Abstract
Eksisterende data tyder på at NF-kappaB signalering er en viktig regulator av kreft-indusert skjelettmuskelsvinn. Imidlertid identifikasjon av komponentene i denne signalveien og av NF-kB transkripsjonsfaktorer som regulerer vinn er langt fra fullstendig. I musklene C26 svulst bærende mus, overekspresjon av dominant negativ (D.N.) IKKβ blokkert muskelsvinn med 69% og IκBα super repressor blokkert sløse med 41%. I motsetning til overekspresjon av D.N. IKKα eller D.N. NIK blokkere ikke C26-indusert sløse. Overraskende, overekspresjon av D.N. p65 eller D.N. c-Rel påvirket ikke muskelsvinn. Genom-wide mRNA uttrykk matriser viste oppregulering av mange gener som tidligere innblandet i muskelatrofi. For å teste om disse oppregulert genene var direkte mål av NF-kB transkripsjonsfaktorer, sammenlignet vi genome-wide p65 binding til DNA i kontroll og cachectic muskel ved hjelp av chipsekvensering. Bioinformatiske analyse chip-sekvense data fra kontroll og C26 muskler viste svært lite p65 binding til gener i kakeksi og lite som tyder på at oppregulert P65 bindende påvirkninger genuttrykket forbundet med muskel basert kakeksi. De p65 CHIP-seq dataene er i overensstemmelse med våre funn av noen betydelig endring i proteinbinding til en NF-kB oligonukleotid i en gel-skift-analyse, ingen aktivering av NF-kB-avhengige reporter, og ingen virkning av dnp65 overekspresjon i musklene av tumorbærende mus. Til sammen utgjør disse data støtter ideen om at selv om inhibering av IκBα, og spesielt IKKβ, blokkerer kreft-fremkalt sløse, alternative NF-kB signalveien ikke er nødvendig. I tillegg, nedstrøms NF-kB transkripsjonsfaktorer, p65 og c-Rel ser ikke ut til å regulere de transkripsjonelle endringer indusert ved C26 tumoren. Disse dataene er konsistent med økende mengde litteratur som viser at det er NF-kB-uavhengige substrater av IKKβ og IκBα som regulerer fysiologiske prosesser
Citation. Cornwell EW, Mirbod A, Wu CL, Kandarian SC, Jackman RW (2014) C26 Cancer-Induced muskelsvinn Er IKKβ avhengig og NF-kappaB-Independent. PLoS ONE 9 (1): e87776. doi: 10,1371 /journal.pone.0087776
Redaktør: Imed Eddine Gallouzi, McGill University, Canada
mottatt: 9 juli 2013; Godkjent: 30 desember 2013; Publisert: 29 januar 2014
Copyright: © 2014 Cornwell et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) award AR060217. (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm.) De organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Konkurrerende interesser .: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kakeksi er en metabolsk tilstand som er forbundet med mange kroniske sykdommer, og det er preget av alvorlig avmagring av skjelettmuskulatur og fettvev som ikke kan reverseres ved å øke kaloriinntaket [1]. Kreft kakeksi er sett i de fleste av avansert kreft, men det er mest sett i kreft i tarmkanalen lunge og øvre GI [1]. Kreftpasienter med kakeksi har en lavere livskvaliteten som følge av svekket immunfunksjon, insulinresistens, svakhet, tretthet og [2]. Pasienter med selv mild kakeksi kan ikke tolerere cellegiftbehandling, noe som ytterligere forverrer sykdommen [3]. Kakeksi er anslått å bidra til dødsfall av ca 30% av kreftpasienter [4]. For alle alvoret i denne lidelsen, behandlinger forbli palliativ. Siden de mer alvorlige konsekvenser av kakeksi synes å ligge med skjelettmuskel tap [1], utvikle en bedre forståelse av den cellulære signaleringsmekanismer og genregulering i muskelen kan gi nye terapeutiske strategier for behandling av denne tilstand.
Forskning på forskjellige typer kreft har foreslått en rolle for NF-kB signalering og NF-kB transkripsjonsregulering i muskelsvinn [5], [6], [7]. Inhibering av den klassiske NF-kB vei, ved overekspresjon av IkappaBalpha super repressor (IκBαSR), blokkert muskelsvinn i Lewis lungekarsinom (LLC) tumor-bærende mus med 50% [5]. Den prototypiske NF-kB transkripsjonsfaktor, p65 (Rel A), viste økt binding i en ELISA-basert NF-kB oligonukleotid-analysen i muskel fra mus med LLC. Den økte binding ble reversert når IκBαSR ble overuttrykt i muskel, noe som tyder på at p65 er et NF-kB transkripsjonsfaktor involvert i muskelsvinn på grunn av kreft, i det minste i mus med LLC [5]. Fosforylering av p65 på Serine 536, antatt å øke transkripsjonen aktivitet, er økt i muskel fra C26 svulst bærende mus [6] og i muskel fra mennesker med kreft i bukspyttkjertelen [8]. På den annen side har enkelte resultatene på rollen til NF-kB transkripsjonsfaktorer i kakeksi vært usikre. For eksempel viste gel-skift-assays små økninger i binding av transkripsjonsfaktorer til en NF-kB oligonukleotid i muskler fra C26-tumorbærende mus [6], [9], og i en annen studie var det ingen økning i proteinbinding til en NF-KB kB-oligonukleotid i kakektiske rotter med Yoshida ascites hepatoma [10]. Det er mulig at ulike typer kreft indusere muskelsvinn via ulike cellulære mekanismer. Likevel, bare en NF-kB signale protein (IκBα) og en NF-kB transkripsjonsfaktor (p65) har blitt studert i kreft-indusert muskelsvinn, og vi vet ikke atrofi induserende gener som er rettet av NF-kB transkripsjon faktorer.
Hensikten med denne studien var å identifisere de kjente pattedyr NF-kB signalanlegg proteiner og NF-kB transkripsjonsfaktorer som regulerer muskel sløse på grunn av kreft. Et annet formål var å identifisere de NF-kB målgener for et genom-bred nivå for å bestemme om en NF-kB transkripsjonen nettverk regulerer kreft-fremkalt muskelsvinn. Vi testet om NF-kB signal proteiner er nødvendig for muskelsvinn ved overekspresjon dominant negativ (D.N.) former oppstrøms NF-kB kinaser. Disse er inhibitoren av kappaB kinase alfa (IKKα), IKKβ, og NF-kB induserende kinase (NIK). Rollen IκBα ble testet ved overekspresjon av en trans-dominant super repressor form av IκBα (IκBαSR). Hvorvidt NF-kB transkripsjonsfaktorer Rel A (p65) eller c-Rel kreves for muskelsvinn ble testet ved overekspresjon av D.N. p65 eller D.N. c-Rel, respektivt. NF-kB transkripsjonsfaktorbindende til en NF-kB oligonukleotid og NF-kB transkripsjonen aktivitet av en reporter ble målt i kakektiske muskler. For å finne ut om de kanoniske NF-kB transkripsjonsfaktorer, p65, bundet målgener som kan være relatert til atrofi regulering, utførte vi ChIP-sekvensering i muskel fra kontroll- og tumorbærende mus i forbindelse med måling av global genekspresjon som en funksjonell mål på kakeksi-mediert genuttrykk.
Dette er første fordypning på rollen til NF-kB signalering og av NF-kB transkripsjonsfaktorer i reguleringen av muskelsvinn som følge av kreft. Selv om hemming av IκBα, og spesielt IKKβ aktivitet, vesentlig tilbake muskelsvinn, var det ingen effekt på fiber sløse grunn av hemming av IKKα eller NIK. Overraskende, overekspresjon av dominerende negative p65 eller c-Rel viste liten eller ingen effekt på muskelfiber sløse. Videre var det ingen endring i NF-kB transkripsjonsfaktor binding i en gel-skift assay eller i NF-kB aktivitet reporter. Viktigere, oppregulering av atrofi eller cytokin gener funnet av genekspresjon mikromatriser ble ikke formidlet av p65-holdige transkripsjonsfaktorer som vurderes av Chip-seq. Våre funn er i samsvar med de av Cai et al. [5] viser en rolle for IκBα i kreft sløse, og for første gang viser vi at IKKβ er nødvendig for utvikling av kreft kakeksi, men IKKα og NIK ikke. Vår dyptgående analyse av NF-kB signalering og transkripsjon under kreft kakeksi viser at IKKβ er å regulere genuttrykket av andre enn NF-kB, i hvert fall i skjelettmuskulatur transkripsjonsfaktorer i løpet av C26 kreft kakeksi. Disse resultatene viser en uventet, men viktig del av reguleringen av kreft-indusert muskelsvinn.
Metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Charles River Campus Boston University Institutional Animal Care og bruk Committee (protokoll nummer: 12-016). Alle operasjoner ble utført under ketamin /xylazin anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Alt personell som arbeider med dyr har gjennomgått obligatorisk IACUC opplæring og årlig gjennomgang: https://www.bu.edu/orctraining/animal/lacf/
Cells
C26 adenokarcinomceller (National Cancer. Institute, Frederick, MD) ble utsådd og holdt ved 37 ° C, 5% CO
2 i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium, høy glukose (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen), 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen), og 1% L-glutamin (Invitrogen). Før inokulering i mus, ble C26-celler trypsinisert og vasket to ganger med fosfatbuffret saltvann og deretter re-suspendert i en 01:01 oppløsning av 1 x PBS og matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
Dyr
Åtte uker gamle, mannlige CDF1 mus kjøpt fra Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA) ble brukt for alle eksperimenter. Mus ble behandlet i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Dyrene ble opprettholdt på 12:12 L /D syklus, ble huset individuelt, og fikk tilgang til mat og vann
ad libitum
. Etter tre dager med akklimatisering, ble dyrene randomisert til en ikke-tumor-kontroll-gruppe eller en C26 tumorbærende gruppe. Kontrolldyr fikk et inokulum av 150 ul 1 x PBS /matrigel (01:01) subkutant inn i høyre og venstre flanker. Tumorbærende dyr fikk et inokulum av 5,0 × 10
5 C26 celler suspendert i 150 mL PBS /matrigel (01:01) injisert subkutant i høyre og venstre flankene; Dette ble utført på lett bedøvet mus (40 mg /kg ketamin 5 mg /kg xylazin).
Plasmid DNA-injeksjon i muskelen
Plasmid-DNA ble isolert ved anvendelse av QIAGEN Endotoksin-Free Mega Kit i henhold til produsentens anvisninger. Plasmid DNA ble injisert i muskelen 10 dager etter tumor-vaksiner, som tidligere beskrevet [11]. I korthet, plasmid-DNA ble etanol-presipitert og resuspendert i 0,45% sterilt saltvann /DDH
2O. Alle mus som mottok kirurgi fikk profylaktiske behandlinger med 0,1 mg /kg Buprenorfin injeksjon før operasjonen. Mus ble anestetisert med ketamin (80 mg /kg) og xylazin (10 mg /kg). De tibialis anterior (TA) muskler fra hvert dyr ble injisert med 35 pg av ekspresjonsplasmidet i 25 ul av 0,45% sterilt saltvann ved hjelp av en 29-gauge insulinsprøyte. Etter plasmidet injeksjon ble musklene stimulert med en lavspent elektrisk strøm ved bruk av to-paddle elektrodene [12] som leverte 6 pulser ved 86 V /cm i 20 ms med en interpuls intervall på 200 ms (Electro Square amper ECM 830, BTX) . Dette er en lav-dose elektroporering protokoll som ikke induserer skade [13], [14], [15]. På dag 25 etter inokulasjon, ble TA muskler fjernet fra både kontroll- og C26 tumor-bærende mus, veiet, og enten hurtigfrosset i flytende nitrogen for biokjemisk analyse eller monteres på tungedepressorer, innleiret i vev-frysemedium, og frosset i flytende nitrogen kjølte isopentan for histokjemisk analyse. Injeksjon av NF-kB reporter plasmid ble utført på samme dag som tumorcelle inokulering. Injeksjon av d.n.p65-EGFP ble gjort på dag 6 etter tumorinokulasjon
Plasmider
De ekspresjonsplasmider brukte var følgende:. D.N. IKKα-EGFP, D.N. IKKβ-EGFP, IκBαSR-EGFP, D.N. NIK-GFP, D.N. p65-EGFP, og D.N. c-Rel-EGFP. Den D.N. IKKα-EGFP (K44M) og D.N. IKKβ-EGFP (K44M) ekspresjonsplasmider som koder for EGFP-fusjonsproteiner av kinase-død former IKKα og IKKβ som vi har beskrevet i detalj [11]. Vi konstruerte IκBαSR-EGFP-fusjons plasmid som vi har beskrevet i detalj [16]. Den D.N. p65 (313) er en avkortet form av p65 som mangler de C-terminale domener transaktivering og var en gave fra D. Guttridge [17]. Vi har opprettet en D.N. p65-EGFP-fusjons plasmid ved å klone den N-terminale 313 aminosyre-kodende DNA-sekvensen av p65 inn i de HindiII-SalI-setene av pEGFP-N1 (313 + 238 = 551 A.A.). Vi bekreftet kloning ved sekvensering av plasmidet, og testet dominant negativ funksjon i C2C12 myotubes, hvori D.N. p65-EGFP var i stand til å blokkere TNFa aktivering av en NF-kB reporter ved 90% (figur S1A). For å skape en D.N. c-Rel-EGFP plasmid, anvendte vi en mus c-Rel mal, en gave fra T. Gilmore, kopiering nukleinsyresekvensen for Rel homologi domenet av genet inneholdende A.A. 1-288 (som mangler de to N-terminale domener transaktivering) og tilsetning av restriksjonsseter for å klone fragment i leseramme inn i EcoRI-KpnI-setene med pEGFP-N1. Den resulterende D.N. c-Rel-EGFP innsats ble kontrollert ved sekvensering og fungerte som en dominerende negativ Rel fordi dens uttrykk redusert NF-kB reporter nivåer i C2C12 myotubes (Figur S1B). Den D.N. NIK-GFP uttrykk plasmid, en gave fra A. Kumar, koder en kinase død form av NIK og EGFP fra en separat cistron [18].
immunhistokjemi
TA muskel fiber tverrsnittsareal av plasmid-transfekterte fibere (som uttrykker grønn fluorescens-fusjonsproteiner) ble sammenlignet med fiber områder i de samme områder som ikke tar opp plasmidet i begge tumorbærende og kontrollmus. Som tidligere beskrevet [11], frosne seksjoner ble tatt fra midten av buken på TA (7,5 mikrometer tykt), som er montert på Tissue Tack objektglass (Polysciences, Inc, Warrington, PA, USA) og fiksert i 4% paraformaldehyd. Tverrsnitt ble vasket, blokkert i 10% BSA og inkubert med kanin anti-laminin 1:200 (L9393, Sigma-Aldrich) i 1% BSA, etterfulgt av en Texas Rødt-X-geit-anti-kanin-IgG fluorescerende fargestoff-konjugert sekundært antistoff 1 :200 (T-6391, Invitrogen). Snittene ble montert på et dekkglass med Vectashield montering medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Bilder ble visualisert ved 20X forstørrelse ved hjelp av en invertert lysmikroskop (Nikon Eclipse TS 100). Alle bildene ble tatt med en SPOT RT kamera (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, USA). Fiber tverrsnitt ble beregnet ved hjelp av Meta-Morph Imaging System (Universal Imaging, Glendale, WI, USA). Gjennomsnittlig antall fibre målt per muskel var 200.
Isolering av råolje atom ekstrakter
Crude atom utdrag fra hind lem muskler av 13-23 dag C26-inokulert CD2F1 hannmus og alder matchet kontroller ble isolert i henhold til Kumar og Boriek [19] med noen modifikasjoner. Alle isoleringstrinn og spinn ble utført ved 4 ° C ved bruk av kjølt buffere. Flash frosne muskler ble suspendert ved 1 mg muskelvekt pr 18 ul buffer (10 mM HEPES [pH 7,9], 10 mM KCI, 3 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA [pH 8], 0,1 mM EGTA, 0,1% Triton X-100 , 1 mM ditiotreitol, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid, og protease-inhibitor cocktail), og straks homogenisert på is. Homogeniserte muskler ble inkubert på is i 5 minutter, etterfulgt av 20 s med kraftig hvirvel. Kjerner ble spunnet på 3000 ×
g
i 10 min. Supernatanten ble fjernet og lagret ved -80 ° C. Nukleære pellet ble vasket med 1 ml av modifisert cytoplasmisk ekstrakt buffer uten Triton X-100 og sentrifugert ved 3000 x
g
i 3 min. Pelletene ble resuspendert i 4 mL av kjerneekstrakt-buffer (20 mM HEPES [pH 7,9], 420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 25% glyserol, 1 mM ditiotreitol, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid, og protease-inhibitor cocktail) per mg opprinnelige muskelvekt. Resuspendert nukleære pellets ble inkubert på is i 30 minutter med 15 s med sterk virvling hvert 10 min. Prøvene ble sentrifugert ved 16000 x
g
i 20 minutter og kjerne ekstrakt (supernatant) ble fjernet og lagret ved -80 ° C.
Elektroforetisk mobilitet skift analyse (EMSA)
Proteinkonsentrasjonen konsentrasjonen~~POS=HEADCOMP av rått muskel nukleære ekstrakter ble bestemt ved anvendelse av Bradford-analyse (Bio-Rad Protein assay Dye Reagent, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Dobbelt strandet NF-kB IRDye 700 infrarøde dye end-merket oligonukleotid, 5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3 «(understreking indikerer NF-kB bindingssetet), ble kjøpt fra LI-COR biovitenskap (Lincoln, NE, USA). Konsensus umerket konkurrent NF-kB oligonukleotid ble kjøpt fra Integrerte DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA, USA). EMSA bindende reaksjonen ble utført ved hjelp av Odyssey EMSA Buffer Kit (LI-COR biovitenskap) med noen modifikasjoner. Totalt reaksjonsvolum ble fremstilt i 20 pl. Bindings-reaksjonen reagenser ble satt til renset vann i den følgende rekkefølge: 2 ul bindingsbuffer (100 mM Tris, 500 mM KCl, 10 mM DTT; pH 7,5), 2 pl av 25 mM DTT /2,5% Tween-20, 1 ug /ul poly dI • dC 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7,5, 50 fmole NF-kB IRDye 700 infrarødt fargestoff ende-merket oligonukleotid, og 15-20 ug kjerneekstrakt. Ved reaksjoner med umerket NF-kB konkurrent, umerket og merket oligonukleotider ble blandet før tilsetning til bindingsreaksjonen. Bindingsreaksjoner ble forsiktig blandet og inkubert i 25 min, ved romtemperatur, i mørke. Forut for at prøver, 2 ul av Orange lastes Dye (65% vekt /volum sukrose, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,3% w /v Orange G) ble tilsatt til 20 pl reaksjons og blandet forsiktig.
DNA-proteinkomplekser ble separert fra fri oligonukleotid på ikke-denaturerende 5% Tris-borat-EDTA, HOVED Klar Gel (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Prøvene ble underkastet elektroforese ved 76 V i 2 timer ved romtemperatur i mørket. Protein bundet til merkede oligonukleotid kompleksene ble visualisert ved hjelp av en Odyssey Infrared Imager (LI-COR biovitenskap).
NF-kB avhengig reporter aktivitet
På de angitte tidspunkter, TA muskler transfektert med en NF-kB avhengig luciferase reporter ble høstet og homogenisert i 1 ml Passive Lysis Buffer (Promega, Madison, WI) med protease og fosfatase-hemmere (Roche Applied Science, Indianapolis, iN). Homogenatene ble sentrifugert ved 5000 x
g
ved 4 ° C i 20 minutter. Supernatanten ble samlet opp og blandet med Luciferase Assay Reagent (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner. Luciferase aktivitet ble målt med en TD-20/20 luminometer (Turner Designs, Sunnyvale, CA, USA).
Western blot analyse
Protein konsentrasjon av muskellysatene i passiv lysis buffer ble bestemt ved bruk av av Bradford-analyse (Bio-Rad Protein assay Dye Reagent, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Femti til 75 mikrogram protein var denaturert og størrelse fraksjonert på 4-15% SDS-polyakrylamidgeler. Proteiner ble overført til en Immobilon-FL polyvinylidenfluorid-membran (Millipore, Bedford, PA, USA), blokkert i Odyssey blokkeringsbuffer (licor Biotechnology, Lincoln, NE, USA) og inkubert med det passende primære antistoff i henhold til produsentens instruksjoner. Antistoffer inkludert: anti-IKKα /IKK1 (IMG-5477, IMGENEX, San Diego, CA, USA), IKKβ /IKK2 (# 2684), NF-κB2 (P100 /P52; # 4882), og p-IκBα (# 9246 ) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), IκBα (sc-371), NF-kB p65 (sc-7151), c-Rel (sc-6363), og NIK (sc-7211) (Santa Cruz Biotechnology , Santa Cruz, CA, USA). Anti-GAPDH (G-9545) ble anvendt som en lastekontroll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Alexa Fluor 680 fluorescerende fargestoff-konjugert sekundært antistoff (Invitrogen) ble anvendt for visualisering med Li-Cor Odyssey infrarødt bildedannende system som er beskrevet tidligere [20].
RNA isolering
Gastrocnemius og plantaris muskler var høstes fra bedøvede kontroll- og tumor-bærende mus (25 dager etter inokulering), hurtigfrosset i flytende nitrogen, og lagret ved -80 ° C inntil videre behandling. Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Det ekstraherte total RNA ble ytterligere renset ved anvendelse av en RNase-fri DNase I kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) og en RNeasy Mini Kit (Qiagen) som tidligere beskrevet [21]. Ekstrahert RNA ble kvantifisert ved UV-spektrofotometri og kvalitetskontrolleres med en 1% denaturerende agarosegel. Prøvene ble også verifisert av Bioanalyzer 2100 analyse og hadde en minimal RIN rekke 8.0 (Agilent, Palo Alto, CA, USA).
Microarray analyse
For microarray analyse, RNA prøver beskrevet ovenfor ble sendt til Boston University Medical Center Microarray Kjerne Facility for forsterkning, merking og hybridisering på en mus Affymetrix Gene 1,0 ST array (Santa Clara, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner for å måle uttrykket av 28,132 godt kommenterte gener. Totalt 6 array-bilder (3 kontrollmuskelprøver og 3 C26 muskelprøver) ble kjøpt opp av Genechip Scanner 3000 TG og kvalitet vurderes av Affymetrix Expression Console (Santa Clara, CA, USA). Genekspresjon signalverdier ble samlet ved uttrykket filoppretter modul av GenePattern plattformen (Broad Institute, Cambridge, MA) og solid fler rekke analyse algoritme (RMA) ble anvendt for data forbehandling [22]. Brainarray MoGene 1,0 ST tilpasset CDF fil v.13 ble brukt for sonde merknaden [23]. . Begge
cel
filer og uttrykk verdier ble satt inn MIAME kompatibel NCBI Gene Expression Omnibus med tiltredelse Nummer: GSE48363 (link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc. cgi token = rnupvmqqyocggpk ? acc = GSE48363). Differensial genekspresjon ble beregnet ved hjelp av komparativ Marker Utvalg modul i GenePattern som sammenligner gjennomsnittsforskjeller mellom kontroll og C26 grupper ved toveispara t-tester. Parametere som brukes til å identifisere gener som ble forskjellig uttrykt i muskel fra tumorbærende mus var:
P
-value≤0.05,
q
-value≤0.05, og brett endre større enn 1,5 ganger . Opp- eller nedregulert genet listene ble lastet opp til DAVID Bioinformatikk database for funksjonell annotering og for genet ontologi oppdrag basert på den biologiske prosessen med gener sammenlignet med
Mus musculus
genom hvor terskelen av letthet score (en modifisert Fisher Exact P-verdi) ble satt til 0,01 og minimum gen telling av 2.
ChIP-sekvense
Gastrocnemius og plantaris muskler ble isolert fra kontroll (dvs. ikke-tumor -bærende) og C26 tumorbærende mus på dag 25 etter tumorinokulasjon. Ferskt dissekert muskel ble hakket og tverrbundet i 1% formaldehyd i 15 minutter, stoppet med glycin og deretter frosset i flytende nitrogen. For hver tilstand (dvs kontroll eller C26) plantarflexor muskel fra fire bein ble samlet, homogenisert, og kromatin isolert som vi beskrevet tidligere [21]. Dette materialet ble ultralydbehandlet for å gi kromatin fragmenter som var i gjennomsnitt 250 bp. En alikvot av sonikert kromatin ble satt til side for å bli brukt som inngangs fraksjonen til spon-PCR. Resten av kromatin ble fortynnet i IP-buffer og delt i en gruppe for inkubasjon med det p65-antistoff (Santa Cruz SC-372X) og en gruppe uten noen primære antistoff; dette ble gjort for kromatin fra både kontroll og C26 grupper. Prøver med og uten primært antistoff ble inkubert i 16 timer ved 4 ° C med konstant lav hastighet blanding og deretter de antistoff-komplekser kromatin ble tatt med Protein G magnetiske kuler. Den kromatin ble eluert fra kulene og tverrbinding reversert, etterfulgt av pronase /RNase behandling og utfelling av DNA. En tiendedel av materialet ble brukt for PCR for et gen som allerede vist seg å ha robust p65-binding for å teste p65 chip. Tre forskjellige DNA-bibliotekene ble gjort: kontroll p65 chip, C26 p65 chip, og chip med ingen primær antistoff. Bibliotekene ble forberedt for høy gjennomstrømming sekvensering ved hjelp av Illumina chip seq Bibliotek kit. En porsjon av hvert bibliotek ble undersøkt ved akrylamid elektroforese og SYBR-gull-farging for å anslå kvaliteten av størrelsen og intensiteten av det produkt som fremkommer som et smøre med en gjennomsnittlig størrelse på 350 bp. Hele prosedyren for fremstilling av de tre bibliotekene ble gjentatt en andre gang med nye muskelprøver for å ha to chip-seq biblioteker for hver av de tre gruppene. Bibliotekene ble sendt til The Whitehead Institute (Cambridge, MA) der de ble renset for adapter dimer ved hjelp Ampure XL perler. De rensede bibliotekene ble testet ved Bioanalyzer og qPCR kvalitetskontroll ble utført for å bestemme hvor mye av hvert bibliotek som skal brukes. Bibliotekene ble sekvensert ved hjelp av Illumina Solexa sekvensering på et GA II sequencer. De resulterende sekvenser fra kontroll og C26 prøver ble justert til musegenomet (MM9 versjon) med ELAND. Sekvensene ble sendt til vårt laboratorium i ELAND format.
De justeringer for de to uavhengige kontrollprøvene ble slått sammen og det samme ble gjort for de to C26 prøver. I hvert tilfelle ble dette gjort ved å kombinere .bam former av de justeringer på Galaxy nettsiden. Sekvensene ble deretter evaluert med FastQC pakke av kvalitetstester, som ble oppnådd som et frittstående program fra Brabaham Institute (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Etter den første FastQ analyse to operasjonene ble utført på chip-seq data: 1. vi fjernet PCR duplikater ved hjelp samtools rmdup via Galaxy, og 2. igjen med samtools, vi tok fordel av kartleggings etiketter i eland data for å isolere bare leser kartlagt på unike steder i musegenomet. Sequence leser var 35 eller 36 basepar. De tre filer av chip-seq data var: kontroll p65-brikke (10700000 leser), C26 p65-brikke (11100000 leser), og en fil som representerer bakgrunn sekvens leser (8,5 millioner) oppnådd ved å kombinere kontroll- og C26 ultralydbehandlet kromatin som ble kjørt gjennom brikken uten en primær antistoff (ingen antistoff gruppe). Disse tre post-QC sekvens .bam filer er tilgjengelig online på: (https://drive.google.com/folderview?id=0B0Ph0YwXvamQektEaTFkcElSLTQ usp=sharing) De sammenstilte sekvensene ble konvertert til .sam format og lastes opp til toppen finder program i ChIPseeqer [24] med de følgende parametere: 1. terskel = 5, 2. gangers endring = 2 eller mer (i forhold til bakgrunnen), 3. fragment lengde = 250 bp, 4. topp lengde på minst 100 bp og 5 . peak separasjons minst 100 basepar. I tillegg til identifisering av kontroll og C26 P65 toppene i forhold til bakgrunnen (uten antistoff), ChIPseeqer identifiserte genet regionen av p65-binding topper (dvs. genomisk plassering av toppene).
sett av kontroll- og C26 P65 topper ble kjørt på PeakAnalyzer [25] (https://www.ebi.ac.uk/research/bertone/software#peakanalyzer) for å finne genet med den nærmeste TSS for hver topp. Dette genererer en liste av gener med topper mindre enn 100 kb fra TSS. Listene ble så sammenlignet med de lister av økt og redusert mRNA-ekspresjon fra styre vs. C26 mikroarray data ved hjelp av en algoritme perl plassert på en web-side som er utviklet av Jim Lund ved University of Kentucky (https://nemates.org/MA /progs /Compare.html).
positiv kontroll for ChIP
for å bekrefte riktig binding av p65 antistoff vi studerte brikke med PCR for to påfølgende høyt studert og bekreftet NF-kB promoter bindingssteder i mus IP-10 (Cxcl10) genet [26]. Denne brikken forsøket også brukt et antistoff for p50 (Santa Cruz SC-1190X). En positiv kontroll for brikken ble laget med kromatin av C2C12 myotubes som hadde blitt behandlet i 4 timer med 10 ng /ml mus TNFa. Vi har tidligere vist at denne behandlingen sterkt induserte en NF-kB luciferase reporter og øket IP-10 mRNA-nivåer, som begge er avhengige av p65 [27]. For testen forsøket vi brukte metoder som er beskrevet i vårt tidligere arbeid [21]. Kort, formaldehyd fast kromatin fra ubehandlede og TNFa-behandlet C2C12 myotubes immunoutfelt med p65 antistoff, p50 antistoff, eller ingen antistoff og Protein G-fangede utfellinger ble behandlet for å produsere DNA som ble testet med PCR ved hjelp av primere som flankerer to påfølgende NF -κB nettsteder i IP-10-genet. I tillegg vurderte vi også p65 og p50 binding til IP-10 promoter med kromatin fra kontroll- og C26 muskler.
ChIP-PCR for Fbxo6
ChIP-PCR ble utført fra muskelvev fast, homogenisert og sonikert som for spon seq, med det unntak at p65 antistoff ble koblet til protein G magnetiske kuler etter pre-inkubering (over natten ved 4 ° C) før inkubering med kromatin, og DNA-produktene ble anvendt som templat for PCR med primere flankerer målet bindingssetet av Fbxo6 genet, som bestemmes av chip seq. Målstedet fra brikken-seq var i første intron av Fbxo6 genet, 2 kb nedstrøms for transkripsjon start stedet. Sekvensene til primerne anvendt for PCR var agctcgttgatgtggaccat (venstre primer) og cctcctgctttaggctcctt (høyre primer) og ga et PCR-produkt på 302 bp.
statistikker og
En ANOVA eller en
t
-test ble anvendt for analyse, avhengig av antallet av grupper som sammenlignes. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SE, og signifikans ble etablert på
P
0,05. Statistikk for microarray data er beskrevet i microarray delen.
Resultater
Karakterisering av C26 tumorbærende mus
Karakterisering av denne svulsten modellen i vår lab involvert inokulering av CDF1 mus med C26 tumorceller i PBS /matrigel (n = 164) eller med PBS /matrigel bare (n = 142). Musene ble avlivet ved 12, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, og 26 dager etter tumorcelle-inokulering. Ved alvorlig cachexia (dager 23-26 etter inokulasjon) tumor-bærende mus tapte 22,1% ± 0,8% av opprinnelig kroppsvekt, mens de ikke-tumor kontroller tjente 12,3% ± 0,7% av opprinnelig kroppsvekt (fig S2A). Som tumormasse økt tibialis anterior (TA) muskelmasse redusert (Tall S2B). TA muskelmasse av alvorlig cachectic mus var 40,4 ± 0,3 mg sammenlignet med 51,1 ± 0,3 mg for alderstilpassede kontroll mus. Tumorbærende mus i alvorlig kakeksi hadde 214 ± 8,7 mg epididymal fettpute masse mens kontrollmusene hadde 465 ± 10 mg (figur S2C). Milten massen av tumorbærende mus var 205 ± 4,6 mg, sammenlignet med 75,5 ± 0,7 mg i ikke-tumorbærende mus (figur S2D). Tumormassen økt som en funksjon av tid etter vaksinasjon (figur S2E).
Effekt av dominant negativ NF-kB signaliserer proteiner på muskel fiber atrofi i C26 tumorbærende mus
Det gjennomsnittlige fiber
