noder som de har til felles. Dette ga oss en matrise med alle poengene mellom alle interaksjons parene. Hierarkisk clustering ble brukt til matrise og en terskel poengsum beregnet basert på partisjonen tettheten tillater oss å identifisere de svært sammenhengende områder (klynger) for hver av de hormon nettverk.
Deretter brukte vi disse protein klynger og identifisert GO-vilkår (https://www.geneontology.org/) som er vesentlig knyttet til hver av protein klynger (p-verdi 0,05, hyper-geometrisk). Vi brukte også Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) definerte stier og utført GSEA hvis 25% av proteinet klyngens gener var i veien. For trasé og go-termer som var vesentlig fra resultatene de GSEA (p-verdi 0,05), vi også gjorde overlevelsesanalyse. Vi brukte gener knyttet til disse GO-vilkår og utført GSEA hjelp GSE21034 [24].
RNA ekstraksjon og microarray analyse
LNCaP celler ble stimulert med panel av ligander som beskrevet ovenfor, og total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, California). RNA prøver ble deretter behandlet av Quebec Genome Innovation Centre (McGill University, Montreal, Canada), for microarray analyse med Illumina Menneskelig HT-12 Expression Beadchip v4 (Illumina, San Diego, California). Rådata ble behandlet ved hjelp av R [22], [25].
To globale varmekart ble laget. Den første heatmap inneholder de mest forskjellig uttrykt gen for hver hormon anvendelse av t-test (p-verdi 0,05), hvor hver hormon er sammenlignet mot alle andre. Den andre heatmap inneholder de beste 10, 20, 50 og 100 gener med høyest varians. Den t-test finner de differensielt uttrykte gener som er spesifikke for hver hormon, mens variansen hjelper oss observere gener som er forskjellig uttrykt på tvers av flere hormoner. GSEA analyse ble utført ved hjelp GSE21034 [24], av 10, 20, 50 og 100 gener som viste høyest varians.
Progresjon og Survival Analysis
genuttrykk profiler, pasientoverlevelsesdata, og demografisk informasjon for de 267 kliniske prostata prøver (29 normal, 181 grunnskoler og 37 metastatiske svulster) ble hentet fra GSE21034 [24]. Bryst, lunge, lymfom og medulloblastoma datasett ble innhentet fra Broad Institute (https://www.broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi) [26]. Vi undersøkte etter radikal prostatektomi prognostiske verdier av et delnettverk basert på genuttrykk profiler av primære svulster, og utført Kaplan-Meier analyse av implementeringen av Cox-Mantel log-rank test med R som beskrevet tidligere [22], [25]. Dersom p-verdien er mindre enn 0,05, ble subnettet behandlet som statistisk signifikant å klassifisere tumorene til ikke-metastatiske og metastatiske tumorer. Vi stratifisert tilbakevendende vs engangs CAP kreft basert på følgende kriterier: PSA (≥4 ng /ml), Gleason (≥7), Tumor Stage (≥3) og kombinert (PSA + Gleason + Tumor)
.
struktur Forberedelse til MD simulering
krystallstrukturen av DHT (1I38) og CPA (2OZ7) bundet til T877A mutant AR-LBD og testosteron (2AM9) og R1881 (1E3K) bundet til villtype AR- LBD er tilgjengelig i Protein data Bank (PDB). Kompleksene forskjellige ligander bundet til T877A mutant AR-LBDs var ytterligere forberedt for MD simuleringer ved bruk Xleap [27] i AMBER10 [28]. Den gener AMBER kraftfelt (klepp) og ff99SB [29] parametre ble brukt i åtte forskjellige ligander. Komplekset ble oppløst i en avskåret oktaeder TIP3P [30] vann boksen. Avstanden mellom veggen av boksen og det nærmeste atom av den oppløste substans var 12,0 Å, og den nærmeste avstanden mellom oppløst stoff og løsningsmiddel-atomer var 0,8 Å. Motioner (Cl
-) ble tilsatt for å opprettholde electroneutrality av systemet. Hvert system ble minimert, først ved å bruke harmoniske begrensninger med kraft konstanter av 10 kcal /mol /a
2 til alle oppløste atomer; andre, ved oppvarming 100-300 K over 25 ps i kanonisk ensemble (NVT); og til slutt ved å ekvilibrere for å justere oppløsningsmidlet densitet under 1 atm trykk over 25 ps i den isotermiske-isobar ensemble (PT) simulering. De harmoniske støtter ble deretter gradvis redusert til null med fire runder med 25-ps NPT simuleringer. Etter ytterligere 25-ps simulering, ble en 15-ns produksjon kjøre oppnådd med snapshots samles hvert en ps. For alle simuleringer, ble 2 fs tid skritt og 9 et ikke-limt cut-off brukes. Partikkel mesh Ewald metoden [31] ble brukt til å behandle langtrekkende elektrostatikk og bindingslengdene som involverer obligasjoner til hydrogenatomer ble begrenset av SHAKE [32].
Resultater
Comparative nettverk karakterisering av T877A Ar komplekser: interactome og genuttrykkstudier
Vår evne til å fange både ligand-bundet og unliganded fullengdes vill-type AR ved affinitetskromatografi under fysiologiske forhold har tidligere mulig for oss å satse på en proteomikk tilnærming for å karakterisere bestanddelene i villtype-AR-komplekser. Dette ble gjort ved å underkaste slike komplekser til tryptisk fordøyelse etterfulgt av massespektrometri (MS) for å tildele protein identifikasjon, i effekt å skape AR interactomes initiert ved ligandbinding [33]. Til vår MS data, har en etikett-fri kvantitativ metode nå søkt på tvers av de ulike eksperimentelle paradigmer (se Materialer og metoder) [19], [20], som tillater oss å få data relatert til protein identifikasjon, sammen med overflod, og dermed noe som åpner for direkte sammenligninger mellom stimulering forhold.
Formålet med differensial hormon stimulering forholdene vil tillate oss å avgjøre om sykdom etiologi av T877A-AR mutasjon er avhengig av ligand og co-faktor status. Derfor brukte vi LNCaP celler som endogent uttrykker T877A-AR mutasjon for å karakterisere ligand promiskuøse protein interactome komplekser under forskjellige hormonelle forhold, for å synliggjøre de mulige forskjellige komplekser som kan knyttes til sykdomsprogresjon. LNCaP-celler ble stimulert med følgende hormoner, fire androgener: DHT, Mibolerone (MB), R1881, eller testosteron (i nærvær av finasterid (for å hindre at omdannelsen av testosteron til DHT), eller 17β-østradiol, progesteron, deksametason, eller anti-androgen cyproteron actetate (CPA), alene eller sammen med ikke-ligand /alkohol-bærerkontroll. Hormone stimulert T877A-AR kompleksene ble immunopurified med en N-terminal spesifikk AR-antistoff, noe som ikke ville forstyrre hormone binding til AR ligand -binding domene. Eluatene fra alle forsøksbetingelser ble analysert ved LC-MS /MS. for å øke vår sample frekvens for peptid oppdagelse i vår MS analyse ble hver eksperimentell betingelse utført fire ganger. vår proteomikk data er en samling av bare fullt karakteriserte proteiner, med fullstendig gen ontology og funksjon.
Quantitative MS-data, for hver av de åtte hormon stimuleringsbetingelser, ble brukt til å lage et protein interaksjon kart (figur 1A). proteinet interaksjon nettverkskart, tillater en visuell analyse av forholdet av interaksjonen av hvert protein med det mutante AR. Det er mest sannsynlig at ikke alle proteiner samhandle direkte med mutant AR, men kan gjennom mellomliggende proteiner. Videre ontologisk funksjon klassifisering (se Materialer og metoder) er basert på dette samspillet nettverkskartet, av kresne betydelige grupper av samspill proteiner basert på antall protein-protein interaksjons tilkoblinger. Av de åtte hormonstimulering T877A-AR protein lister, vi da systemisk brukt hierarkisk clustering analysen til forsøksbetingelsene. Hierarkiske clustering varmekart som representerer den gruppering av mellom hele T877A-AR-agonist og antagonist eksperimentelle behandlinger ble deretter generert (figur 1B). Mellom de ulike forsøksbetingelser (hormonbehandling), en komparativ nettverksanalyse ble brukt [21], [22], [23], og selv om fire forskjellige androgener ble brukt (DHT, testosteron, MB og R1881), de proteomikk profiler av disse androgen ligander ikke skille sammen, og vi har observert at progesteron og deksametason AR komplekser har proteomikk profiler som ser ut som henholdsvis R1881 og MB,. Videre er proteininteraksjon komplekset for AR-østradiol-stimulert komplekser var mest lik den AR-DHT respons interactome.
A. Kvantifisert protein interaksjon nettverk av DHT stimulert LNCaP celler. Verdien av hvert protein, som defineres av etikett-fri kvantitative MS, utmerker seg ved både farge og størrelse, og sub-følgende protein-protein-interaksjoner. AR er utpekt av den svarte sirkelen. For å bestemme forholdet mellom protein interaksjon og genuttrykksmønster, hierarkisk clustering av multi-panel hormonstimulert LNCaP celler ble utført. B. Samspill proteiner identifisert ved massespektrometri. C. De fleste variabelt uttrykt gener ved ligand stimulering. Selv om det har vært foreslått at alle hormoner som brukes er i stand til å aktivere androgen-avhengige gentranskripsjon med den T877A-AR mutant-reseptoren, er det forskjeller mellom AR-proteinkomplekser og AR genuttrykksmønster. Denne klyngeanalyse viser at selv de syntetiske androgener som Mibolerone (MB) og R1881, har lignende genuttrykk profiler, deres protein-interaksjon komplekser er mer lik deksametason (DEX) og progesteron (PGR), henholdsvis, enn å enten naturlige androgener testosteron og DHT. Videre kan selv naturlige androgener (DHT og testosteron) holdes adskilt av sine protein komplekser. Dette skulle tilsi at det er funksjoner for AR utover genet trans. Protein og genuttrykk verdier er gitt som et forhold mellom kvantifisert protein til hvert stimulering vs. kjøretøy kontroll stimulering.
Vi fortsatte å prege genuttrykksmønster av multi-panel hormon stimulert LNCaP celler. Analyse av mest variabelt uttrykte gener mellom hormonforhold ga en hierarkisk clustering mønster som var mye annerledes enn den T877A-AR protein-interaksjon profil (figur 1C). Helt klart, vi igjen observert at de forskjellige androgener som anvendes i disse stimulerings profilene ikke segregere sammen, og at det syntetiske androgener, som R1881 og MB, ikke har de samme AR-stimulert transaktivering profiler som de naturlige ligander som testosteron og DHT. Dessuten, til de funksjonelle ontological egenskaper mellom protein-interaksjon lignet med genekspresjonsprofiler fra vår differensial ligand stimulerte celler som også synes å være svært forskjellige. Kresne i betydning for sykdomsutvikling fra disse profilene var av spesiell interesse.
For å etablere statistisk signifikante biologiske funksjoner, implementerte vi inkorporering av Gene Ontologisk (GO) /trasé vilkår med David (Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery, https://david.abcc.ncifcrf.gov/). Ved hjelp av protein interaksjonsdata fra alle ligand stimuleringsbetingelser, de store ontological funksjonene er: RNA pol II-avhengig transkripsjon, proteinsyntese, med komponentene av den translatoriske maskiner (translasjonsinitiering, forlengelse faktorer, ribosomale proteiner og andre regulerende proteiner), RNA metabolisme (spesifikt RNA-spleising), reparasjon DNA (via en interaksjon med medlemmer av DNA-reparasjon kompleks), og det proteasomet /ubiquitinering baner (se tabell S2). I kontrast til ligand-avhengig genekspresjon mønster ontological klasser inkludert veier som er involvert i DNA-replikasjon, steroid /sterol-biosyntesen, og apoptose (se tabell S3). Således, selv om AR er klassisk beskrevet som en transkripsjonsfaktor, ville dens proteom- profil antyder at AR er i stand til å funksjoner ut over det som innledningsvis er beskrevet som en gen-aktivator.
Strukturanalyse av hormone binding til T877A AR
for å utforske mulige mekanismer som ligander binding til det muterte AR skape ulike sett med AR samspill proteiner, fikk vi den detaljerte konformasjon av reseptoren, bruker 15 ns molekylærdynamikk (MD) simuleringsstudier (se materialer og metoder) av de åtte forskjellige ligander brukes. Ved hjelp av forankrings program WILMA (figur 2), har vi oppnådd strukturdataene for den muterte AR bundet med progesteron, østrogen, deksametason og MB. De strukturelle data for mutant AR med testosteron, DHT, R1881 og cyproteronacetat er allerede tilgjengelig, og som sådan, disse strukturene tjente som utgangspunkt for MD-simuleringsstudier.
Docking program WILMA ble brukt til å undersøke strukturelle endringer i ligand-bindende domene av det T877A mutasjon, ved binding til ligandbinding. Illustrert er den gjennomsnittlige struktur av T877A-AR mutasjon ligand-bindende domene med åtte forskjellige ligander. A. testosteron, B. DHT, C. R1881, D. MB, E. østrogen (EST), F. progesteron (PGR), G. CPA, H. deksametason (DEX). En rød boks belyser endringer i helix α 11 løkke ved binding til hver hormon ligand.
Mutant AR MD simuleringer ble utført over 15 ns produksjonsserier. For å inspisere lokal fleksibilitet av hvert protein /hormon-komplekset, beregnet vi at rot-middel-kvadratavvik (RSMD) svingninger av ryggrad atomer av hver aminosyrerest for hver mutant AR kompleks. I studiet av globulære protein konformasjoner, måler man vanligvis likheten i den tredimensjonale struktur av RMSD av de sentrale karbonatomer i aminosyrer, etter optimal stivt legeme superposisjon. De mest betydelige svingninger tilsvare sløyfe regioner mellom α3 /α4, α9, α10 /α11 og α11 /α12 og spiralene α11 og α12 seg av LBD av AR (figur 3). Det kan sees at sløyfen mellom α9, α10 og α11 er den mest fleksible regionen i alle kompleksene (figur 3B). Blant de åtte forskjellige AR ligand bundet komplekser, er testosteron og østradiol bundne kompleksene demonstrerer den høyeste fleksibilitet, med noen sløyferester som har RMSD svingninger så høye som 2,4 Å. Selv om disse løkker er fjernt fra hormone binding lommen, er de utsatt for overflaten og kan tjene en rolle som potensielle bindingsseter for andre proteinpartnere.
A. Lagrede gjennomsnittlig strukturer av alle åtte ligand bundet reseptor komplekser. B. Regions of T877A AR-LBD sløyfe mellom Helixα9 og Helixα10 viste maksimal fleksibilitet. C. Utvidet visning av Helix α11 og Helix α12 regioner av T877A AR-LBD bundet til åtte forskjellige ligander studert i denne studien. Rester av α11 og α12 og sløyfe mellom dem viste større fleksibilitet i forhold til andre områder av reseptor hvor T877A er plassert. Color tilsvarer følgende ligander:. Grønn – testosteron, Cyan- DHT, Yellow-R1881, Pink-MB, Rose- EST, Grey- PGR, Orange-CPA, Purple-DEX
Den andre store forskjeller ble observert mellom de mutante AR komplekser er posisjonene til α11 og 12, som er kjent for å være kritisk for dikterer hormonbinding og ko-aktivator-interaksjoner. Rester av α11 og α12 og løkken mellom dem viste høyere fleksibilitet (figur 3C). Den T877A-AR mutasjon ligger i α11 åpner for en mer romslig hormonbindende lomme og vil romme steroider med ulike utvidelser innenfor D-ring.
Undersøkelsen av art og størrelse av løsemidler tilgjengelig areal (SASA ) av proteiner er et viktig verktøy for å måle potensialet interaksjon tilbøyelighet med nabo proteiner. Vi beregnet gjennomsnittlig SASA av hver AR komplekset fra 15 ns MD bane. Ingen store forskjeller ble observert blant de beregnede SASAs av forskjellige AR mutante komplekser, som varierte fra 12 124 til 12 390 Å
2. Disse resultater viser at forskjellene er stort sett knyttet til α11-α12 regioner av AR-LBD, hvor T877A mutasjonen er plassert. Derfor bestemte vi oss for å sammenligne dynamikken mellom åtte forskjellige komplekser, spesielt i denne regionen, ved hjelp RMSD matriser (tabell 1). De matriser, som i hovedsak fange ekstreme bevegelser, avdekke områder med høy fleksibilitet, spesielt for CPA og deksametason, sammenlignet med andre AR-ligand komplekser.
Computational modellering har også blitt gjennomført for en rekke andre AR somatiske mutasjoner i ligand-bindende domene (LBD), og viser følsomhet overfor et bredt spekter av hormon ligander, inkludert, AR-W741L [34], -L701H [35], [36], [37], [38] , -H874Y [39], [40], [41] og -F876L [13]. Bestemmelse av den LBD struktur mellom AR-WT og -H874Y (tilstede i 22Rv1 celler), når de er bundet til testosteron i nærvær av den N-terminale FXXLF motiv peptid eller TIF2 coactivator peptidet, fant at alle strukturer likedannet med den kanoniske nukleær reseptor LBD fold [41]. Videre -H874Y DHT og R1881 strukturer dannet -T877A og -W741L LBD bundet til steroid og nosteroid ligander [34], [42]. Den doble AR-mutant cellelinjene MDA-PCA-2a og MDA-PCA-2b, besitter L701H og T877A somatiske mutasjoner viser disse cellene lignende AR trans og LBD strukturelle egenskaper til enkelt AR-T877A mutant LNCaP celler til et bredt spekter av steroid ligander og anti-androgener, men også viser en økt følsomhet kortisol steroider [35], [36].
