Abstract
ARLTS1
er en nylig preget tumorsuppressorgenet på 13q14.3 , en region ofte slettet i både sporadisk og arvelig prostatakreft (PCA).
ARLTS1
varianter, spesielt Cys148Arg (T442C), øker mottakelighet for ulike kreftformer, inkludert PCa. I denne studien rollen Cys148Arg substitusjon ble undersøkt som en risikofaktor for PCa bruker både genetisk og funksjonell analyse. Cys148Arg genotyper og uttrykk for
ARLTS1
ble undersøkt i et stort sett med familiær og ikke-valgte PCA tilfeller, kliniske kreftprøver, xenograftene prostatakreftcellelinjer og benign prostatahyperplasi (BPH) prøver. Frekvensen av varianten genotype CC var signifikant høyere i familiær (OR = 1,67, 95% CI = 1,08 til 2,56,
P
= 0,019) og uselekterte pasienter (OR = 1,52, 95% CI = 1.18-1.97
P
= 0,001) og den samlede risikoen økte (OR = 1,54, 95% CI = 1,20 til 1,98,
P
= 0,0007). Ytterligere analyse med clinicopathological data indikerer en sammenheng med en aggressiv sykdom (OR = 1,28, 95% CI = 1,05-∞,
P
= 0,02). CC genotype av Cys148Arg variant ble også bidrar til senket
ARLTS1
uttrykk status på lymfoblastoide celler fra familiære pasienter. I tillegg betydelig senket
ARLTS1
uttrykk ble observert i kliniske tumorprøver sammenlignet med BPH prøver (
P
= 0,01).
ARLTS1
co-uttrykk signatur basert på tidligere utgitt microarray data ble generert fra 1587 kreftprøver som bekrefter den lave uttrykk for ARLTS1 ved PCA og viste at
ARLTS1
uttrykk var sterkt assosiert med immunprosesser. Denne studien gir sterk bekreftelse på den viktige rollen
ARLTS1
Cys148Arg variant som bidragsyter ved PCA predisposisjon og en potensiell markør for aggressiv sykdom utfallet
Citation. Siltanen S, Wahlfors T, Schindler M , Saramäki OR, Mpindi JP, Latonen L, et al. (2011) Tilskudd av
ARLTS1
Cys148Arg (T442C) Variant med prostatakreft Risiko og ARLTS1 funksjon i prostata kreft celler. PLoS ONE 6 (10): e26595. doi: 10,1371 /journal.pone.0026595
Redaktør: Surinder. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 26 april 2011; Godkjent: 29 september 2011; Publisert: 20 oktober 2011
Copyright: © 2011 Siltanen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av konkurransedyktig forskning Finansiering av Pirkanmaa Hospital District (tilskudd nummer 9L091), Reino Lahtikari Foundation, finsk Cancer Organisasjoner, Sigrid Juselius Foundation og Academy of Finland [stipend nummer 126714 til TW og 116 437 til J.S.]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ADP-ribosylering faktor-lignende tumorsuppressorgenet 1 (
ARLTS1
), også kjent som ADP-ribosylering faktor-lignende protein 11 (
ARL11
), er en nylig karakterisert genet ligger på locus 13q14.3. ARLTS1 tilhører den ADP-ribosylering faktor (ARF) -ARF-lignende (ARL) familie av Ras-proteinet superfamilien [1]. ARF er guanin-nukleotid-bindende proteiner som er kritiske komponenter i flere forskjellige eukaryote vesikkel menneskehandel veier. Som med andre medlemmer av Ras Superfamily, ARF fungere som molekylære brytere ved å sykle mellom inaktive GDP- og aktive GTP-bundet conformations [2]. ARLTS1 har blitt karakterisert som et intracellulært protein som har vevsspesifikk ekspresjon i lungen og leukocytter.
ARLTS1
varianter, for eksempel tull polymorfisme Trp149Stop (G446A) og missense polymorfisme Cys148Arg (T442C), har vært foreslått å ha en rolle i ulike kreftformer [3] – [6].
prostatakreft er den hyppigst diagnostisert kreft hos menn i mange land, blant annet Finland. Aldring og forbedret diagnostikk mest åpenbart øke antall nye tilfeller, men forekomsten er påvirket også av noen ukjente faktorer. Økende antall nye tilfeller skape press til helsevesenet og nye verktøy for PCA diagnostikk, prognostics og behandling er nødvendig, spesielt for å unngå over behandlingen og unødvendige biopsier. I løpet av de siste årene har det vært omfattende forskning ved PCA etiologi og genom-wide assosiasjonsstudier har avdekket flere vanlige lav penetrans genetiske endringer. Foreningen av disse variantene med clinicopathologic funksjoner og prognose er fortsatt uklart, og resultatene mangler kliniske implikasjoner.
Vi viste nylig en signifikant sammenheng withCys148Arg (T442C) variant og risikoen for PCa [7]. Videre evaluering av denne varianten er garantert å øke kraften i foreningen og studere den funksjonelle rollen av varianten ved PCA. Flere prøver er også nødvendig å vurdere konsekvensen av denne varianten til klinisk resultat og en potensiell rolle i prediktiv biomarkør for PCa.
I tillegg til de genetiske varianter, DNA kopiantall avvik er en av de hyppigst observerte genetiske endringer i familiær og sporadisk PCa [8] – [10]. I de fleste tilfellene rettet mot gener for de avvik ikke er fullstendig identifisert. Interessant nok har allel ubalanse (AI) er oppdaget ved 13q14.2-13q14.3, og det er en viktig begivenhet i utviklingen av lokaliserte PCa [11]. Forskjeller i 13q14 tap av heterozygositet (LOH) i forskjellige PCA-gruppene kan også bli brukt til å skille ikke klinisk signifikant PCa [12], [13].
I denne studien vi analyserte rolle
ARLTS1
i mer detalj, særlig rolle Cys148Arg (T442C) i PCa risiko. Kromosomaberrasjon i 13q14.3 ble analysert med aCGH å evaluere
ARLTS1
kopiere nummeret endres i PCA xenografter og cellelinjer. Uttrykket av
ARLTS1
ble undersøkt i kliniske kreftprøver, BPH prøver og også co-uttrykk dataskjemaet tidligere publiserte data ble analysert.
Metoder
Study befolkningen
Alle prøver som er samlet inn av finsk opprinnelse. Identifisering og samling av de finske HPC familier har blitt beskrevet andre steder [14]. De familiære prøvene genotypet i denne studien hadde minst en affektert første eller andre grad slektning. De kliniske karakteristikker av familiære pasientene kan finnes i tabell S1.
uselekterte rad prostatakreftpasienter ble diagnostisert med PCa mellom 1999 og 2005 ved Institutt for Urologi ved Tampere Universitetssykehus. Sykehuset er et regionalt henvisning senter i området for alle pasienter med PCA som resulterer i en uselektert, populasjonsbasert samling av pasientene. De kliniske karakteristika for påfølgende uselektert PCa kan finnes i tabell S1.
Et sett av benign prostatahyperplasi (BPH) tilfeller ble også brukt i denne studien. Diagnosen dette BPH kohort var basert på nedre urinveissymptomer, gratis uroflowmetry, og tegn på økt prostata størrelse oppnås ved palpasjon eller transrectal ultralyd. Hvis PSA ble forhøyet eller digital rektal undersøkelse eller transrectal ultralyd viste noe unormalt tegn på PCA pasientene gjennomgikk biopsier for å utelukke diagnoser av PCA høyverdig prostata intraepitelial neoplasi (PIN), atypisk liten acinar celleproliferasjon (ASAP), eller mistanke om malignitet.
Kliniske prostatakreft ble hentet fra Tampere universitetssykehus (Tammerfors, Finland) inkludert fersk frosne prostata vevsprøver som representerer benign prostatahyperplasi (BPH,
n
= 14), androgen-avhengige (
n
= 14) og hormon-ildfast (
n
= 6) karsinomer. Prøvene ble histologisk undersøkt for tilstedeværelse av tumorceller ved hjelp av H 60% kreft eller hyperplastiske epitelceller ble valgt for analysene. De BPH Prøvene ble erholdt fra prostatektomi prøver fra kreftpasienter og ble histologisk verifisert ikke å inneholde noen kreftceller. Prøver fra hormon-ildfast karsinom ble hentet fra transuretral resections av prostata (TURP) fra pasienter som opplever urinobstruksjon tross pågående hormonbehandling. Tiden fra begynnelsen av hormonell terapi for å progresjon (TURP) varierte fra 15 til 60 måneder. Bruk av klinisk svulst materialet ble godkjent av etisk komité Tampere Universitetssykehus.
Kontrollprøvene bestod av DNA-prøver fra anonyme, frivillige, og friske blodgivere hentet fra Blood sentrum av den finske Røde Kors i Tampere. De EDTA blodprøver brukes som referanse i Q-RT-PCR var fra friske anonyme givere.
Pasientinformasjon og prøvene ble oppnådd med full informert samtykke. Studien ble utført under egnede forsknings tillatelser fra etiske komiteer i Tampere universitetssykehus, Finland, samt Sosialdepartementet og Helse i Finland.
Cellelinjer og transplantater
PCa cellelinjer LNCaP, DU145, PC-3, NCI-660 og 22Rv1 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), mens LAPC-4 ble vennlig levert av Dr. Charles Sawyers (UCLA, Los Angeles, CA ), og Vcap cellelinjen ble gitt av Dr. Jack Schalken (Radboud University Nijmegen Medical Centre, Nijmegen, Nederland). Alle cellelinjer ble dyrket under anbefalte betingelser. Prec primære celler ble oppnådd fra Lonza (Walkersville, MD, USA). EP156T er et h-tert udødelig normal prostata epitelcellelinje [15] som ble stilt til rådighet av en av forfatterne (O.K.). DNA ble ekstrahert i henhold til standard laboratorie protokoller og total-RNA ble ekstrahert med TRIzol reagens (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).
Nitten humane PCA xenografter av LuCaP serie som brukes i direkte sekvensering og femten av dem som brukes i Q-RT-PCR ble gjort tilgjengelig ved en av forfatterne (RLV) og er blitt beskrevet andre steder [16], [17].
lymfoblastoide cellelinjer ble avledet ved Epstein-Barr virus transformasjon av perifere mononukleære leukocytter fra pasienter. Lymfoblastoide cellelinjer ble dyrket i RPMI-1640 medium (Lonza, Walkersville, MD, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og antibiotika. Celle pellets var snap-frosset og total RNA ble ekstrahert fra celler med Trizol® i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
Mutation screening
mutasjon screening av genomisk DNA ble utført ved hjelp av direkte sekvensering. Sekvensering ble utført i en Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Primere og PCR-betingelsene som brukes i mutasjon screening er tilgjengelig på forespørsel.
Genotyping
Genotyping ble gjort med Custom TaqMan® SNP genotyping analysen bruker ABI Prism 7900HT sekvens deteksjonssystem (Life Technologies Corporation , Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Primere og prober for Cys148Arg (T442C) SNP rs3803185 ble levert av Applied Biosystems via Fil Builder 3.1 software.
Kvantitativ sanntid revers transkripsjon-PCR
Gene uttrykk analyser ble gjort ved hjelp av LightCycler ® (Roche, Mannheim, Tyskland) og Bio-Rad CFX96 ™ real-Time PCR deteksjon system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Total RNA ble isolert fra cellelinjer, tumor kliniske prøver og xenografter som tidligere beskrevet [18], [19]. RNA fra cellelinjer ble revers transkribert til første-cDNA ved hjelp av Super ™ III First-Strand Synthesis SuperMix kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og tilfeldige heksamer. RNA fra kliniske prøver og tumor-xenografter ble reverstranskribert som beskrevet tidligere [18], [19]. Normal menneskelig prostata RNA ble hentet fra Ambion (Cambridgeshire, Storbritannia). For LightCycler® analyser, ble primere og probe sett hentet fra TIB MolBiol (Berlin, Tyskland). PCR-reaksjonene ble utført med en LightCycler® Faststart DNA Master
PLUS HybProbe kit (Roche, Mannheim, Tyskland). LightCycler® programvare (Roche, Mannheim, Tyskland) ble anvendt for dataanalyser. Den TaqMan analysen for
ARLTS1
ble brukt for Bio-Rad analyser. Primerne og probene ble oppnådd fra TIB MolBiol (Berlin, Tyskland). Bio-Rad iQ Supermix ble brukt for PCR reaksjoner og CFX Manager Software ™ versjon 1.6 for dataanalyse. Expression nivåer av
ARLTS1
ble normalisert mot husholdningsgenet
TBP plakater (TATA boks bindende protein) eller mot RNA-nivåer.
TBP
ble valgt som referanse genet, fordi det er ingen kjente retropseudogenes for det, og uttrykk for
TBP
er lavere enn for mange vanlige, rikelig uttrykt referanse gener [20] .
Western blotting
Cellene ble lysert i en buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Triton-X-100, 1 mM DTT, 1 mM PMSF og 1 × komplett proteasehemmer cocktail (Roche, Mannheim, Tyskland). Lysater ble sonikert 4 x 30 s med Bioruptor instrument (Diagenode, Liege, Belgia) og cellerester ble fjernet ved sentrifugering. Proteiner ble separert ved polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til PVDF-membran (Immobilon-P; Millipore, Billerica, MA, USA). Primære antistoffer som ble brukt var anti-ARL11 (Aviva Systems Biology, San Diego, CA, USA) og anti-aktin (pan, klone ACTN05, Neomarkers, Fremont, CA, USA), som ble oppdaget av HRP-konjugert sekundære antistoffer (DAKO, Danmark) og Western blotting luminalen reagent (Santa Cruz Bioteknologi, CA, USA) ved autoradiografi.
Array komparativ genomisk hybridisering
Array komparativ genomisk hybridisering (aCGH) ble utført på PCA cellelinjer og transplantater med human Genome CGH Microarray Kit 244A (Agilent, Santa Clara, CA, USA), og som beskrevet i Saramäki OR et al, 2006 [19].
Statistisk analyse
Forbund Cys148Arg (T442C) variant ble testet av logistisk regresjonsanalyse i SPSS statistisk programpakke (SPSS 15.0, SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Sammen med kliniske og patologiske trekk ved sykdommen (debutalder, PSA-verdi ved diagnose, T, N og M-scenen, WHO klasse og Gleason score) ble testet blant familiære og uselekterte PCA tilfeller ved Kruskal-Wallis test, Fishers eksakte test, og t-test inkludert i R «Stats» pakken. PCA pasienter ble klassifisert til å ha en aggressiv sykdom hvis de hadde noen av de følgende egenskaper: et lokalt avansert eller metastatisk tumor (trinn T3, T4, N1, eller M1, basert på patologi hvis radikal prostatektomi ble gjort, ellers klinisk stadium), svulst Gleason grad ved diagnose ≥7, dårlig differensiert Karakter (WHO grad III, hvis ingen Gleason grad tilgjengelig) eller forbehandling PSA ved diagnose ≥20 ng /ml.
Co-uttrykk analyse av
ARLTS1
i tidligere publiserte microarray datasett
ARLTS1
co-uttrykk signatur ble generert fra GeneSapiens [21] database av mRNA uttrykk.
ARLTS1
uttrykk blant 1587 tumorprøver og blant 497 normale prøver ble bestemt. Vi brukte Pearson korrelasjon for å identifisere gener som positivt og negativt korrelert med
ARLTS1
blant normale prøver og tumorprøver.
Funksjonell merknad analyse
gensettene utforsket for anriking av funksjonell merknads kategorier som genet ontologi (GO), ved hjelp av verktøy innen EASE program (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [22]. De 100 gener som ble positivt korrelerer med
ARLTS1
blant normale prøver ble sjekket for beriket Gene ontologi.
Resultater
Hele kodende området av
ARLTS1
ble tidligere vist i totalt 164 familiære PCA pasienter, og i en total av 377 uselekterte PCA pasienter, så vel som i 381 kontrollprøver [7]. Her Cys148Arg (T442C) variant ble ytterligere genotypet i 48 familiære PCA pasienter, 1471 uselekterte PCA pasienter, 375 BPH pasienter og 379 kontroller. Ved å benytte våre tidligere data og genotyping mer familiære og uselekterte PCA tilfeller validert vi en statistisk signifikant sammenheng mellom Cys148Arg (T442C) og PCa risiko (tabell 1). Når du vurderer de familiære PCA saker, og foreningen med risiko allelet C, homozygot skjemaet CC nådd et
P
verdi 0,019 (OR 1,67; 95% KI 1,08 til 2,56). Innenfor uselekterte tilfeller risikoen var også signifikant (OR 1,52, 95% KI 1,18 til 1,97,
P
= 0,001). Når man kombinerer datasettene av familiære og uselekterte tilfeller (2060 prøver totalt) ble Cys148Arg (T442C) variant funnet å være assosiert betydelig med PCa risiko (OR 1,54, 95% KI 1,20 til 1,98,
P
= 0,0007 ). Signifikant sammenheng ble bare funnet når man sammenligner frekvensen på homozygot form av risikoen allelet C til frekvensene av de homozygote formen av villtype-allelet T. Det ble ikke funnet mellom frekvensen av CC og BPH (tabell 1).
Når studere segregering av Cys148Arg (T442C) CC genotype i 86 familier der indeksen ble oppdaget som en transportør, komplett segregering av varianten CC med kreft fenotype ble sett i en familie (familie 427 i fig . 1). I resten av familiene segregering var ufullstendig, men indikerer en klar sammenheng med
ARLTS1
genotype CC eller TC og kreft fenotype (familier 402 og 408 i Fig. 1).
Squares representerer menn ; sirkler representerer kvinner. Åpne symboler angir ingen svulst, og fylte symboler betegne prostata krefttilfeller. + Angir tilstedeværelse av T442C varianten i DNA-prøven av familiemedlemmer, etterfulgt av den faktiske genotype. En pil indikerer den enkelte i utgangspunktet screenet for
ARLTS1
sekvensvarianter. Alder ved diagnose for pasienter med prostatakreft (i år) er angitt nedenfor symbolet for hvert familiemedlem. En stjerne (*) betegner personer uten sample tilgjengelig.
Direkte sekvensering ble brukt til å undersøke frekvensene av
ARLTS1
varianter i kliniske svulster prostata. I de kliniske prostata karsinom, fant vi varianter på fire steder, Gly65Val (G194T), Pro131Leu (C392T), Cys148Arg (T442C) og Trp149Stop (G446A) (tabell 2). Ved Cys148Arg (T442C) område, hyppigheten av kreftrisikoen forbundet genotype CC var forholdsvis høy (28,3%) sammenlignet med den samlede hyppighet av familiær og ikke-valgte tilfeller 21,2% (tabell 1). Imidlertid ble den høyeste frekvensen av Cys148Arg (T442C) CC genotype detektert i xenograft prøver (42,1%). Dette er spennende fordi LuCaP xenograft prøver regnes som en svært homogen gjengivelse av PCa.
For å undersøke hvilken rolle Cys148Arg (T442C) genotype i
ARLTS1
uttrykk vi valgt 24 familiære pasienter , inkludert åtte fra hver genotype gruppe TT, CT og CC. Ekspresjon analyser ved Q-RT-PCR ble utført ved hjelp av RNA ekstrahert fra lymfoblastoide cellelinjer av pasientene.
ARLTS1
mRNA ble uttrykt forskjellig mellom de tre genotypgruppene (fig. 2). Uttrykket ble betydelig redusert hos pasienter som bærer CC genotypen (
P
= 0,02).
Bestemmes av Q-RT-PCR. *,
P
0,05. Kolonner, mener åtte personer; barer, SD.
ARLTS1
uttrykk nivåer ble også analysert i femten LuCaP xenograft prøver, seks PCA cellelinjer, to prostata epitel cellelinjer og i RNA fra normal prostata prøven. Blant de analyserte prøvene xenograft, en betydelig reduksjon i
ARLTS1
ekspresjon ble observert i noen av prøvene (13%) når sammenlignet med dets ekspresjon i normal prostata prøve (Fig. 3A). Totalt tap av ekspresjon ble observert i 11 (73%) av de xenograft prøvene (fig. 3A). To av xenograft prøver, LuCaP23.1 og LuCaP49, hadde høyere
ARLTS1
uttrykk nivåer i forhold til normalt vev. Seks av de fjorten (43%)
ARLTS1
nedregulert xenograft prøver hadde en genotype CC for Cys148Arg (T442C) variant. Når matrisen komparativ genomisk hybridisering (aCGH) ble utført ved hjelp av disse prøvene, 12/15 xenograft prøvene viste et tap på kromosom regionen 13q14.3 (Fig. 3A).
Cys148Arg (T442C) genotype samt som choromosomal aberrasjon vises. C, Cys148Arg (T442C) variant i to kliniske prøver kreft vev og i to normal blod DNA (sekvensene er i revers orientering). * Bestemt som i Saramäki OR et al., 2006.
I PCA-cellelinjer, 5/6 (83%) viste en redusert eller tapt ekspresjon av
ARLTS1
sammenlignet normal prostata-RNA (fig. 3A). En
ARLTS1
locus sletting ved 13q14.3 ble funnet i PC-3, Vcap, LNCaP og DU-145. Blant disse er sistnevnte hadde også CC genotype for Cys148Arg (T442C). Interessant, Cys148Arg (T442C) variant var den eneste
ARLTS1
variant funnet i noen av PCA-cellelinjer. Prostata epitelcellelinje EP156T viste tap av uttrykk. Disse resultatene sannsynlig indikerer at
ARLTS1
uttrykk er lav i PCA epitelceller.
ARLTS1
uttrykk ble også vurdert med samme tilnærming i et panel av fjorten BPH vevsprøver , fjorten primære og seks hormon-ildfast tumorprøver (fig. 3B).
ARLTS1
uttrykk var signinificantly lavere (
P
= 0,01) i kliniske svulster i forhold til BPH prøver, noe som ytterligere støtter sin rolle som en tumor suppressor protein (fig. 3B).
i kliniske tumorer prostata, ble eksistensen av LOH studert. Kimlinje DNA fra pasienter som bærer Cys148Arg (T442C) varianten ble analysert ved direkte sekvensering. Sekvensering viste resultatene at i to tilfeller (eksempler 261 og 530) den T-allelet i blod hadde blitt erstattet med et C-allel i kreftvev (Fig. 3C), som antyder en rolle for
ARLTS1
i tumor suppresjon dvs. inaktivering av begge alleler i kreftutvikling. Når kliniske parametre (WHO grad, Gleason og T-score) ble undersøkt, en av de to varianten førende «LOH-pasienter» hadde en Gleason score på 9 og WHO grad av tre, noe som indikerer en aggressiv form for sykdommen. Den andre saken hadde en WHO grad av tre, men ingen Gleason score var tilgjengelig.
ARLTS1 uttrykk ble videre bestemt ved Western blotting (Fig. 4). Cellelysater var tilgjengelig fra seks prostata kreft cellelinjer, (22Rv1, LAPC-4, PC-3, Vcap, LNCaP, DU-145) og fra normal prostata epitel cellelinje EP156T. ARLTS1 uttrykk ble svært konvergent å ARLTS1 mRNA status viste i fig. 3A. Som forventet, cellelinjer LNCaP, DU-145 og EP156T viste negative uttrykk. I prostata kreft cellelinjer 22Rv1 og PC-tre ARLTS1 uttrykk ble tilsvarende relative mRNA uttrykk verdier, mens i PCA cellelinje LAPC4 protein uttrykk status var lavere enn mRNA uttrykk nivå. PCA-cellelinjen VCap viste den høyeste ARLTS1 uttrykk som ikke var tilsvarende negativ relativ ekspresjonsstatus sett i Q-RT-PCR.
Proteinekspresjon status i seks prostatacancercellelinjer og i en normal prostata epitelisk cellelinje. Aktin er vist som en lasting kontroll. ARL11 forventet /observert Mw 21,4 kDa. En ikke-spesifikke bånd er merket med en stjerne (*).
Når kliniske kjennetegn (alder ved diagnose, PSA-verdi ved diagnose, T, N og M-scenen, WHO klasse og Gleason score ) ble inkludert i analysene av germline genotype data ble CC genotype signifikant assosiert med en yngre alder ved diagnose og PSA-verdi (
P
= 0,05 og
P
= 0,03, henholdsvis) blant den uselektert materiale. Dette fenomenet ble også observert i vår tidligere studie der CC genotypen av Cys148Arg (T442C) var assosiert med høy Gleason score (
P
= 0,01) og høye PSA (≥ 7) ved diagnose (
P
= 0,05) [7]. Når sammenhengen mellom aggressiv sykdomsstatus og forekomst av CC genotype ble undersøkt, fant vi en statistisk signifikant sammenheng (
P
= 0,02) blant de umerkede tilfellene (tabell 3). Innenfor familiære PCA tilfellene ble ingen sammenheng funnet mellom CC genotype på Cys148Arg (T442C) locus og noen av de kliniske variabler eller med aggressiv PCa.
ARLTS1
uttrykk i forskjellige vev i kroppen er vist i figur S1. Figuren illustrerer at
ARLTS1
er sterkt uttrykt i hematologiske og lymfesystemet. Resultatene fra co-uttrykk analyse viser en sterk sammenheng med immunsystemprosesser, avslører en berikelse score for klyngen av 6,67 og en p-verdi på 2.1e-7. Disse resultatene ble generert fra de 100 gener med en korrelasjonsverdi som er større enn 0,3 blant normale prøver. Blant kreftprøver, den kategorien av immunsystemprosesser hadde høyest berikelse scorer 14.89 med en p-verdi på 5.3e-21 og justert Benjamin score på 2.8e-17. Vi har ikke identifisert noen sterk gen ontologi forbundet med de 100 gener som er negativt korrelert med
ARLTS1
blant kreftprøver. Vi bekreftet våre funn ved hjelp av et eget datasett fra expo (IGC. Expression Prosjekt for Oncology 2008 [https://www.intgen.org/expo.cfm]). Resultatene viser at 56% av genene ble identifiseres vanligvis for positivt å korrelere med
ARLTS1
i begge datasett som består av kreftprøvene. Genene med en positiv korrelasjon over 0,3 identifisert i skjæringspunktet ga en meget sterk gen ontology anrikning Resultatet 18,12 for immunsystemprosess med en p-verdi på 2.1e-24 som vist i figur S2. Genuttrykk blant PCA prøvene viser seg å være svært lav for
ARLTS1
. Vi kunne ikke pålitelig etablere noen signifikant sammenheng til PCA
ARLTS1
hjelp genuttrykk data på grunn av lave nivåer.
Diskusjoner
ARLTS1
genet og
ARLTS1
polymorfismer har vist seg å ha en rolle i patogenesen av mange kreftformer. Tull polymorfisme på slutten av koderegionen har blitt avslørt for å disponere til familiær kreft [8]. Funksjonelle analyser av det avkortede protein har indikert at den Trp149Stop varianten kan påvirke apoptose og tumorundertrykkelse. En annen
ARLTS1
variant kan missense polymorfisme Cys148Arg (T442C), og spesielt CC genotype, har blitt funnet å være signifikant assosiert med høy risiko familiær brystkreft [4]. Den samme varianten ble også funnet å være assosiert med predisposisjon for melanom [5]. Rollene som
ARLTS1
varianter har også blitt studert med tykktarmskreft [23] og kronisk lymfatisk leukemi (KLL) [24], men ingen assosiasjoner har blitt funnet.
I denne studien har vi viste en tilknytning til
ARLTS1
Cys148Arg (T442C) variant og forhøyet PCa risiko, validere våre tidligere resultater [7]. Tidligere sekvensert vi 164 familiær og 377 uselekterte PCA prøvene sammen med 809 kontroller, og Cys148Arg (T442C) viste signifikant sammenheng med PCa risiko (OR 1,19; 95% KI 1,02 til 1,39,
P
= 0,020), men betydning ikke holder når dataene ble delt inn i familiære og uselekterte tilfeller. Men når C-allelet ble antatt å være recessiv, alle data (familiær og ikke-valgte) viste signifikant sammenheng mellom CC genotype og PCa risiko (
P
= 0,005). Her ble genotypet flere familiære og uselekterte PCA tilfeller og Cys148Arg (T442C) viste en statistisk signifikant sammenheng med PCa risiko blant både familiære (OR = 1,67, 95% CI = 1,08 til 2,56,
P
= 0,019) og umarkert PCA pasienter (OR = 1,52, 95% CI = 1,18 til 1,97,
P
= 0,001). I kombinasjon av data fra både familiære og uselekterte tilfeller ble den samlede risikoen enda mer økt (OR = 1,54, 95% CI = 1,20 til 1,98,
P
= 0,0007). Det faktum at tidligere analyse ikke holder når det deles i underklasser kan derfor forklares ved størrelsen av studien. Denne studien har en effekt på omtrent 100% for å påvise krets sammenlignet med 94% av den tidligere studie. Videre oppfølging med større utvalg ville trolig gjøre foreningen enda sterkere. Vi fant ingen sammenheng mellom denne varianten og BPH, tyder på at rollen til Cys148Arg (T442C) er mindre og kreft predisponerende effekten fremkommer bare i mer avanserte tilfeller, spesielt de med en aggressiv PCa status. Alternativt BPH og PCa er uavhengige hendelser eller i det minste
ARLTS1
er ikke følgeskader for BPH transformasjon til PCa. Jo lengre oppfølging av BPH pasientene er nødvendig for å vurdere spørsmålet om pasientene bærer CC genotype (16%) er de som utvikler kreft senere.
Bare homozygot form av C-allelet av Cys148Arg (T442C) variant resulterte i en forbindelse med PCa risiko i forhold til TT genotype. Dette understøtter resultatene fra tidligere undersøkelser med brystkreft [4] som viste at C er risikoen allele, mens T-allelet har en beskyttende eller nøytral effekt på karsinogenese.
ARLTS1
Cys148Arg (T442C) spesielt har en predisponerende effekt på sporadisk PCa. Videre er Cys148Arg var den eneste
ARLTS1
variant observert med en høyere frekvens blant PCA vevsprøver og transplantater, hvor frekvensene var 28,3%, og over 40 prosent. Dette indikerer også en sannsynlig rolle for
ARLTS1
i prostata kreftutvikling. Interessant nok var et totalt fravær av Trp149Stop (G446C) observert både i kliniske kreftprøver og i xenografter indikerer at denne varianten har ikke en viktig rolle ved PCA utvikling.
Styre befolkningen i vår studie var ikke i Hardy- Weinberg likevekt (HWE), noe som tyder på at Cys148Arg kan være en roman variant. I våre data, ble et overskudd av heterozygoter observert noe som kan indikere tilstedeværelse på over dominant utvalg eller forekomst av outbreeding. Fenomenet heterozygot fordel gjør det mulig for naturlig seleksjon for å opprettholde den polymorfisme. Det samme kontroll befolkningen har blitt brukt mange ganger i ulike analyser, og aldri før har det vært uharmoniske fra HWE [25]. Interessant, i Sahara afrikanske befolkningen, CC genotype finnes ikke, og i den asiatiske befolkningen er det bare til stede i en liten brøkdel (https://www.ncbi.nlm.nih.gov). Bare i løpet av den europeiske befolkningen gjør CC eksisterer i en større andel. Tatt i betraktning den mulige rollen
ARLTS1
i immunsystemet, kan det være at CC genotype har gitt en beskyttende effekt blant europeere.
